《水产品中四环素类残留的快速测定-胶体金免疫层析法》编制说明

陕 西 省 地 方 标 准ICs 67.050B 50 DB61发 布水产品中四环素类残留的快速测定-胶体金免疫层析法Immunochromatography rapid test card for Tetracycline in aquatic products（征求意见稿）一、 任务来源、起草单位、协作单位、起草人任务来源：陕西省质量技术监督局任务编号：SDBXM 130-2018起草单位：陕西省水产研究所、农业农村部渔业环境及水产品质量监督检验测试中心（西安） 、无锡中德伯尔生物技术有限公司、国家水产品质量监督检验中心、西安市食品药品监督检验所。起草人：杨元昊，李毅，杨娟宁，周丽，李峰钢。二、 标准制定的背景及意义四环素类抗生素 (tetracyclines) 是一类具有菲烷结构的广谱抗生素，因化学结构中含有四个苯环而命名，所有四环素类抗生素的化学结构中都含有四个融合环组成的菲烷母核结构，即氢化并四苯环的核心结构。四环素类包括天然四环素类和半合成四环素类，天然四环素类是从链丝菌属培养液中提取，如金霉素 (chlortetracycline，也称为氯四环素) 、土霉素 (oxytetracycline，又称为地霉素或氧四环素 )、四环素(tetracycline)和地美环素 (demeclocycline，也称为去甲金霉素 )。由于天然四环素类结构不稳定，抗菌活性不强，因此对其进行结构改造得到半合成四环素类，包括多西环素 (doxycycline，也称为脱氧土霉素或强力霉素)、米诺环素 (minocycline，也称为二甲胺四环素或美满环素)和美他环素(metacycline，也称为甲烯土霉素 )等。四环素类抗生素是广谱抗生素，可作用于多数革兰氏阳性和阴性菌，如肺炎球菌、溶血性链球菌、草绿色链球菌及部分葡萄球菌、破伤风杆菌、梭状芽袍杆菌、大肠杆菌、产气杆菌、肺炎杆菌等，此外还能抑制立克次氏体、砂眼病毒及淋巴肉芽肿病毒。四环素类抗生素由于质量高效、价格低廉、抗菌谱广、毒副作用较小、口服效果较好等优点，已被大量应用于人体和兽用药中。四环素类抗生素逐渐成为世界上第二大普遍应用的抗生素，而中国已成为世界上生产、消耗四环素类抗生素最多的国家之一，同时也是四环素滥用的重灾区。动物性食品中抗生素残留会严重危害人类的健康，如产生过敏反应，降低人类对病菌的免疫能力等，因此严格监控食品中抗生素类药物的残留量成为维护人类身体健康，促进畜禽产品出口创汇的前提条件。由于农产品中农兽药残留会对人体健康和生命安全造成严重危害、对环境造成污染、对生态造成破坏，20 世纪 70 年代前后，农兽药残留问题就引起了国际特别是欧盟、美国、日本等发达国家的高度关注，开始把严格控制农兽药残留纳入日程。近几年来，国际上对农兽药残留问题日益重视，禁用限用的农兽药越来越多、残留标准不断提高，控制农兽药残留已经成为扩大农产品出口的普遍发展趋势和要求。我国目前涉及水产品中药物残留的标准主要是NY5070-2002 无公害食品水产品兽药残留限量 ，其中规定了四环素、土霉素、磺胺嘧啶等 13 种渔药残留限量，并且在NY5071-2002 无公害食品、渔用药物使用准则中规定了禁用渔药 32 种。2002年，为加强兽药残留监控工作，保证动物性食品卫生安全，根据兽药管理条例规定，中国农业部组织修订了动物性食品中兽药最高残留限量 。其中规定金霉素在所有食品动物肌肉中最高残留限量为 100 g/kg。强力霉素、土霉素和四环素在肌肉中最高残留限量为 100 g/kg，在肝脏中为 300 g/kg，肾脏中为 600 g/kg，牛奶和鸡蛋中分别为 100 g/kg、200 g/kg 。而我国渔药残留限量也对水产品中四环素类抗生素最高残留限量做出了明确的规定，要求四环素、金霉素、土霉素最高残留限量为 100 g/kg。欧盟在 食品中农兽药残留限量标准中规定四环素、土霉素、金霉素最高残留限量为在肌肉中 100 g/kg，肝脏中为 300 g/kg，肾脏中为 600 g/kg。日本肯定列表制度也对四环素类抗生素在鸡肉、鸭肉、猪肉、及肝肾脏最高残留限量做出了具体规定。中国入世后，食品工业最大的问题就是“安全壁垒” ，这将给中国的进出口和国内企业带来极大的挑战。美国食品与药品管理局 (FDA)、欧盟、日本、韩国等主要贸易国和地区公布了在进口动物源性食品中禁止使用的药物名单，提高了最高限量标准。这就要求中国加强农、畜、水产品中的农药、兽药等残留的控制和检测。同样随着人类对生存环境的倍加关注，要求对环境中各种污染物，有害或有毒物以及中毒物，滥用药物等进行更加严格的监控。国内已经被报道用于检测食品中残留四环素类药物的方法主要包括高效液相色谱法、液质联用法、薄层色谱法、微生物分析法、毛细管电泳法、免疫分析法、电化学分析法、化学发光法等。