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提取细胞RNA的步骤:1)六孔板每孔细胞中加入1ml Trizol,冰上放置5min,枪头吹打。2)将各孔裂解液吸到1.5 ml EP管中,加入氯仿0.2ml/管,用力振摇15s。1530下孵育2-3min,离心(4,12,000g,15min)。3)离心后液体分为三层(上层无色水样层为RNA,中层白色为DNA和底层红色为蛋白质),小心吸取上层无色液体移入一新的EP管中。4)加入等体积异丙醇,0.40.5ml,混匀,15-30下孵育1030min,离心(4,12,000g,10min)。其中如果加入等体积异丙醇后,置于试管架上用PE手套密封后,放于4冰箱中,沉淀30min效果更好。5)去上清,沉淀加入75乙醇1ml,漩涡振荡30s,离心(4,7,500g,5min)。6)小心去上清,管内沉淀在超净台中鼓风静置干燥3-5min。最好是用枪头吸取上清,尽量除去。7)加入20ul DEPC水溶解,分装5ul/管,-70冰箱保存。8)细胞总RNA的鉴定:0.9-1.2琼脂糖电泳鉴定细胞总RNA,观察出现条带及各条带亮度。紫外分光光度计测定:分别测定细胞总RNA在260nm和280nm处的光密度值(OD),并计算RNA的含量和纯度。1、实验目的提取人体细胞的总RNA和mRNA。2、本实验所需试剂1)、CNE-2细胞及培养细胞的一系列条件,2)、PBS缓冲液, TRIZOL试剂,3)、DEPC处理过的水、大、中、小Tip及1.5 ml EP管,4)、新的氯仿、异丙醇和乙醇,5)、mRNA分离试剂盒:Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022, QIAGEN。6)、新配的电泳缓冲液,专跑RNA的琼脂糖(Agarose)。3、实验流程3.1 细胞总RNA的提取1)、6孔板细胞(CNE-2)汇合度为90-100%时,取出无菌室,去其上清,用PBS洗两次后,每孔加TRIZOL试剂(Gibco公司) 1 ml,摇匀,无菌罩内消化3-5分钟(观察:液体变粘稠,细胞脱壁)。2)、将各孔内消化好的细胞裂解液吸到一DEPC处理过的1.5 ml EP管中,加新开的氯仿0.2 ml,轻摇15秒。3)、室温静置2-3分钟后,12000 rpm,15 min,4,离心。然后取上清无色水相(约0.6 ml)到 EP管(DEPC处理过),加0.5 ml新开的异丙醇,室温下静置10分钟。4)、12000 rpm,10分钟,4,离心。观察总RNA在管底的白色沉淀,弃去上清(小心别丢了沉淀),75%乙醇1.0 ml洗涤(用DEPC水新配制)后,7500 rpm,5 min,4离心。5)、去上清,点离,用小Tip吸干液体。气干沉淀5-10分钟, DEPC处理水20-30 ul加入,中枪打匀,55-60水浴10分钟溶解总RNA,测OD值。6)、电泳。3.2 从总RNA中分离mRNA(Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022, QIAGEN)1)、取上述提取的总RNA若干(少于0.25 mg)到一个新的无RNase 的EP管中,用无RNase的水定容到250 ul。2)、加入Buffer OBB 250 ul, Oligotex Suspension 15 ul。用Tip打匀或用手弹匀。3)、70水浴,3分钟(裂解RNA的二级结构)。4)、20-30条件下,静置10分钟(让Oligotex与mRNA结合)。5)、高速离心2分钟,小心吸走上清(该上清要保留),留下约50 ul的上清在原管里。6)、用Buffer OW2 400 ul重悬含Oligotex/mRNA复合物的沉淀,然后将这些加到套有1.5 ml EP管的SPIN柱子上,高速离心1分钟。7)、将SPIN柱子移到一个新的EP管上,加Buffer OW2 400 ul到柱子,高速离心1分钟,丢掉滤过液。8)、将SPIN柱子移到一个新的EP管上,加20-100 ul热的(70)Buffer OEB到柱子上,用Tip来回吸打3-4次,高速离心1分钟。9)、为保证最大的 mRNA产量,可再次重复第8步。10)、电泳。4、mRNA的应用:RT-PCR, Northern杂交,cDNA文库构建, mRNA末端快速扩增(RACE),差异表达(DDRT-PCR),引物延伸反应(Primer Extension),体外转录(In Vitro RNA Transcription), RNA标记(RNA labeling),RNA酶保护试验(RNase and S1 Nuclease Protection Assay),RNA微注射(RNA Microinjection)
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