分子生物学研究方法和技术 医学PPT

分子生物学研究方法和技术,本人基本情况,1984年获湖南农学院农学学士学位。1987年获中国科学院遗传研究所理学硕士学位，专业:分子遗传。1999年11月-200年11月 受国家科技部派遣，在日本农林水产省北海道国家农业研究中心博士后特别研究员；主要从事基因定位和功能基因的筛选。年：主要从事水稻细胞质雄性不育机理研究；水稻分子育种技术研究。4：主要从事杂交水稻种子纯度快速鉴定技术研究；水稻品种指纹研究；基因定位和分子育种技术研究。,1、分子生物学的发展历程1871年，首次发现DNA（鲑精DNA）。1943年，证明DNA为遗传分子，而不是蛋白（1944，O T Avery）1953年，DNA双螺旋模型提出（J D Watson（美）和F H C Crick（英），1962年或诺贝尔生理学、医学奖）。从而为分子生物学这一学科奠基。1961年，合成mRNA，破译第一个遗传密码（M W Nirenberg（美），1968年获诺贝尔生理学、医学奖）基础研究的创新，与推动人类文明的进步。（以上被称为理论上的三大发现）,1970年，分离出第一个限制性内切酶（W Arber（瑞士），1978年获诺贝尔医学奖）1970年，Baltimore和Temin发现了逆转录酶长期的基础研究积累迎来了突飞猛进的高潮。1973年，Cohen把质粒作为基因工程的载体使用基础研究向应用研究的拓展。（以上被称为生物工程技术的的三大发明）,3个事例：（1）1976年，重组DNA成功（H Boyer和S N Colen，1981年获诺贝尔化学奖）勇敢的科学精神。（2）1982年，美国一制药公司在2000升发酵液中提取出100克精制胰岛素。相当于从1600磅动物胰腺中的提取量效率、成本、质量、竞争。（3）荷兰最早把分子生物学产品“猪牛痢疾疫苗”投放市场，比以上美国的胰岛素早半年后来居上。,人类对生命现象的认识,20世纪个体 染色体 基因 DNA SNP生物与非生物间的界限消失了！21世纪 基因克隆，拼结 组装植物、动物、婴儿！,数、理、化相关学科,生物学实验技术,渗透 交叉,近代生物学,个性,共性,宏观生物学（生态学为核心）,微观生物学（分子生物学为核心）,细胞水平,分子水平,结构生物学，发育生物学，神经生物学等新兴学科发展,生物多样性研究,资源保护与利用,人类生态环境的保护工农业生产持续发展,现代生物学的发展,分子生物学,分子生物学的延伸,2 分 子 生物 学 的 概 念,2.1 分子生物学的定义2.2 分子生物学的三大原则2.3 分子生物学研究的三大主要领域2.4 分子生物学发展的三大支撑学科,2.1 分子生物学的定义,Molecular biology is the study of genes and their activities at the molecular level, including transcription, translation, DNA replication, recombination and translocation. 分子生物学是研究核酸、蛋白质等生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学，是人类从分子水平上真正揭示生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。,分子生物学与生物化学之间的关系与区别,分子生物学研究生物大分子的结构、功能及信息传递过程，从分子水平研究生命现象。,生物化学生物体内的化学运动，包括化学组成、变化、结构与功能，生物分子间的物质与能量转换过程。,分子生物学生物化学, 构成生物大分子的单体是相同的, 生物遗传信息的表达的中心法则相同,高级结构,生物大分子之间的互作,2.2 分子生物学的三大原则,共同的核酸语言 共同的蛋白质, 生物大分子单体的排列（核苷酸，氨基酸）,结构生物学,基因分子生物学,生物技术理论论与应用,2.3 分子生物学研究的三大主要领域,狭义的分子生物学分子遗传学,2.4 分子生物学发展的三大支撑学科,1839-1847年 Matthias Schleiden & Theodor Schwann,细胞的化学组成，细胞器的结构，细胞骨架，生物大分子在细胞中的定位及功能,分子生物学发展的三大支撑学科之一,Gregor Mendel 1864 年,Genetics,Molecular Genetics,Gene structure Gene duplication Gene expression Gene recombination Gene mutation,分子生物学发展的三大支撑学科之二,遗传因子假说,Genetics,Biochemistry,Nucleic Acid Chemistry,Protein