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卡氏住白细胞虫 隐孢子虫文章汇总 1 目录 2 卡氏住白细胞虫文章 A B c D E F 3 A复方泰灭净对蛋鸡卡氏住白细胞虫病预防效果 A组 169只鸡 B组 159只鸡 对照组 172只鸡 血涂片 琼脂扩散法化验 产蛋及存活观察 实验结果 实验材料和方法 高产海兰白鸡 卡氏住白细胞虫标准抗原 标准阳性抗体 血涂片 琼脂扩散法化验 血涂片 琼脂扩散法化验 30g L复方泰灭净 50g L复方泰灭净 统计分析 复方泰灭净50g L组对卡氏住白细胞虫的感染完全保护 整个试验期间血涂片和琼脂扩散检查均为阴性 30g L组基本能够控制其感染 整个试验期间仅检出1例抗体阳性 感染率为0 63 1 160 同时未见临床症状 对照组蛋鸡从5月份开始至实验结束连续发病并出现血清学阳性反应 抗体检出率为27 80 80 00 抗原检出率为0 68 1 158 裂殖子检出率为0 63 1 158 并且出现大量死亡 4 B卡氏住白细胞虫子孢子冻存方法及感染力试验 实验材料和方法 32 35日龄的健康AA鸡 患卡氏住白细胞虫病鸡 诱捕库蠓 库蠓匀浆 子孢子纯化 A途径子孢子 B途径子孢子 病鸡 玻璃匀浆器 营养液 A组 6只 B组 6只 C组 6只 D组 6只 注射新鲜子孢子 A类子孢子 观察临床症状 B类子孢子 抹片 染色 镜检 第13天 注 每组鸡中每两只鸡分别注射0 1ml 0 2 0 3ml 实验结果 静脉接种未经冻存的新鲜子孢子的鸡全部发病 且随着接种剂量增加 病情亦加重 经A途径缓慢冻存的子孢子在较大剂量时可引起鸡发病 经B途径冻存的子孢子无论剂量大小均不能引起鸡发病 结论 子孢子的保存应选择A途径 而人工发病试验最好使用新鲜的子孢子进行接种 A冻存法 B冻存法 5 C卡氏住白细胞虫配子体的浓集和纯化 实验材料和方法 4只患卡氏住白细胞虫病鸡 分离液的制备 样本收集处理 单密度分离法 多密度分离法 配子体纯化 计数统计方法 实验结果 图1采用多密度法纯化的配子体 1000X 图2采用单密度法浓集的配子体 1000X 图3浓集后进一步纯化的配子体 1000X 图5鸡外周血液中的卡氏住白虫配子体 1000X 实验结论 该二种方法均取得了较好的分离和纯化效果 达到了直接从鸡血液中分离纯化配子体的目的 纯化的虫体纯度已基本符合虫体代谢 抗原分析及核酸分析研究等工作的要求 6 DPCRAmplicationandSequencingofITS 2rDNAofLeucocytozooncaulleryi MATERIALSANDMETHODS Diseasedchickens thehugeschizontswereisloatedfrommuscle heart liver andothertissues DNAextracte PCRamplification cloning sequencinganalysis ITS 2 DNAUNIQ 5spincolumnpurificationkitur RESULTS PCRAmplicationofITS 2rDNAofLeucocytozooncaulleryi Restrictionpatternofrecombinantplasmid 7 E卡氏住白细胞虫rDNAITS 2的PCR扩增与测序 实验材料和方法 广州某鸡场病死鸡 从肌肉组织及心脏等部位采集卡氏住白细胞虫巨型裂殖体 卵囊纯化 DNA提取 ITS2PCR扩增 鉴定回收 产物克隆筛选 DNA测序分析 实验结果 1 虫体扩增片段 2 鸡肌肉扩增片段 3 空白对照 1 SalI酶切重组质粒 2 重组阳性质粒 3 EcoRI酶切重组质粒 结论 根据上述比较分析 本试验所测为卡氏住白细胞虫的ITS 2及部分5 8S和28S ITS2 序列 其中ITS 2序列为卡氏住白细胞虫种特异性序列 8 F卡氏住白虫病PCR诊断方法的建立 实验材料和方法 卡氏住白虫虫体材料 采自广州花都某鸡场病鸡 微孢子虫DNA 弓形虫DNA 疟原虫DNA 荒川库蠓DNA 卵囊纯化 虫体DNA提取 引物设计稀释 ITS2PCR扩增 产物回收测序 特异性试验 敏感性实验 实验结果 PCR条件优化 