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齐口裂腹鱼GtH-R基因的克隆及其序列分析,.,目的,目 录,1,材料与方法,2,结果,3,结论,4,参考文献,5,致谢,6,.,1 目的,促性腺素受体（GtH-R）属于G蛋白偶联受体超家族，其与促性腺激素（GtH）结合后可促进卵母细胞的成熟以及在精子发生的最后几个时期起主要作用。 鱼类中GtH基因除了在性腺中有丰富的表达外，在非性腺组织中也有少量或微量表达；可是还没有人对齐口裂腹鱼垂体组织中GtH-R基因进行克隆及序列分析，因此通过完成本次试验，为进一步研究齐口裂腹鱼的繁殖调控机制提供了一些基础数据。,.,2 材料与方法,2.1 试验材料齐口裂腹鱼平均体长为30-40cm； 平均体重为0.5-1.0kg。采集齐口裂腹鱼垂体组织样品，置于液氮中速冻，然后转移至-80超低温冰箱中保存备用。2.2 引物设计与合成 根据NCBI上斑马鱼GtH-R的cDNA序列，选取保守区序列；上游引物为5CATCCGTCGAGGACACTTTCGGTA3，下游引物为5ACACATAGCATCCGCAAATCACGAG3，委托华大基因科技有限公司进行特异性引物合成。,.,2.3 方法,引物设计与合成,反转录反应,PCR扩增,PCR产物回收,克隆测序,序列分析,总RNA提取,.,3 结果,图1 齐口裂腹鱼垂体组织总RNA 1%琼脂糖凝胶电泳图,图2 齐口裂腹鱼GtH-R 基因PCR电泳检测图,3.1 总RNA提取结果,3.2 RT-PCR产物检测,.,3.3 GtH-R核酸序列比对,图3 齐口裂腹鱼GtH-R基因cDNA部分编码核酸序列分析,齐口裂腹鱼斑马鱼鲤鱼齐口裂腹鱼斑马鱼鲤鱼齐口裂腹鱼斑马鱼鲤鱼齐口裂腹鱼斑马鱼鲤鱼齐口裂腹鱼斑马鱼鲤鱼齐口裂腹鱼斑马鱼鲤鱼齐口裂腹鱼斑马鱼鲤鱼,GtH-R基因编码核酸的测序结果与Genbank上斑马鱼序列进行相似性分析，相似性达93.0%，与鲤鱼的相似性为92.6%。,.,3.4 氨基酸相似性分析,GtH-R基因编码氨基酸序列的测序结果与Genbank上斑马鱼的序列进行相似性分析，相似性达97%以上。,图4 齐口裂腹鱼GtH-R氨基酸序列及序列分析,.,3.5 GtH-R氨基酸组成分析,亮氨酸（Leu）含量为最高，达到了16.45%，赖氨酸（Lys）含量最低，只有0.87%；其它具体的氨基酸组成类型及酸值见表1。,表1 齐口裂腹鱼GtH-R基因编码的氨基酸组成,图5 齐口裂腹鱼GtH-R基因编码的氨基酸组成,.,3.6 GtH-R的氨基酸疏水性分析与抗原决定簇预测,GtH-R 基因编码的氨基酸疏水性中存在4个疏水区，分别位于第57、90、132和186氨基酸残基附近;而氨基酸序列中则存在4个抗原决定簇，分别位于第27、34、112和159氨基酸残基附近。,图6 齐口裂腹鱼GtH-R氨基酸的平均疏水性比例,图7 齐口裂腹鱼GtH-R蛋白抗原决定簇预测,.,3.7 蛋白质二级结构的预测,图8 齐口裂腹鱼GtH-R蛋白质二级结构预测h表示螺旋；e表示折叠；c表示无规则卷曲,折叠占15.24%,螺旋占61.43%,无规则卷曲占23.33%,.,3.8 蛋白质磷酸化位点分析,由上图可知，GtH-R蛋白中含有4个磷酸化位点，全是Ser（Serine丝氨酸）位点有4个，没有Thr（threonine苏氨酸）、Tyr（tyrosine酪氨酸）。,图9 齐口裂腹鱼LHR蛋白磷酸化位点预测,.,4 结论,此次试验得到的结果显示：获得的齐口腹裂鱼GtH-R基因的长度为696 bp；与斑马鱼的序列相似性较高，表明同源性较近，其基因具有较高的保守性。对氨基酸和蛋白质分析显示：螺旋占的比例大，存在4个抗原决定簇和4个疏水区；说明GtH-R蛋白柔性好，是油溶性受体蛋白的可能性强。 最后得出齐口裂腹鱼GtH-R基因的保守性高，同时也为进一步研究齐口裂腹鱼的繁殖调控机制提供了一些基础数据，而具体的调控机制则有待进一步的研究。,.,5 参考文献,1 Kraak GVD, Suzuki K, Peter RE, et al. ProPerties of common carp gonadotroPin I and gonadotroPin J. General and ComParative Endocrinology 1992, 85(2): 217-2292 Oba Y, Hirai T, Yoshiura Y, et al. The duality of fish gonadotropin receptor：Cloning，functional characterization of a second gonaotropin receptor cDNA expressed in the ovary and testis of amago salmon (oncorhynchus rhodurus)J. Biochem Biophys Res Commun, 1999, 265(2):366-371.3 Oba Y, Hirai T, Yoshiura Y, et al. Cloning, functional charac-terization, and expression of a gonadotropin receptor cDNA in the ovary and testis of amago salmon(Oncorhynchus rhodurus)J.Biochemical and Biophysical Research Communications, 1999,263(2): 584-590.4 Kumar R S, Ijiri S, Trant J M. Molecular biology of the channel catfish gonadotropin receptors:1. Cloning of a functional luteinizing hormone receptor and preovulatory induction of gene expressionJ. Biol Reprod, 