其中高效液相色谱法、高效液相串联质谱法、气相色谱法、气相色谱串联质谱法因为具有高效灵敏、准确度高、分析自动化及数据处理自动化等优点，因而被采纳作为法检方法。但其存在仪器昂贵、操作繁琐、样品处理复杂、成本高、废弃试剂易造成环境污染、需要专业分析人员、不适合现场检测等缺点，难以满足基层大批量快速筛查的需求。因此，当前迫切需要一种快速、准确、适合现场检测的四环素类抗生素残留方法。胶体金免疫层析技术自发现以来迅速发展，广泛应用于医药等多个领域，主要因为其自身所具有的独特的优势：特异性强、灵敏度高、快捷迅速、安全简便、成本低廉。国内市场已有多款四环素类药物胶体金免疫检测产品在售，但在制度层面上仍缺乏相关的。相应的，该类产品的相关标准也必须建立起来，这对于规范产品的性能指标、保障食品安全、促进农业产业发展、破解贸易技术壁垒是极为必要的。同时，该标准可以促进提升产品质量，规范检测流程，明确方法灵敏度、精密度、交叉反应率等指标，填补现有检测体系空白，对满足企业、检测机构、政府执法的需求具有十分重要的现实意义。三、 主要起草过程按照陕西省质量技术监督局关于下达 2018 年第一批地方标准制修订项目计划的通知的有关要求，项目承担单位组织专家和相关单位成立了标准编制组。标准起草小组由陕西省水产研究所杨元昊负责，主要编写人员有：杨娟宁、李毅、周丽、李锋刚。主要任务分工如下：杨元昊为项目主持人，负责项目的整体统筹工作，制定实施方案，负责项目的组织协调以及编制说明的起草。杨娟宁、李毅负责收集标准草案的意见和对意见的分析汇总处理。杨娟宁负责资料的收集和标准文本的起草。李毅负责校对和审查。标准编制组成员即时查阅国内外相关资料，在前期项目研究、文献资料分析和调研的基础上，编制组召开了多次会议，讨论并确定了开展标准编制工作的原则、程序、步骤和方法，最后形成开题报告和文本初稿，具体过程如下：1. 调查研究阶段 （2018 年 3 月 1 日-2018 年 4 月 30 日）先后在中国知网、万方等数据库和国家标准化管理委员会网站中收集相关文献、标准近百份，并进行了初步的筛选和整理。收集整理了市场上在售的四环素胶体金免疫层析检测卡的使用说明书。通过上述资料收集过程，小组成员了解了四环素检测方法、标准的主要内容和指标，为本标准的起草奠定了基础。2. 起草阶段 （2018 年 10 月 10 日-2018 年 11 月 30 日）在前期工作的基础上，标准起草小组综合各方面资料、数据，根据 GB/T1.1-2009标准化工作导则所规定的标准编写要求和格式，起草了水产品中四环素残留的快速测定- 胶体金免疫层析法地方标准，经过反复修改后，形成征求意见稿。3. 征求意见阶段 （2019 年 3 月-4 月）于 2018 年 12 月形成了标准的征求意见稿。随后向标准的使用单位、科研院校、行业和企业、业内专家等单位和个人发函广泛征求意见，共收集到 8 家单位专家的修改意见。确保了标准的科学性、实用性和可操作性，就草稿向省内专家广泛征求意见，并对反馈意见进行了整理，形成文本。四、 制定标准的原则和依据，与现行法律、法规、标准的关系本标准编制遵循“ 统一性、协调性、适用性、一致性、规范性” 的原则，尽可能与国内外通行标准接轨，注重标准的可操作性，保证标准起草工作的科学性、真实性、规范性。严格按照 GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写和 GB/T 20001.4-2015标准编写规则 第 4 部分：试验方法标准 中的要求编写。具体编制原则和依据如下：1.编制原则(1)本标准应遵循国家颁布的相关法律法规，并符合国家有关食品安全、产品质量的规章及规范性文件要求。(2)制定本标准时，应充分考虑到快检技术的应用场合、操作人员素质、检测效率要求等因素。(3)水产品品种众多、养殖方法各异、形式多样，养殖用水水质差异较大，本标准所规定的方法必须具备较强的适用性。2.编制依据(1)相关国家、行业强制性或推荐性标准；(2)国内外学术期刊所发表的论文；(3)部分试验结果；(4)其他厂家产品指标。3.与现行法律、法规、标准的关系本标准符合现行法律法规。截至目前，还并未出台以胶体金免疫层析法检测水产品中四环素类药物残留的相关标准。五、 制定标准的原则和确定标准主要内容（如技术指标、参数、公式、质量要求、试验方法、检验规则等）的依据，解决的主要问题，修订标准时应列出与原标准的主要差异和水平对比1.标准名称本标准名称暂定为水产品中四环素残留的快速测定-胶体金免疫层析法 。2.适用范围本方法规定了水产品中四环素类物质的快速检测方法。本方法适用鱼肉、虾肉等水产品中四环素、土霉素、强力霉素、金霉素的快速测定。