Chemistry,Enzymatic nature of crystalline （晶体） Protein,Biochemistry,3 21 世 纪 分 子 生 物 学 展 望,3.1 自然科学历史舞台角色的重大变化3.2 未来生物学形成的新热点及领域3.3 应用生物学发展3.4 21世纪 生命科学的世纪,引导自然科学向物质运动最高层次突破的带头学科,3.2 未来生物学形成的新热点及领域,生物大分子的高级三维结构与功能的统一,生物大分子之间的互作,个体,细胞,分子,整体论,细胞中的定位,细胞分化,神经基质神经通道信息传递,计算机语言,分辨，提取，分析， 比较， 预测生物信息,生物大分子的结构与功能信息,基因的识别与鉴定,基因功能信息的提取与证实,基因表达谱的绘制 (microarray),蛋白质水平上基因互作的探测,3.3 应用生物学发展,生物技术,诊断试剂 治疗药物植物品种 环境工程食品加工 生物塑料废物处理 再生能源,3.4 21世纪 生命科学的世纪,二十一世纪 生命科学的世纪,学习分子生物学的意义,第一章 RNA的分离纯化,主要内容,前言一、核酸分离、纯化原则（一）保持核酸分子一级结构的完整性（二）防止核酸的生物降解二、分离提取核酸的主要步骤（一）细胞的破碎（二）核蛋白的解聚、变性蛋白的去除（三）核酸的沉淀 (四）核酸的浓度测定（五）核酸的保存,核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。 无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要对核酸进行分离和纯化。 核酸样品质量将直接关系到实验的成败。,前 言,一、核酸分离、纯化原则,（一）保持核酸分子一级结构的完整性 1 意义 遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。 2 分离核酸原则： 1）温度不要过高； 2）控制一定的pH值范围(pH值5-9); 3）保持一定的离子强度; 4）减少物理因素对核酸降解的机械剪切力.,（二）防止核酸的生物降解,细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。 所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。,1. DNA酶抑制剂,1） 金属离子螯合剂： DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。如EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二钠)、8-羟基喹啉；2） 阴离于型表面活性剂： 如SDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。,2. RNA酶（RNAase)抑制剂,RNAase分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱，不宜失活。 (1) 皂土（bentonite ） 作用机制：皂土带负电荷，能吸附RNase，使其失活。,(2) DEPC(二乙基焦碳酸盐) (C2H5OCOOCOOC2H5) 粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。 作用机制：与蛋白质中His结合使蛋白变性。 使用注意： 1）DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋白质变性的浓度大1001000倍。 2）容易降解，保存在4 或液氮中； 3）提RNA时，0.1% DEPC浸泡器皿37 2 h。 4）剧毒。,（3) 肝素（4）复合硅酸盐（Macaloid)（5）RNase阻抑蛋白（RNasin）（6）氧钒核糖核苷复合物 (Vanadyl-Ribonucleoside Complex, VRC),二 分离提取核酸的主要步骤,（一）细胞的破碎 1 高速组织捣碎机捣碎 2 玻璃匀浆器匀浆 3 超声波处理法 4 液氮研磨法 5 化学处理法(SDS、吐温80等） 6 生化法（溶菌酶、纤维素酶等）,（二）核蛋白的解聚、变性蛋白的去除 核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力(核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非极性的范德华力。 分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，同时避免核酸降解。,常用方法： 1. 