图1氏住白虫ITS 2扩增结果 图2特异性试验 图3敏感性试验 1 卡氏住白虫PCR扩增产物2 肌肉对照组3 空白对照组 1 卡氏住白细胞虫2 健康肌肉3 鸡球虫4 荒川库蠓5 健康鸡血液6 微孢子虫7 弓形虫8 原虫 1 10ng l2 1ng l3 100pg l4 10pg l5 1pg l6 100fg l7 10fg l8 1fg lDNA 9 隐孢子虫文章 A C I B D E F G H J K O 10 A广东省乳牛隐孢子虫病的流行病学调查 实验材料和方法 1087头奶牛新鲜粪便 广东 实验结果 饱和蔗糖漂浮法 改良抗酸染色法 形态学鉴定 评判标准 图1乳牛隐孢子虫卵囊改良抗酸染色的形态学观察1000 图2乳牛隐孢子虫卵囊直接涂片的形态学观察1000 结论 初步鉴定为鼠隐孢子虫 C muris 11 结论 乳牛年龄越小 感染率越高 感染强度越大 并且明隐孢子虫感染在一定程度上受季节性变化的影响 但影响不是很大 12 B安氏隐孢子虫PCR检测方法的建立 实验材料和方法 安氏隐孢子虫卵囊 微小隐孢子虫 弓形虫 大肠杆菌 球虫 圆孢子虫 纤毛虫 肝片吸虫 血矛线虫和莫尼茨绦虫 牛粪便 虫体 对组DNA提取测定 HSP70扩增退火温度筛选 HSP70克隆与鉴定 引物设计与合成 特异 敏感性试验 实验结果 图1安氏隐孢子PCR检测的特异性试验结果 图2安氏隐孢子虫PCR检测的敏感性试验结果 结果 仅安氏隐孢子虫样品DNA扩增出约500bp的特定片段 特异性良好 当样本中含有DNA含量1 52 10 1 ng L 包含4 45 102个隐孢子虫的DNA时 即可扩增产生清晰可辩的条带 说明该方法灵敏性高 13 C安氏隐孢子虫内转录间隔区I ITS 1 序列的PCR扩增 克隆及分析 卵囊纯化 DNA提取 PCR扩增 产物克隆 质粒鉴定 ITS1测序分析 实验结果 实验材料和方法 安氏隐孢子虫卵囊GD株 广东奶牛场 HN株 郑州奶牛场 以及AH株 安徽农大 M 12345 bp 2000 1000 750 500 100 M1234 bp 2000 1000 750 500 100 M1123M2 bp 2000 1000 750 500 100 5000 2500 1000 250 图1C andersoniITS 1PCR产物琼脂糖电泳分析 图2C andersoniITS 1重组质粒PCR鉴定 图3C andersoniITS 1重组质粒EcoRI酶切鉴定 1 GD株2 HN株3 AH株4 宿主对照5 空白对照 14 测序结果 1 CTTACGTATTTGTTTATTAAACAAAAAATCTTATAATTGAACCTGAACTTGCCTAATTTTCTTAA652 CTTACGTATTTGTTTATTAAACAAAAAATCTTATAATTGAACCTGAACTTGCCTAATTTTCTTAA3 CTTACGTATTTGTTTATTAAACAAAAAATCTTATAATTGAACCTGAACTTGCCTAATTTTCTTAA1 AGATTATACTTAAGTTGAGTATCTTTTTTAAAATTAGGCCCTGTTCTTAAGAATTAATCCCTACT1302 AGATTATACTTAAGTTGAGTATCTTTTTTAAAATTAGGCCCTGTTCTTAAGAATTAATCCCTACT3 AGATTATACTTAAGTTGAGTATCTTTTTTAAAATTAGGCCCTGTTCTTAAGAATTAATCCCTACT1 AGCTTTGTATAATTTTTGTATCTTTTCTTTATACCTTGAGAGGGTTCCCTTTTAAGGACTTTGCA1952 AGCTTTGTATAATTTTTGTATCTTTTCTTTATACCTTGAGAGGGTTCCCTTTTAAGGACTTTGCA3 AGCTTTGTATAATTTTTGTATCTTTTCTTTATACCTTGAGAGGGTTCCCTTTTAAGGACTTTGCA1 AGCTAAATATTCATTTTAGGGGAAAGATCCAGATATTCTTATACTTAATTTTTAGGGGTTTTCTT2602 AGCTAAATATTCATTTTAGGGGAAAGATCCAGATATTCTTATACTTAATTTTTAGGGGTTTTCTT3 