规定了该方法的原理、试剂盒材料、仪器和设备、测定步骤、结果判定及表述、结果确证办法。3.技术指标本标准规定的方法主要指标有：检出限、假阳性率、假阴性率、特异性和灵敏度五项，其中特异性和灵敏度可分别通过假阳性率和假阴性率计算得出，故下面给出检出限、假阳性率和假阴性率三项指标的依据。（1）检出限：国内目前常用的四环素检测标准是 GB/T21317-2007动物源性食品中四环素类兽药残留量检测方法 液相色谱-质谱 /质谱法与高效液相色谱法 ，该标准规定了两种检测方法，其中对四环素、土霉素、金霉素和强力霉素的检测限均为50 g/kg。结合前期的试验数据，本标准将四环素类药物检测限规定为：四环素 80 g/kg，土霉素 100 g/kg ，强力霉素 200 g/kg，金霉素 500 g/kg。 （详细试验数据见本文第六部分“ 主要试验（或验证）情况分析 ”)。（2）假阳性率：假阳性现象出现的原因可总结为以下几点，第一是试剂盒本身质量问题，很大程度上取决于抗体的特异性。如果抗体的特异性不强会导致交叉反应的发生进而出现假阳性现象。第二是基质效应，水产品成分复杂，蛋白质、脂肪、碳水化合物、矿物质、其他小分子物质的存在都可能导致假阳性现象。第三是人为因素和测试环境因素，如试剂污染、操作不规范、对颜色判断有误差、实验室环境不达标等。对于检测为阳性的样本，可先用本标准所规定的方法复检一次，如仍呈阳性可通过 GB/T21317-2007动物源性食品中四环素类兽药残留量检测方法 液相色谱- 质谱/质谱法与高效液相色谱法复检。综合考虑各方面因素，本标准规定假阳性率5%。（3）假阴性率：假阴性现象出现的原因同样包括试剂盒质量、基质效应以及人为和测试环境因素。其他原因如震荡不充分、过净化柱速率过快导致的提取效率低；衍生化不完全同样会导致假阴性现象出现。一般在进行微量或者痕量分析时称取样品的时候,为了提高样品中药物的提取效果,需要将样品尽可能粉碎成糜状，样品颗粒的比表面积越大,提取的效果就会越好。目前使用快速检测卡进行检测时由于样品量或者仪器配置的原因,多数使用剪刀剪取一定量的样品，而没有将样品进行粉碎处理,因此不易将样品里的药物提取出来，从而导致假阴性结果的出现。其次,在对样本进行药物的提取的过程中，往往进行均质或者涡旋，均质或者涡旋的目的也是将样本进行充分粉碎或者使有机溶剂和样本颗粒进行充分而有效的接触,从而提高提取的效果,假如这一步没有进行充分而有效的处理则样本中的药物就有可能不会完全提取出来，从而导致假阴性检测结果的发生。本标准规定假阴性率5%。六、 主要试验（或验证）情况分析1.检出限测试分别取来自陕西省当地农贸市场、超市、养殖场的草鱼、青鱼、鳙鱼、鳜鱼、鲈鱼、鲤鱼、鲫鱼、鲢鱼、黑鱼、鲶鱼、鳊鱼、龙利鱼、巴沙鱼、罗非鱼、泥鳅、黄鳝、小龙虾、基围虾、南美白对虾、中国对虾共 20 种水产品。所有样本经 GB/T21317-2007动物源性食品中四环素类兽药残留量检测方法 液相色谱-质谱/ 质谱法与高效液相色谱法确证为阴性样本。向样本中分别添加四环素、土霉素、强力霉素和金霉素标准品至一定浓度，按本标准中所规定的前处理和检测方法操作。每个浓度做 5 个平行样本，验证试纸条的检出限，结果见表 1 至表 4。表 1 四环素检出限测试结果（ “+”代表阳性， “-”代表阴性）添加浓度(g/kg )样本 0 25 50 80 150 200草鱼 - - - - - - - + - - - + - + + + + + + + + + + + + + + + + +青鱼 - - - - - - + - - + - + + + - + + + + + + + + + + + + + + +鳙鱼 - - - - - + + + - - - + + + - + + + + + + + + + + + + + + +鳜鱼 - - - - - - - + - - - + - + - + + + + + + + + + + + + + + +鲈鱼 - - - - - - - - - - + - - + + + + + + + + + + + + + + + + +鲤鱼 - - - - - - - - + - + + - + - + + + + + + + + + + + + + + +鲫鱼 - - - - - + - - - - + + - - + + + + + + + + + + + + + + + +鲢鱼 - - - - - + - + - - + - + - + + + + + + + + + + + + + + + +黑鱼 - - - - - - + - - - - - + - - + + - + + + + + + + + + + + +鲶鱼 - - - - - - - - - + - + - - + + + + + + - + + + + + + + + +鳊鱼 - - - - - - - - - - - + - - + + + + + + + + + + + + + + + +龙利鱼 - - - - - - - + - + - + - - + + + - + + + + + + + + + + + +巴沙鱼 - - - - - - + - - - + + - + - + + + + + + + + + + + + + + +罗非鱼 - - - - - - + - - - + - + + + + + + + + + + + + + + + + + +泥鳅 - - - - - - + - + - - + - + + + + + + + + + + + + + + + + +黄鳝 - - - - - + - - + - - + + + - + + + + + + + + + + + + + + +小龙虾 - - - - - - + - + + + + - - + + + + + + + + + + + + + + + +基围虾 - - - - - - + + - + - + - + + + + + + + + + + + + + + + + +南美白对虾 - - - - - - - - + - - + + - - + + + + + + + + + + + + + + +中国对虾 - - - - - + - - + - + - + - + + + + + + + + + + + + + + + +在所有 20 种样本共 100 份样品中，当四环素添加浓度为 0 时，所有测试结果均为阴性；当添加浓度为 25 和 50g/kg 时，已有部分检测结果呈阳性；当添加浓度增至 80 g/kg 时，有 1 份黑鱼和 1 份龙利鱼样品结果呈阴性；添加浓度为 150 g/kg 时，有 1 份鲶鱼样品呈阴性。考虑到本方法允许一定的假阴性现象存在，因此根据上述实验结果判定胶体金免疫层析法对四环素在各种水产品的检测限为 80 g/kg。表 2 土霉素检出限测试结果（ “+”代表阳性， “-”代表阴性）添加浓度(g/kg )样本 0 50 75 100 150 200草鱼 - - - - - + - - - + + - + + - + + + + + + + + + + + + + + +青鱼 - - - - - - + + - - - + - + + + + + + + + + + + + + + + + +鳙鱼 - - - - - - - - + + + - + - - + + + + + + + + + + + + + + +鳜鱼 - - - - - - + - - - - - - + - + + + + + + + + + + + + + + +鲈鱼 - - - - - - - + + - - + + + - + + + + + + + + + + + + + + +鲤鱼 - - - - - + - - - - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +鲫鱼 - - - - - - - - - + + - + + - + + + + + + + + + + + + + + +鲢鱼 - - - - - - - - - - + - + + + + + + + + + + + + + + + + + +黑鱼 - - - - - - - - + - + - - + + + + + + + + + + + + + + + + +鲶鱼 - - - - - - - - - - - + + - + + + + + + + + + + + + + + + +鳊鱼 - - - - - - + + - - + + + + - + + + + + + + + + + + + + + +龙利鱼 - - - - - - - + - - - + + - - + + + + + + + + + + + + + + +巴沙鱼 - - - - - + - - - + + + - - + + + + + + + + + + + + + + + +罗非鱼 - - - - - - + + + - + - + + - - + + + + + + + + + + + + + +泥鳅 - - - - - - - - - - + - + - - + + + + + + + + + + + + + + +黄鳝 - - - - - - - + - - + - - + - - + + + + + + + - + + + + + +小龙虾 - - - - - - - + - - - + - + + + + + + + + + + + + + + + + +基围虾 - - - - - - + - - + - + + - - + + + + + + + + + + + + - + +南美白对虾 - - - - - + - - - + - - + - + + + + + + + + + + + + + + + +中国对虾 - - - - - - - - - + + + - - + + + + + + + + + + + + + + - +在所有 80 份样品中，当土霉素添加浓度为 0 时，所有测试结果均为阴性；当添加浓度为 50 和 75 g/kg 时，已有部分检测结果呈阳性；当添加浓度为 100 g/kg 时，有 1 份罗非鱼和 1 份黄鳝样品呈阴性；当添加浓度为 150 g/kg 时，有 1 份黄鳝样品呈阴性；当添加浓度为 200 g/kg 时，有 1 份基围虾和 1 份中国对虾样品呈阴性。根据上述实验结果判定胶体金免疫层析法对土霉素在各种水产品的检测限为 100 g/kg。表 3 强力霉素检出限测试结果（ “+”代表阳性， “-”代表阴性）添加浓度(g/kg)样本 0 100 150 200 250 300草鱼 - - - - - - - - - - + + + + - + + + + + - + + + + + + + + +青鱼 - - - - - - - - + - + - - - + + + + + + + + + - + + + + + +鳙鱼 - - - - - - + - - - + + + - - + + + + + + + + + + + + + + +鳜鱼 - - - - - - - - - - - + - + + + + + + + + + + + + + + + + +鲈鱼 - - - - - + - - - - - - + + - + + + + + + + + + + + + + + +鲤鱼 - - - - - - - + - - - - + - + + + + + + + + + + + + + + - +鲫鱼 - - - - - - - - + - + - + + + + + + + + + + + + + + + + + +鲢鱼 - - - - - - + - + - + - - + + + + + + + + + + + + + + + + +黑鱼 - - - - - - + - - - + - + + + + + + + + + + + + + + + + + +鲶鱼 - - - - - - + - - - - + - - + + + + + + + + + + + + + + + +鳊鱼 - - - - - - - + - - + - + - - - + + + + + + + + + + + + + +龙利鱼 - - - - - - - - - - + + + - - + + + + + + + + + + + + + + +巴沙鱼 - - - - - - - - - - + - - + + + + + + + + + + + + + + + + +罗非鱼 - - - - - - - - - + + + + - - + + + + + + + + + + + + + + +泥鳅 - - - - - - - - - - + - + + + + + + + + + + + + + + + + + +黄鳝 - - - - - - - - - - + - + - - + + + + + + + + + + + + + + +小龙虾 - - - - - - - + + - - + - - + + + + + + + + + + + + + + + +基围虾 - - - - - - - - - + - + - - + + + + - + + + + + + + + - + +南美白对虾 - - - - - + + - - + + - + + + + + + + + + + + + + - + + + +中国对虾 - - - - - - - - + + - + - - - + + - + + + + + + + + + + + +当强力霉素添加浓度为 0 时，所有测试结果均为阴性；当添加浓度为 100 和 150 g/kg 时，部分样品检测结果呈阳性；当添加浓度为 200 g/kg 时，有 1 份鳊鱼、1 份基围虾和 1 份中国对虾样品测试结果呈阴性；当添加浓度为 250 g/kg 时，有 1 份草鱼和 1 份青鱼样品测试结果呈阴性；当添加浓度为 300 g/kg 时，有 1 份鲤鱼、1 份基围虾和 1 份南美白对虾样品测试结果呈阴性。根据上述实验结果判定胶体金免疫层析法对强力霉素在各种水产品的检测限为 200 g/kg。