2001,64(3):1010-1018.5 Kumar R S, Ijiri S, Trant J M. Molecular biology of the channel catfish gonadotropin receptors: 2. Complementary DNA cloning,functional expression,and seasonal gene expression of the follicle-stimulating hormone receptorJ. Biol Reprod, 2001,65(3):710-717.6 Swanson P, Dittman A. Pituitary gonadotropins and their receptors in fishC / Advances in Comparative Endocrinology.Italy:Bologna,1997. 841-856.7 Vischer H F, Bogerd J. Cloning and functional characterization of a gonadal luteinizing hormone receptor complementary DNA from the African catfish (Clarias gariepinus)J. Biol Reprod, 2003, 68(1): 262-271.8 Bojerd J, Blomenrohr M, Andersson E, et al. Discrepancy between molecular structure and ligand selectivity of a testicular follicle-stimulating hormone receptor of the African catfish (Clarias garie Pinus)J. Biol Reprod, 2001, 64(6): 1633-1643.9 Rocha A, Gmez A, Zanuy S, et al. Molecular characterization of two sea bass gonadotropin receptors:cDNA cloning, expression a-nalysis, and functional activity J. Molecular and Cellular Endo-crinology, 2007, 272(1-2): 63-76.10 Mittelholzer C, Andersson E, Taranger G L, et al. Molecular characterization and quantifcation of the gonadotropin receptors FSH-R and LH-R from Atlantic cod(Gadus morhua)J. Gener-al and Comparative Endocrinology, 2009, 160(1): 47-58.11 Schulz R W, Vischer H F, Cavaco J E B, et al. Gonadotropins, their receptors, and the regulation of testicular functions in fish J. Comparative Biochemistry and Physiology Part B, 2001, 129(2): 407-417.12 Ascoli M, Fanelli F, Segaloff D L. The lutropin/choriogonado-tropin receptor, a 2002 perspective J. Endocr Rev, 2002, 23(2):141-174.13 Themmen A P N, Huhtaniemi I T. Mutations of gonadotropins and gonadotropin receptors: elucidating the physiology and patho-physiology of pituitary-gonadal function J. Endocr Rev, 2000,21(5): 551-583.14 Vassart G, Pardo L, Costagliola S. A molecular dissection of the glycoprotein hormone receptors J. Trends Biochem Sci, 2004,29(3): 119-126.15 刘琼,李建中,周毅,等.鱼类促性腺激素受体研究进展J.生命科学研究，2010，14（3）：263-267.16 Maugars G, Schmitz M. Molecular cloning and characterization of FSH and LH receptors in Atlantic salmon(Salmo salar L.)J. General and Comparative Endocrinology, 2006, 149(1): 108-117.,.,6 致谢,值此论文完成之际，忠心感谢导师姜冬梅老师给予的悉心指导和殷切教诲。导师为本课题的顺利完成付出了大量心血。在此论文完成之际，谨向姜冬梅老师及其爱人康波老师致以最深的敬意和最衷心的感谢！ 在此，我还要感谢一起度过大学生活的室友罗学奎、江前有、杨高以及10级水产系的同学们和12教101室的硕士研究生师兄们；同时也要感谢四川农业大学动物类实验教学示范中心为完成此次试验所提供的仪器设备。正是有了你们的帮助和支持，我才能克服众多困难，顺利完成论文的写作。 最后尤其要感谢的是我的家人，漫漫求学路，是父母亲人的一路支持和鼓励，敦促我不断的前进！ 在此谨向帮助过我的所有朋友，致以最衷心的谢意！,.,谢谢大家,.,
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