AGCTAAATATTCATTTTAGGGAAAAGATCCAGATATTCTTATACTTAATCTTTAGGGGTTTTCTT1 ATTTTTTTAAAATACTTTTTTGTTATTTGCCGACTTTTTTATTAGTCGTTTATAATCTCTA3212 ATTTTTTTAAAATACTTTTTTGTTATTTGCCGACTTTTTTATTAGTCGTTTATAATCTCTA3 ATTTTTTTAAAATACTTTTTTGTTATTTGCCGACTTTTTTATTAGTCGTTTGTAATCTCTA 图4C andersoniITS 1核酸序列的比较1 GD株 2 HN株 3 AH株 A C 及 G 代表DNA变异位点 结果 GD株 HN株和AH株的ITS 1序列基本一致 仅AH株有三个碱基差异 但与GenBank上注册的C muris和C parvum存在种间差异 而且差异显著 15 DMolecularIdentificationandCharacterizationofCryptosporidiumspp fromMainlandChina MATERIALSANDMETHODS Cryptosporidiumoocysts dairycowsinGuangdong AnhuiandJiangsuprovinces DNAextracte PCRamplification Purification cloning sequencinganalysis SSUrRNAandHSP70 DNAUNIQ 5spincolumnpurificationkitur RESULTS M DG005marker 1 Guangdongisolate 2 Anhuiisolate 3 Jiangsuisolate 4 No DNAcontrol 450bp 290bp HSP70 SSUrRNA 16 TableThelengthandbasecompositionoftheHSP70andtheSSUrDNAsequencesrepresentingCryptosporidiumspp fromChina SpeciesHostGeographicaloriginLength bp A Tcontents AccessionNo HSP70 C andersoni C andersoni C parvum SSUrDNA C andersoni C andersoni C parvum Dairycow Dairycow Dairycow Dairycow Dairycow Dairycow Guangdong China Anhui China Jiangsu China Guangdong China Anhui China Jiangsu China 446 446 446 290 291 292 61 65 61 65 60 53 65 16 65 62 69 85 AJ567386 AJ567387 AJ567388 AJ567389 AJ567390 AJ567391 17 E安氏隐孢子虫PCR诊断试剂盒的初步应用 XXXX年 实验材料和方法 PCR检测试剂盒 234份奶牛粪样 广东 河南 改良抗酸染色法 饱和蔗糖溶液漂浮法 常规方法 PCR试剂盒检测 检测样品处理 DNA提取 PCR扩增 产物检测 实验结果 18 M DL2000DNAMarker 1 12 阳性对照 2 11 13 22 阳性样品 23 阴性对照 结论 改良抗酸法阳性检出率4 25 饱和蔗糖漂浮法阳性检出率4 18 PCR阳性检出率6 31 本试剂盒的检出率比常规方法高出2 13 显示本试剂盒具有特异性 敏感性等优点 19 FDevelopmentandApplicationofNestedPCRAssayforDetectionofDairyCattle DerivedCyclosporasp DNAsamplesofcattle derivedCyclospora likeorganisms Giardiasp Eimeriasp Cryptosporidiumandersoni ciliate Trichurissp