加入浓盐溶液（如NaCl） 核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋白解聚； 2. 加入SDS SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能；,3 . 酚/氯仿抽提 酚氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用。 氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。 在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为防止起泡和促使水相与有机相的分离，再加上一定量的异戊醇（酚：氯仿：异戊醇=25：24：1）。,1）使用注意 酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。 2）安全操作 酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时应戴手套。,使用酚时应注意,（三）核酸的沉淀,沉淀是浓缩核酸最常用的方法。 优点： 改变核酸的溶解缓冲液； 重新调整核酸的浓度； 去除溶液中某些盐离子与杂质。,1. 核酸沉淀的盐类及浓度,2. 有机沉淀剂,（1）乙醇优点： 对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易挥发除去，不影响以后实验。缺点： 需要量大，一般要求低温操作。,（2）异丙醇,优点： 需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。缺点： 易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀异丙醇难以挥发除去。所以，最后用70乙醇漂洗数次。,（3）聚乙二醇（PEG）,优点： 可用不同浓度的PEG选择沉淀不同相对分子质量的DNA片段。应用6000相对分子质量的PEG进行DNA沉淀时，使用浓度与DNA片段的大小成反比。注意： PEG沉淀一般需要加入0.5mol/L的NaCl或10mmol/L的MgCl2。要除去DNA沉淀中PEG。,（4）精胺,精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀DNA。 原理是： 精胺与DNA结合后，使DNA在溶液中结构凝缩而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质杂质与DNA分开，达到纯化DNA的目的。,3. 核酸沉淀的温度和时间,一般强调，核酸沉淀在低温长时间下进行。低温长时间沉淀，易导致盐与DNA共沉淀，影响以后的实验。一般使用0冰水，10-15min， DNA样品足可达到实验要求。,(四）核酸的浓度测定,1. 紫外分光光度法测定DNA和RNA的含量 前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、琼脂糖及其他核酸污染。测定浓度应大于0.25 g/ml 。 结论：在波长260nm紫外光下，1 OD值的吸光度相当于双链DNA浓度为50g/ml；单链DNA为37 g/ml；RNA为40 ug/ml。,紫外分光光度计测定核酸浓度的操作步骤,a吸取一定量的DNA样品或RNA样品，加水至特定体积后，转入分光光度计的石英比色杯中。b分光光度计先用一定量的水校正零点。c测定待测样品在230nm、260nm和280nm的OD值。d计算浓度。 双链DNA样品浓度(g/l) = OD260核酸稀释倍数 50； RNA样品浓度(g/l) = OD260核酸稀释倍数40。e分析纯度。,A：测DNA： 纯的DNA样品OD260/OD280应为1.8，OD260mOD230应大于2.0。1) OD260/OD280大于1.9时，表明有RNA污染。2) 小于1.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染；3) OD260/OD230小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。注： 可能出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为1.8的情况。,测定结果分析,B：测RNA 纯的RNA样品其OD260OD280应介于1.7-2.0之间，OD260/OD230比值应大于2.0。1）若RNA样品OD260/OD280比值太小，说明有蛋白质或酚的污染；2）比值大于2.0时，可能被异硫氰酸胍等污染；3）OD260/OD230比值小于2.0时表明有小分子及盐存在。,2. 