DNA的损伤与修复.ppt

第六章 DNA的损伤与修复ThedamageandrepairofDNA DNA双螺旋结构发生的任何改变 主要分为两种 单个碱基的改变双螺旋结构的异常扭曲 DNA损伤的概念 DNA存储着生物体赖以生存和繁衍的遗传信息 维护DNA分子的完整性对细胞至关紧要 修复DNA损伤的能力是生物能保持遗传稳定性所在 DNA分子的变化并不是全部都能被修复成原样的 因此生物才会有变异 有进化 DNA损伤修复的重要性 5 1DNA损伤的原因 5 1 1DNA分子自发性损伤 1 DNA复制中的错误 碱基配对的错误概率约为10 1 10 2 在DNA聚合酶的校对作用下 错配概率降到10 5 10 6 再经过DNA结合蛋白和其他因素作用下 错配率仍在10 10 1 碱基的异构互变 DNA每种碱基有几种形式 称互变异构体 异构体中原子的位置及原子之间的键有所不同 碱基各自的异构体间可以自发发生变化 烯醇式与酮基间互变 A CT G上述配对发生在DNA复制时 会造成子代DNA序列与亲代DNA不同的错误损伤 同型异构体转换 O OH 同型异构体转换 NH2 NH 异构互变造成的复制损伤 2 碱基的脱氨基作用 碱基的环外氨基自发脱落 C变为U A变为次黄嘌呤 H G变为黄嘌呤 X 复制时 U与A配对 H和X都与C配对会导致子代DNA序列的错误变化 3 脱嘌呤与脱嘧啶 碱基丢失 自发水解使嘌呤和嘧啶从DNA链的核糖磷酸骨架上脱落 哺乳类动物细胞 在30 C下 20h内DNA链自发脱落嘌呤约1000个 嘧啶约500个 4 活性氧引起的碱基修饰与链断裂 细胞呼吸的副产物O2 H2O2造成DNA损伤 产生一些碱基修饰物 胸腺嘧啶乙二醇 羟甲基尿嘧啶等 还可引起DNA单链断裂等损伤 这些损失的积累可导致老化 2 物理因素引起的DNA损伤 1 紫外线 UV 引起的DNA损伤 DNA受到大剂量紫外线 260nm 照射时 同一条链上相邻的嘧啶以共价键连成二聚体 TT CC CT之间都可形成二聚体 复制时 此处产生空耗过程 DNA不能复制 细胞不能分裂 导致凋亡 紫外线引起的DNA损伤 最易形成胸腺嘧啶二聚体 TT 2 电辐射引起的DNA损伤 碱基变化细胞中的水经辐射解离后产生大量OH 自由基 使DNA链上的碱基氧化修饰 形成过氧化物的 导致碱基环的破坏和脱落等 脱氧核糖变化 脱氧核糖上的每个碳原子和羟基上的氢都能与OH 反应 导致脱氧核糖分解 最后会引起DNA链断裂 DNA链断裂 脱氧核糖破坏或磷酸二酯键断开而导致DNA链断裂 一条链断裂称单链断裂 singlestrandbroken DNA双链在同一处或相近处断裂称为双链断裂 doublestrandbroken 胶联 binding 同一条DNA链上或两条DNA链上的碱基间以共价键结合 DNA与蛋白质之间也以共价键相连 组蛋白 染色质中的非组蛋白 调控蛋白 与复制和转录有关的酶都会与DNA以共价键连接 胶联是细胞受电离辐射后在显微镜下看到的染色体畸变的分子基础 会影响细胞的功能和DNA复制 辐射引起DNA分子结构的多种变化 2 烷基剂对DNA的损伤 1 碱基类似物 修饰剂对DNA的损伤 3 嵌合剂对DNA的损伤 3 化学因素引起的DNA损伤 1 碱基类似物对DNA的损伤某些化学物质和正常的碱基在结构上类似 有时会替代正常碱基而掺入DNA分子 一旦这些碱基类似物进人DNA后 由于它们的配对能力不同于正常碱基 便引起DNA复制过程中其对应位置上插入不正确碱基 例如5 溴尿嘧啶 BU 和5 溴脱氧尿嘧啶 