表 4 金霉素检出限测试结果（ “+”代表阳性， “-”代表阴性）添加浓度(g/kg )样本 0 250 400 500 600 750草鱼 - - - - - - - - - - - - + + - + + + + + + + + + + + + + + +青鱼 - - - - - - - - - - + - + + + + + - + + + + + + + + + + + +鳙鱼 - - - - - - - - - - - + + - - + + + + + + + + + + + + + + +鳜鱼 - - - - - - - - - - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +鲈鱼 - - - - - - - - - - + - + - - + + + + + + + + + + + + + + +鲤鱼 - - - - - - - - - - - - - + + + + + + + + + + + + + + + + +鲫鱼 - - - - - - - - - - - - + - + + + + + + + + + + + + + + + +鲢鱼 - - - - - - - - - - - + - - + + + + + + + + + + + + + + + +黑鱼 - - - - - - - - - - + - - + - + + - + + + + + + + + + + + +鲶鱼 - - - - - - - - - - - - - + + + + + + + + + + + + + + + + +鳊鱼 - - - - - - - - - - + + + - + + + + + + + + + + + + + + + +龙利鱼 - - - - - - - - - - + - + - - + + + + + + + + + + + + + + +巴沙鱼 - - - - - - - - - - + + - - + + + - + + + + + + + + + + + +罗非鱼 - - - - - - - - - - - + - - + + + + + + + + + + + + + + + +泥鳅 - - - - - - - - - - - - + - + + + + + + + + + + + + + + + +黄鳝 - - - - - - - - - - + + - - - + + + + + + + + + + + + + + +小龙虾 - - - - - - - - - - + + - - - + + + - + + + + + + + + + + +基围虾 - - - - - - - - - - - + + + + + + + + + + + + + + + + + + +南美白对虾 - - - - - - - - - - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +中国对虾 - - - - - - - - - - - + + + - + + + + + + + + + + + + + + +当金霉素添加浓度为 0 和 250 g/kg 时，所有样品测试结果均呈阴性；当添加浓度为 400 g/kg 时，部分样品检测结果呈阳性；当添加浓度为 500 g/kg 时，有 1 份青鱼、1 份黑鱼、1 份巴沙鱼和 1 份小龙虾的测试结果呈阴性；当添加浓度为 600 和750 g/kg 时，所有样品均呈阳性。因此根据上述实验结果判定胶体金免疫层析法对金霉素在各种水产品的检测限为 500 g/kg。2.假阳性率测试取上述 20 种确证空白样本，按本标准中所规定的前处理和检测方法操作。每个样本做 5 个平行样本，验证试纸条的假阳性率，结果见表 5。表 5 四环素类药物假阳性率测试结果（“+”代表阳性， “-”代表阴性）样本项目草鱼 青鱼 鳙鱼 鳜鱼 鲈鱼 鲤鱼 鲫鱼四环素 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - + - -土霉素 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -强力霉素 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -金霉素 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -样本项目鲢鱼 黑鱼 鲶鱼 鳊鱼 龙利鱼 巴沙鱼 罗非鱼四环素 - - + - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -土霉素 - - - - - - - + - - - - - - - - - - - - - - - - +- - - - -强力霉素 + - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -金霉素 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -样本项目泥鳅 黄鳝 小龙虾 基围虾 南美白对虾中国对虾四环素 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -土霉素 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -强力霉素 - - - - +- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -金霉素 - - - - +- - - - - - - - - - - - - + - - -+ - - - -从检测结果可见，1 份鲫鱼和 1 份鲢鱼的四环素，1 份黑鱼和 1 份巴沙鱼的土霉素，1 份鲢鱼和 1 份泥鳅的强力霉素，以及 1 份泥鳅、1 份南美白对虾和 1 份中国对虾的金霉素检测结果呈阳性，其余所有样品均为阴性，因此对四环素假阳性率为2%，对土霉素假阳性率为 2%，对强力霉素的假阳性率为 2%，对金霉素的假阳性率为 3%，均在允许的范围内。3.假阴性率测试取上述 20 种确证空白样本，分别添加四环素、土霉素、强力霉素、金霉素至各自检测限浓度，按本标准中所规定的前处理和检测方法操作。每个样本做 5 个平行样本，验证试纸条的假阴性率，结果见表 6。表 6 四环素类药物假阴性率测试结果（“+”代表阳性， “-”代表阴性）样本项目草鱼 青鱼 鳙鱼 鳜鱼 鲈鱼 鲤鱼 鲫鱼四环素 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +土霉素 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +强力霉素 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +金霉素 + + + + + + + + + + + + +- + + + + + + + + + + + + + + + +样本项目鲢鱼 黑鱼 鲶鱼 鳊鱼 龙利鱼 巴沙鱼 罗非鱼四环素 + + + + +- + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +土霉素 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +强力霉素 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +金霉素 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + +样本项目泥鳅 黄鳝 小龙虾 基围虾 南美白对虾中国对虾四环素 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +土霉素 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +强力霉素 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +金霉素 + + + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + + + +从检测结果可见，1 份鳜鱼和 1 份小龙虾的金霉素测试结果呈阴性，因此对四环素、土霉素、强力霉素的假阴性率均为 0，对金霉素的假阴性率为 2%，均在允许的范围内。4.交叉反应试验将氯霉素、孔雀石绿和隐色孔雀石绿、喹诺酮类药物、磺胺类药物、硝基呋喃类药物等标品溶液用 PBST 复溶液稀释后进行交叉反应试验，结果表明无交叉反应。5.灵敏度与特异性试验由于灵敏度=1-假阴性率，由试验结果可知本方法对四种硝基呋喃代谢物检测的假阴性率均5%，故本方法灵敏度95% 。特异性=1-假阳性率，由试验结果可知本方法对四种硝基呋喃代谢物检测的假阳性率均5%，故本方法特异度95% 。6.准确度测试通过比较免疫胶体金层析法与仪器确证方法测试结果的吻合程度评价其准确度。从上述 20 种样品中随机抽取若干种，随机添加四环素、土霉素、强力霉素或金霉素之一至各自检测限浓度，一共生成 80 组样品，每组 2 份，各取一份分别用本标准所规定的方法和 GB/T21317-2007动物源性食品中四环素类兽药残留量检测方法 液相色谱- 质谱 /质谱法与高效液相色谱法中采取的方法进行前处理和检测，检测结果如表 7 所示。