andswine derivedEimeriasp chicken derivedEimeriasp andCryptosporidiumbaileyi DNAextracte PCRprimers nestedPCR PCRamplification Evaluationofspecificity Evaluationofsensitivity MATERIALSANDMETHODS RESULTS 20 GCombinedPCR oligonucleotideligationassayfordetectionofdairycattle derivedCyclosporasp Materialsandmethods cattle derivedCyclosporasp Giardiasp Eimeriasp Cryptosporidiumandersoni ciliateTrichurissp DNAextracte primersreporterprobeselection PCRprocedure OLAprocedure Evaluationofspecificitysensitivity RESULTS Fig 4 AgarosegelelectrophoresisofdifferentcontentofPCRproducts LaneM DL 2000marker lane1 50ng lane2 5ng lane3 0 5ng lane4 0 05ng Fig 1 PCRampliconofdifferentgenomicDNA 21 Fig 3 Spectrophotometricabsorbance A405 valueofdifferentcontentofPCRproducts Fig 2 Spectrophotometricabsorbance A405 valuefordifferentnested PCRproducts 22 H贝氏隐孢子虫PCR检测试剂盒的研制 实验材料和方法 贝氏隐孢子虫GD株 卵囊纯化 DNA提取 特异引物设计 反应条件优化 试剂盒组装 特异性试验 敏感性试验 实验结果 稳定性试验 重复性试验 保存期试验 图1试剂盒的特异性试验结果 图2试剂盒敏感性试验结果 图3试剂盒稳定性试验结果 23 XXXX年 XXXX年 图2饱和蔗糖溶液漂浮法处理的贝氏隐孢子虫卵囊 A400 B1000 A B 图316份C baileyi阳性样品的PCR扩增 24 I贝氏隐孢子虫PCR诊断试剂盒的应用 XXXX年 XXXX年 实验材料和方法 215份家禽新鲜粪便样品 广州 佛山 改良抗酸染色法 饱和蔗糖溶液漂浮法 常规方法 PCR试剂盒检测 检测样品处理 DNA提取 PCR扩增 产物检测 实验结果 A B 图1改良抗酸染色法处理的贝氏隐孢子虫卵囊 A400 B1000 25 J基于ITS 1基因序列的隐孢子虫种群分类 实验材料和方法 禽源隐孢子虫广东 GD 株 牛源隐孢子虫GD株 牛源隐孢子虫安徽 AH 株 卵囊纯化 DNA提取 PCR扩增 鉴定回收 产物克隆 质粒鉴定测序 种群发育分析 实验结果 26 K人隐孢子虫RT PCR ELISA检测方法的建立 实验材料和方法 虫体 人隐孢子虫 其他隐孢子虫 柔嫩艾美耳球虫 实验结果 图1人隐孢子虫p23基因的扩增结果 最优条件 底物反应时间为45min 工作浓度为1 6000 RNA提取 RTPCR扩增 270bp 包被 液相杂交 底物显色 特异敏感性试验 27 O猴源人隐孢子虫的分离与鉴定 实验材料和方法 恒河猴 隐孢子虫 形态学鉴定 DNA提取 引物设计 基因扩增 测序分析 改良抗酸法染色 荧光显微镜观察 卵囊壁蛋白18SrRNA基因 实验结果 370bp 550bp 图1 虫卵呈玫瑰红色 形状规则 似圆形或椭圆形 卵囊内含有4个呈月牙形的子孢子 均被染成玫瑰红色 且有明显的折光 图2 卵囊自发荧光进行观察 可见卵囊为一圆形小亮点 呈现乳白色荧光卵囊壁周围略深染 中央淡染 似环状 28 结果 猴源隐孢子虫与C hominis相关基因序列遗传距离最近 结果 猴源隐孢子虫与C hominis相关基因序列在系统进化树上的遗传距离最近 29 Thankyou 请老师批评指正 30