BrdU 是T结构类似物 细菌在含BU的培养基中培养时 部分DNA中的T被BU取代 BU有两种互变异构体 一种是酮式结构 第6位上有一个酮基 它可以代替T而掺入DNA 并与A配对 当BU发生互变异构成为烯醇式 第6位上是一个羟基 后 就容易和G配对 通常以酮式存在 有时也以烯醇式存在 当BU先以酮式掺入DNA 继而又变成烯醇式时 进一步复制使DNA中A T对变成G C对 同样道理也引起G C向A T的转换 BU可以使细菌的突变率提高近万倍 除BU外 还有5 溴脱氧尿苷 5 氟尿嘧啶 5 氯尿嘧啶及它们的脱氧核苷 另一种被广泛应用的碱基类似物是2 氨基嘌呤 2 AP 是一种腺嘌呤A类似物 可和胸腺嘧啶T配对 可再和胞嘧啶C配对 产生A T G C的转换 或2 AP以和胞嘧啶C配对形式进入DNA后再和胸腺嘧啶T配对后产生G C A T的转换 2 烷化剂引起的DNA损伤 特异性错配 某些诱变剂不掺入DNA 而通过改变碱基的结构从而引起特异性错配 如烷化剂 是一类亲电子的化合物 具有一个或多个活性烷基 它们的诱变作用是使DNA中的碱基烷化 活性烷基不稳定 能转移到其他分子的电子密度较高的位置上 并置换其中的氢原子 使其成为不稳定的物质 烷化剂的种类很多 常见的有甲磺酸乙酯 EMS 亚硝基胍 NG 和芥子气等 EMS能使鸟嘌呤的N位置上有乙基 成为7一乙基鸟嘌呤 与胸腺嘧啶配对 故能使G C转换成A T 烷化剂的另一作用是脱嘌呤 例如烷基在鸟嘌呤N位上活化糖苷键引起断裂 使嘌呤从DNA链上脱掉 产生缺口 复制时 与缺口对应的位点上可能配上任一碱基 从而引起转换或颠换 而且去嘌呤后的DNA容易发生断裂 引起缺失或其他突变 3 嵌合剂的致突变作用 嵌合染料是另一类重要的DNA修饰剂 包括丫啶橙 acridineorange 原黄素 proflavin 叮黄素 acriflavine 等染料 这些试剂为平面分子 其分子大小与碱基对大小差不多 可以嵌入到DNA双链碱基对之间 在嵌入位置上引起单个碱基对的插入或缺失突变 嵌合染料也能嵌入单链DNA的碱基之间 这些突变都会引起阅读框的改变 造成移码突变 概念 由各种诱变剂诱发的DNA的突变 每一种诱变剂有其对应的特异性 如对G C A T转换 和对特定的突变位点的偏好 例如 甲磺酸乙酯 EMS 和紫外线 UV 偏好 G C A T转换 黄曲霉素B1 AFB1 则偏好于C G A T颠换 诱变机制 诱变剂通过3种机制诱发突变 取代DNA中的一个碱基 改变一个碱基使之发生错配 破坏一个碱基使之在正常情况下无法配对 4 诱发突变 诱发突变与人类的癌症黄曲霉素 AFB 引起肝癌 紫外线 UV 照射会导致皮肤癌 肿瘤抑制基因是一种编码抑制肿瘤形成的蛋白质基因 如果发生突变则会致癌 对南非和东亚肝癌病人的P53基因的分析发现 AFB特异性诱导G T颠换 引起P53发生突变 而在同一地区的肺癌 肠癌和乳腺癌的病人中未发现此现象 黄曲霉素B1 aflatoxinB1 AFB1 一种很强的致癌剂 在鸟嘌呤N 7位置上形成一加成复合物后产生无嘌呤位点 修复要求SOS系统参与 SOS越过无嘌呤位点并在这些位点对应处选择性插入腺嘌呤 使鸟嘌呤残基脱嘌呤的试剂偏向于产生G CT A颠换 现代生活环境使人可能接触各种各样药品 化妆品 食物防腐剂 杀虫剂 工业用试剂 污染物等 其中很多化合物已被证明具有致癌性质 研究表明在175种已知的致癌剂中 有157种是诱变剂 这些物质是通过诱导体细胞突变而致癌的 例如食物防腐剂AF 