表 7 胶体金免疫层析法和液相色谱- 串联质谱法测试结果比较（“+”代表阳性， “-”代表阴性，括号内为采用相同方法复检结果）样本项目草鱼 青鱼 鳙鱼 鳜鱼 鲈鱼 鲤鱼 鲫鱼胶体金 - - + + + - -四环素LC-MS - - + + + - -胶体金 - + + - + + -土霉素LC-MS - + + - + + -胶体金 + + - + + - +强力霉素 LC-MS + + - + + - +胶体金 + + + + + + -金霉素LC-MS + + + + + + -样本项目鲢鱼 黑鱼 鲶鱼 鳊鱼 龙利鱼 巴沙鱼 罗非鱼胶体金 + - + + - + +四环素LC-MS + - + + - + +胶体金 - - + + + + +土霉素LC-MS - - + + + + +胶体金 - + + - - + -强力霉素 LC-MS - + + - - + -胶体金 +(-) - + - - + -金霉素LC-MS -(-) - + - - + -样本项目泥鳅 黄鳝 小龙虾 基围虾 南美白对虾中国对虾胶体金 - + + - + +四环素LC-MS - + + - + +胶体金 - - + + - +土霉素LC-MS - - + + - +胶体金 - + - + + -强力霉素 LC-MS - + - + + -胶体金 + + - - - +金霉素LC-MS + + - - - +测试结果显示，本标准所规定方法的测试结果与法检方法测试结果完全相同，方法准确率为 100%。7.结论本标准采用胶体金免疫层析法对水产品中的四种四环素类药物四环素、土霉素、强力霉素、金霉素残留进行检测，检出限分别为 80、100、200 和 500 g/kg。检测阴性样品时，对四环素假阳性率为 2%，对土霉素假阳性率为 2%，对强力霉素的假阳性率为 2%，对金霉素的假阳性率为 3%，均在允许的范围内。检测阳性样本时，对四环素、土霉素、强力霉素的假阴性率均为 0，对金霉素的假阴性率为 2%，均在允许的范围内。该方法对其他药物无交叉反应，特异性良好。对实际样品分别采用本标准所规定的方法和 GB/T 21317-2007动物源性食品中四环素类兽药残留量检测方法 液相色谱-质谱 /质谱法与高效液相色谱法中规定的方法进行检测，本标准所规定的方法准确率达到 100%。采用胶体金免疫层析法检测时无需专门的仪器设备，操作简便，耗时短，成本低，准确率高，特别适合农贸市场、商场超市、养殖场、进出口检验检疫、食品加工厂、食堂等场合下的快速筛查，对规范养殖行业、保障消费者人生健康安全、提高出口产品竞争力有重要意义。七、 明确标准中涉及专利的情况，对于涉及专利的标准项目，应提供全部专利所有权人的专利许可声明和专利披露声明未涉及专利。八、 预期达到的社会效益、对产业发展的作用等情况目前四环素类药物的胶体金免疫层析产品在市场上呈爆发式增长，但不同厂家的产品通用性差，标准不一致。为了规范四环素类药物的胶体金免疫层析产品，保障食品安全、促进农业产业发展、破解贸易技术壁垒，急需制定水产品中四环素类药物的快速检测胶体金免疫层析法的团体标准。通过制定该标准可以达到：1.统一四环素类药物的胶体金免疫层析产品的样品处理方法，提高产品的通用性，既节省开发时间，又方便消费者使用；2.为产品生产厂家提供明确的技术要求及试验方法，以保证产品切实符合使用要求。九、 采用国际标准和国外先进标准情况，与国际、国外同类标准水平的对比情况，国内外关键指标对比分析或与测试的国外样品、样机的相关数据对比情况由于截至目前并未公布以胶体金免疫层析为检测方法的标准和公告，因此本标准在制定过程中未有采纳国际标准或国外先进标准。十、 在标准体系中的位置，与现行相关法律、法规、规章及相关标准，特别是强制性标准的协调性标准中的技术参数要求与国家相关标准、要求相一致。本标准内容符合现行法律法规。十一、 重大分歧意见的处理经过和依据在本次标准的修订过程中，工作组以召开研讨会、发送信函等形式，向有关科研单位、大专院校、监管部门、检验机构、各级各类生产企业以及行业协会征求修订意见，累计发出征求意见函 XX 份，返回有效修改意见单 XX 份，目前仍在进一步征求意见过程中。通过归类整理和分析讨论共采纳与内容、格式和必要指标等方面的意见共计 XX 条，并按照标准修订原则对标准草案进行了修改，本标准无重大分歧意见。十二、 标准性质的建议说明在陕西省内推荐执行。十三、 贯彻标准的要求和措施建议（包括组织措施、技术措施、过渡办法、实施日期等）建议标准实施后针对不同对象组织标准宣讲，促使企业、相关部门、消费者等不同群体了解标准内容，促进标准的顺利实施。十四、 废止现行相关标准的建议无十五、 其他应予说明的事项无联系人信息： 18729049401 （李）332877067qq.com 西安市未央区三桥南沣惠路2号（陕西省水产研究所）