提取细胞RNA的步骤.doc

提取细胞RNA的步骤：1)六孔板每孔细胞中加入1ml Trizol，冰上放置5min，枪头吹打。2)将各孔裂解液吸到1.5 ml EP管中，加入氯仿0.2ml/管，用力振摇15s。1530下孵育2-3min，离心（4，12，000g，15min）。3)离心后液体分为三层（上层无色水样层为RNA，中层白色为DNA和底层红色为蛋白质），小心吸取上层无色液体移入一新的EP管中。4)加入等体积异丙醇，0.40.5ml，混匀，15-30下孵育1030min，离心（4，12，000g，10min）。其中如果加入等体积异丙醇后，置于试管架上用PE手套密封后，放于4冰箱中，沉淀30min效果更好。5)去上清，沉淀加入75乙醇1ml，漩涡振荡30s，离心（4，7，500g，5min）。6)小心去上清，管内沉淀在超净台中鼓风静置干燥3-5min。最好是用枪头吸取上清，尽量除去。7)加入20ul DEPC水溶解，分装5ul/管，-70冰箱保存。8)细胞总RNA的鉴定：0.9-1.2琼脂糖电泳鉴定细胞总RNA，观察出现条带及各条带亮度。紫外分光光度计测定：分别测定细胞总RNA在260nm和280nm处的光密度值(OD),并计算RNA的含量和纯度。1、实验目的提取人体细胞的总RNA和mRNA。2、本实验所需试剂1）、CNE-2细胞及培养细胞的一系列条件，2）、PBS缓冲液， TRIZOL试剂，3）、DEPC处理过的水、大、中、小Tip及1.5 ml EP管,4）、新的氯仿、异丙醇和乙醇，5）、mRNA分离试剂盒：Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022, QIAGEN。6）、新配的电泳缓冲液，专跑RNA的琼脂糖（Agarose）。3、实验流程3.1 细胞总RNA的提取1）、6孔板细胞（CNE-2）汇合度为90-100%时，取出无菌室，去其上清，用PBS洗两次后，每孔加TRIZOL试剂（Gibco公司） 1 ml，摇匀，无菌罩内消化3-5分钟（观察：液体变粘稠，细胞脱壁）。2）、将各孔内消化好的细胞裂解液吸到一DEPC处理过的1.5 ml EP管中，加新开的氯仿0.2 ml，轻摇15秒。3）、室温静置2-3分钟后，12000 rpm，15 min，4，离心。然后取上清无色水相（约0.6 ml）到 EP管（DEPC处理过），加0.5 ml新开的异丙醇，室温下静置10分钟。4）、12000 rpm，10分钟，4，离心。观察总RNA在管底的白色沉淀，弃去上清（小心别丢了沉淀），75%乙醇1.0 ml洗涤（用DEPC水新配制）后，7500 rpm，5 min，4离心。5）、去上清，点离，用小Tip吸干液体。气干沉淀5-10分钟， DEPC处理水20-30 ul加入，中枪打匀，55-60水浴10分钟溶解总RNA，测OD值。6）、电泳。3.2 从总RNA中分离mRNA（Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022, QIAGEN）1）、取上述提取的总RNA若干（少于0.25 mg）到一个新的无RNase 的EP管中，用无RNase的水定容到250 ul。2）、加入Buffer OBB 250 ul, Oligotex Suspension 15 ul。用Tip打匀或用手弹匀。3）、70水浴，3分钟（裂解RNA的二级结构）。4）、20-30条件下，静置10分钟（让Oligotex与mRNA结合）。5）、高速离心2分钟，小心吸走上清（该上清要保留），留下约50 ul的上清在原管里。6）、用Buffer OW2 400 ul重悬含Oligotex/mRNA复合物的沉淀，然后将这些加到套有1.5 ml EP管的SPIN柱子上，高速离心1分钟。7）、将SPIN柱子移到一个新的EP管上，加Buffer OW2 400 ul到柱子，高速离心1分钟，丢掉滤过液。8）、将SPIN柱子移到一个新的EP管上，加20-100 ul热的（70）Buffer OEB到柱子上，用Tip来回吸打3-4次，高速离心1分钟。9）、为保证最大的 mRNA产量，可再次重复第8步。10）、电泳。4、mRNA的应用：RT-PCR, Northern杂交，cDNA文库构建, mRNA末端快速扩增(RACE)，差异表达(DDRT-PCR)，引物延伸反应(Primer Extension)，体外转录(In Vitro RNA Transcription), RNA标记(RNA labeling)，RNA酶保护试验(RNase and S1 Nuclease Protection Assay)，RNA微注射(RNA Microinjection)