2 食物熏蒸剂二溴乙烯 抗血吸虫药物 多种染发添加剂以及工业化合物氯乙烯等都具致癌性 因而要靠科学治理环境 保护环境就是保护人类自身 5 1 2DNA损伤的后果 导致DNA分子结构变化 亦即发生突变 生物体在表型上突变 1 突变类型 1 点突变 pointmutation DNA单一碱基的变异 转换 transition 嘌呤与嘌呤 嘧啶与嘧啶之间替换 颠换 transvertion 嘌呤与嘧啶之间的替代 野生型等位基因 将自然界中普遍出现或指定实验用的某一品系的性状作为 野生型 或 正常 的性状 与这种性状相关的等位基因称为野生型等位基因 突变型等位基因 任何不同于野生型等位基因的相同座位的基因称为突变型等位基因 正向突变 从野生型等位基因变为突变型等位基因 恢复突变 从突变型等位基因变为野生型等位基因 突变的多方向性和复等位基因一个基因内有很多突变位点 所以 一个基因的突变也有多方向性 从而导致一个基因可以有两个以上的等位形式 复等位基因 2 缺失 deletion 插入 insertion DNA链上一个或一段核苷酸的消失或加入 移码突变 frame shiftmutation 例如在E coli的lacl基因中发现一种4个碱基序列 CTGG 在野生型中连续重复了3次 J Miller等人研究了这个基因突变热点 hotSpots 产生的原因 发现某些热点是由重复序列引起的 所谓热点即一个基因中比其他位点更容易发生突变的位点 由于插入或缺失突变引起DNA的阅读框 ORF 发生改变 从而产生不同蛋白质的过程 3 倒位 inversion 或转位 translocation DNA重组使其中一段核苷酸倒置 或从一处迁移到另一处 4 双链断裂 2 突变后果 1 致死性 突变发生在对生命至关重要的基因上 可导致个体或细胞的死亡 致死突变 严重影响生物体生活力 导致个体死亡的突变 可分为显性致死突变 杂合态即可致死 和隐性致死突变 纯合态才致死 2 基因功能的改变 突变是某些疾病的发病基础包括遗传病 肿瘤及有遗传倾向的病 有些已知其遗传缺陷所在 但大多数尚在研究中 突变影响生物的代谢过程 导致一个特定生化功能的改变或丧失 如微生物的营养缺陷型 突变导致生物体外观上可见的形态结构的改变 例如果蝇的红眼 白眼突变 例 UVB所致的基因突变UVB 290 320nm 由于修复系统的缺陷或偶发的错误修复 则会导致某些基因突变 使得角质形成细胞的细胞周期的调控出现异常 进一步发生克隆性增生和永生化生长而导致皮肤癌的发生 管理基因 caretakergenes 执行DNA的损伤修复 维持基因组的完整性 如着色性干皮病的修复基因XPA XPF 看门基因 gatekeepergenes 控制细胞信号传导 调控细胞的增殖 分化和凋亡 如p53 patched基因和ras等 皮肤癌的发生与看门基因突变关系密切 着色性干皮病 xerodermapigmentosis XP 是一种切除修复有缺陷的遗传性疾病 在研究其发病机制时 发现一些相关的基因 称为XPA XPB XPC等 这些基因的表达产物起辨认和切除损伤DNA作用的 XP病人是由于XP基因有缺陷 不能修复紫外线照射引起的DNA损伤 因此易发生皮肤癌 p53当UVB损伤DNA造成p53突变后 突变型p53因失去了对细胞周期的正常调控 使得损伤的DNA继续复制 从而提高了染色体畸变的偶发率和遗传的不稳定性 角质形成细胞极易发生克隆增生和恶性转化 有害物质富集例 DDT在水环境中存在量仅为3 10 6ppm mg L 的时候 当它进入浮游动物体内就被富集为0 04ppm 浮游动物被小鱼吃了 小鱼体内DDT富集量就变为0 5ppm 当小鱼被大鱼吃了 大鱼体内DDT富集量就升高为2ppm 当大鱼被鹰吃了 鹰体内DDT富集量就变为25ppm DDT浓度整整富集了1000万倍 如果人吃了鱼或鹰 那么人体内DDT富集量更是高得可怕 会引起突变 低剂量 长期暴露的蓄积作用 3 突变导致基因型改变 这种突变只有基因型的改变 而没有可察觉的表型改变 多态性 polymorphism 是用来描述个体之间的基因型差别现象 利用DNA多态性分析技术 可识别个体差异和种 株间差异 控制一些次要性状基因即使发生突变 也不会影响生物的正常生理活动 仍能保持其正常的生活力和繁殖力 为自然选择保留下来 突变是进化 分化的分子基础 进化过程是突变的不断发生所造成的 没有突变就没有今天的五彩缤纷的世界 遗传学家认为 没有突变就不会有遗传学 大量的突变都属于由遗传过程自然发生的 叫自发突变或自然突变 spontaneousmutation 5 2DNA突变修复机制 1 尿嘧啶糖基酶系统 复制错误的修复 现象 U和A在复制中配对C自发脱氨基氧化而生成U 修复机制 尿嘧啶 N 糖基酶系统 参与的酶 尿嘧啶 N 糖基酶AP内切核酸酶 APendonucleases DNA聚合酶IIDNA连接酶 脱嘌呤 嘧啶位点 AP位点 修复机制 尿嘧啶 N 糖基酶系统 2 错配修复系统 mismatchrepairsystem 现象 复制中的错配 A的甲基化是错配修复系统的识别标记GA TC 沿着新生DNA链 有一个甲基化梯度 靠近复制叉程度最小 亲本链甲基化程度高且均一 修复机制 错配修复系统 参与的酶 错配矫正酶DNA聚合酶DNA连接酶 修复机制 错配修复系统 修复机制 错配修复系统 DNA的半甲基化 光修复 photoreactivation 主要对胸腺嘧啶二聚体而言 修复机制 在可见光 300 600nm 活化之下 由光复活酶 photoreactivatingenzyme PR 催化胸腺嘧啶二聚体分解为单体 参与的酶 光复活酶 PR 光复活酶修复 波长400nm可见光激活 光复活是针对紫外线引起DNA损伤而形成的胸腺嘧啶二聚体 在损伤部位进行修复的修复途径 光复活作用在可见光的活化下 由光复活酶 又称光解酶催化胸腺嘧啶二聚体分解成为单体 PR酶先与DNA链上的胸腺嘧啶二聚体结合成复合物 复合物以某种方式吸收可见光 并利用光能切断二聚体之间的两个C C键 使胸腺嘧啶二聚体变为两个单体 恢复正常 而后PR酶就从DNA上解离下来 过去认为 光复活酶存在于细菌和低等真核生物体内 研究发现在鸟类和有袋类中也有存在 B M Sutherland 1974 报道 在人类白细胞中发现光复活酶 随后发现存在于人类的成纤维细胞和淋巴细胞中 说明这种酶在生物界分布广泛 这一修复机制在哺乳动物中也起重要作用 在E coli中 光复活酶 471aa 是由Phr基因编码 酶在暗处不能起作用 还需要其他的酶来修复UV损伤 在植物和果蝇中也发现能逆转6 4光生成物的光解酶 光复活的修复功能虽然普遍存在 但主要是原核生物中的一种修复方式 4 切除修复 excisionrepair 切 补 切 封 一种修复内切酶识别胸腺嘧啶二聚体 并在二聚体前的糖 磷酸骨架上作一切口 PolII在3 OH末端聚合一条新的DNA链 并同时置换掉大约20个核苷酸的DNA片段 DNA连接酶封合新合成的DNA片段和原有DNA链间的切割 修复机制 切 补 切 封 切除修复 excisionrepair 也称核苷酸外切修复 此系统在几种酶的协同作用下 先在损伤的任一端打开磷酸二酯键 然后外切掉一段寡核苷酸 留下的缺口由修复性合成来填补 再由连接酶连接 由于这些酶的作用不需可见光激活 也叫暗修复 切除修复不仅能消除由紫外线引起的损伤 也能消除由电离辐射和化学诱变剂引起的其他损伤 切除修复一般发生在下一轮DNA复制之前 又称复制前复制 5 重组修复 recombinationrepair 这是一种越过损伤部位进行修复的途径 重组修复 recombinationalrepair 是对尚未修复的损伤DNA先复制再修复 又称复制后修复 以胸腺嘧啶二聚体为例 含有二聚体的DNA仍可进行复制 但复制到二聚体时要暂停一下 然后越过此处障碍 在二聚体的后面又以未知的机制开始复制 这种起始复制可能不需引发 这样在合成的子链上留下一个大缺口 而其互补链则复制成完整的双链 然后由完整双链中的母链与带缺口的子链发生重组 重组修复 重组修复中最重要的一步是重组 大肠杆菌中 当DNA受到损伤 形成嘧啶二聚体时 能诱导产生一种重组蛋白 重组修复中的重组是在这种蛋白的参与下进行的 它的精确性较低 所以重组修复易产生差错 从而引起突变 所以又叫突变型修复 前面所说的光复活修复和切除修复则被认为是无误差的修复过程 6 SOS修复 应急反应 特点 一种旁路系统 允许新生DNA链越过胸腺嘧啶二聚体而生长 保真度降低 好死不如赖活着 SOS系统只在细胞受到严重损伤或复制系统受到抑制时才出现 参与的酶 recA酶LexA酶 这个系统是在DNA分子受到大范围的损伤情况下防止细胞死亡而诱导出的一种应急措施 是使细胞通过一定水平的变异来换取最后幸存手段 借用国际通用的紧急呼救信号 saveoursouls SOS 命名 表示细胞受到危急状态时的修复方式 SOS修复是指DNA受到严重损伤 细胞处于危急状态时所诱导的一种DNA修复方式 修复结果只是能维持基因组的完整性 提高细胞的生成率 但留下的错误较多 故又称为错误倾向修复 errorpronerepair 细胞有较高的突变率 1 SOS反应能诱导多种蛋白质的合成RecA重组蛋白 严重的DNA损伤产生大量单链缺口 激活RecA蛋白的水解酶活性 促进LexA阻遏蛋白的裂解和SOS反应的诱导 LexA阻遏蛋白 调节所有SOS基因的转录 DNA聚合酶 受SOS反应的诱导 能进行跨损伤复制 2 SOS修复是易错修复 导致突变增加 SOS反应的起始 是通过RecA的活化而引起 诱导信号 可能由DNA释放出的小分子组成的 或者是DNA本身某些结构变化 LexA是一种小分子蛋白 22KDa 具有蛋白酶活性 是很多操纵子的阻遏物 RecA的激活导致LexA的基因产物的剪切 LexA被RecA激活后又可导致LexA自我催化引起自身的裂解 这样LexA的阻遏功能失去了活性 并且同时诱导了它所结合的操纵子 和SOS反应有关的基因 包括RecA lexA UvrA UvrB umuC和himA RecA也触发细胞中其它靶物质的剪切 包括各种原噬菌体的阻遏蛋白 修复过程 当DNA两条链的损伤邻近时 损伤不能被切除修复或重组修复 这时在核酸内切酶 外切酶的作用下造成损伤处的DNA链空缺 再由损伤诱导产生的一整套的特殊DNA聚合酶和SOS修复酶类 催化空缺部位DNA的合成 补上去的核苷酸几乎是随机的 但仍然保持了DNA双链的完整性 使细胞得以生存 图SOS修复 由于SOS修复是一种错误修复 SOS系统可造成很高的突变率 在哺乳动物中也有类似机制 可能与癌变有关 因此受到高度重视 对于其修复的机制还有许多问题有待于进一步研究 5 3限制与修饰 restrictionandmodification 50年代初发现细菌能将外来DNA片段在某些专一位点上切断 从而保证其不为外来噬菌体所感染 而其自身的染色体DNA由于被一种特殊的酶所修饰而得以保护 这种现象叫做限制 修饰 实验 从3种不同菌株繁殖出来的噬菌体后代 接种到同样菌株 接种率达100 如接种到不同菌株上 情况便不同 k在B株上接种效率只有10 4 B在k株上也只有10 4 如将生存下来的噬菌体接种到第一轮同样的菌株中 如 k B B 则接种效率为100 本世纪50年代初 以Arber等人对 噬菌体在大肠杆菌不同菌株上的平板培养效应的研究为基础 发现了原核生物体内存在着寄生控制的限制 restriction 和修饰 modification 系统 restrictionandmodification 推论 含有一种限制修复系统 限制酶能够将外来DNA切断 修饰酶 甲基化酶 通过将自身腺嘌呤甲基化 或将胞嘧啶甲基化对自身DNA进行修饰 因此不会将自身DNA降解掉 当外来噬菌体进入大肠杆菌后 绝大部分被限制酶所降解 极少数被甲基化酶所修饰而幸存下来 修饰后的噬菌体再进入大肠杆菌 不会被降解 细菌为对付外来DNA和保护自己DNA而演化来的 1968年Smith等人从流感嗜血杆菌株中分离出两个类内切酶 HindII和HindIII 为基因工程技术的诞生奠定了基础 自己DNA 限制模式相同的DNA 包括同株系的不同个体DNA 寄生于其中的质粒和噬菌体 居民DNA residentDNA 同一个细胞内的不同类型的DNA 包括细胞DNA 质粒DNA 噬菌体DNA等 三类限制性内切酶 按照亚基组成 酶切位置 识别位点 辅助因子等因素划分 I类限制性内切酶的特点 1 I类限制性内切酶是异源多聚体 包含三个亚基R M和S 其功能分别为限制性内切酶 甲基化酶和DNA特异位点识别 2 I类限制性内切酶与DNA结合依赖M亚基与辅助因子S 腺苷甲硫氨酸 SAM 的相互作用 3 I类限制性内切酶与DNA分子结合后 根据该位点的甲基化状态发挥相应的酶活性 或修饰或切割 切割位点与识别位点相隔1 5kb 切割位点的序列特异性不严格 4 I类限制性内切酶的种类较少 研究较多的有大肠杆菌的EcoK和EcoB II类限制性内切酶特点 II类限制性内切酶由H O Smith等1970年首先在流感嗜血杆菌Rd型菌株中发现 II类限制性内切酶和甲基化酶是独立的的两个酶 目前已有400多种II类限制性内切酶被分离 它是分子量较小的单体蛋白 识别和切割双链DNA分子时仅需要Mg2 识别和切割位点在同一位置 且识别序列有严格的特异性 II类限制性内切酶 同位酶 isoschizomers 识别位点的序列相同 切点不一定相同的酶类 同尾酶 isocandamers 作用后产生的DNA粘性末端相同 但识别位点的序列埠不一定相同的酶类 III类限制性内切酶的特点 III类限制性内切酶由R亚基和MS亚基组成 其中MS亚基具有位点识别和甲基化修饰双重活性 该类酶与DNA识别位点的结合严格依赖ATP 修饰作用和切割作用取决于两个亚基之间的竞争 修饰作用在识别位点内进行 切割序列位于识别位点一侧若干碱基对处 无序列特异性 核酸内切限制酶的类型及其主要特性 本章重点内容 DNA受损类型DNA突变类型胸腺嘧啶二聚体突变修复的几种机制限制与修饰