溴乙锭荧光法测定核酸的含量,如果DNA和RNA的量很少或有较多杂质的情况下，其含量可用溴乙锭荧光法测定。原理：DNA、RNA本身并不产生荧光，但在荧光染料溴乙锭(EB)嵌入碱基平面之间后，DNA样品在紫外光激发下，可发出红色荧光，荧光强度与核酸含量成正比。使用一系列已知的不同浓度DNA溶液作标准对照，可比较出被测DNA溶液浓度。 注意：此法的比较主要基于目测，是估计水平。,（五）核酸的保存,对DNA保存： DNA样品溶于pH8.0的TE，4 或-20 保存； 长期保存样品中可加入1滴氯仿。对RNA 保存： RNA样品溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或双蒸灭菌水中，-70 保存; 长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中; 在RNA溶液中，加1滴0.2 mol/L VRC(氧钒核糖核苷复合物)冻贮于-70,可保存数年。,总RNA提取,目 的1了解某一特定组织或细胞某一特定mRNA转录量的变化，如PCR、Northern blot等。2了解某一特定组织或细胞全部mRNA转录量的变化，如DD-PCR、基因芯片等。3获得某一特定组织或细胞全部mRNA，以便建立cDNA库等。4获得某一特定组织或细胞全部RNA。以上工作的前提是制备纯净且完整的RNA。,根据生物学“中心法则”原理，基因的表达包括转录与翻译两个阶段。其中，由DNA到RNA的转录过程受到各种因素的调节，其调节水平反映出某种或某些特定的因素对相关基因表达的调节能力。RNA主要由rRNA（占总量的80-85），tRNA和核内小分子RNA（占总量的10-15）以及mRNA（占总量的1-5）所构成。理论上认为每克组织（或108个培养细胞）可提取5-10mg RNA。,提取总RNA的方法有多种，比如：1) 酚/SDS法 2）采用Trizol试剂盒或类似的方法，称为一步法，方便而快捷。缺点是RNA的获得量偏低，质量不够纯净。3）超离心方法，可以获得丰富且质量高的RNA。缺点是实验时间比较长，要求离心过夜。4）其它一些试剂盒，主要是利用某些特定的介质吸附RNA，洗去其它杂质，最后洗脱纯净的RNA。可以在短时间内获得纯净的RNA。但是价格比较昂贵。,植物总RNA提取(酚/SDS法 ),材料,液氮研磨缓冲液：0.18mol/LTris 0.09mol/L LiCL 4.5mmol/L EDTA 1%（W/V）SDS 用HCL调PH至8.2,1mol/L Tris的配法：,在800 双蒸水中溶解121克Tris碱，用浓盐酸调PH值，混匀后加水至1升。,要获得所需PH值的1M Tris HCL，可通过将一定数量的10M HCL和1升Tris碱混合，如下表所示:,0.5M EDTA的配制：,在700ML双蒸水中溶解186.1克Na2EDTA.2H2O，用NaOH调PH8.0（1000ML 05M EDTA需加入20克NaOH），补加双蒸水至1升。,TLE缓冲液平衡酚TLE溶液:0.2mol/LTris 0.1mol/L LiCL5mmol/L EDTA用HCL调PH至8.2，用等体积的PH8.0的TLE溶液抽提，然后再用TLE溶液至少抽提2次,氯仿：异戍醇（24：1）8MOL/L和2MOL/L LICL溶液（DEPC处理，焦碳酸二乙酯）3MOL/L乙酸钠（DEPC处理），将408克NaAc.3H2O溶于水，用3MOL/L乙酸调PH5.2，补加水至1升95%乙醇DEPC处理水,试验步骤：,1、 用液氮冷却研钵，取15g低温冷冻的植物组织，迅速置于研钵中，不时加入液氮以防止研磨过程中叶片融化，充分研磨后，立即转移到一个盛有150ML研磨缓冲液和50ml TLE缓冲液平衡酚的500ml离心管中。2、 加入50ml氯仿：异戍醇，于50加热20 min 。18000g, 4，离心20 min。,3、将上层水相转移到一个新的离心管中，加入50ml TLE缓冲液平衡酚的500ml，混匀，再加入50ml氯仿：异戍醇，18000g, 4，离心20 min。,4、用 TLE缓冲液平衡酚抽提水相，直至两面相间界面干净为止，水相再以氯仿抽提。5、 吸取上清液，加1/3体积的8M/L LiCL混合至终浓度为2M/L，4沉淀过夜，然后15000g，4， 离心20 min，沉淀以2-3ml 2M/L LiCL溶液冲洗。6、沉淀以5ml水重溶，加入1/3体积的8M/L LiCL混合至终浓度为2M/L，于 4深沉RNA两小时以上。,7、 15000g，4， 离心20 min，沉淀用2ml 2M/L LiCL溶液冲洗，重溶于2ml双蒸水，加入200ul 3MOL/L乙酸钠溶液和5.5ml无水乙醇，-20沉淀过夜或在干冰/乙醇中沉淀30 min。8、18000g, 4，离心15min，沉淀用1ml双蒸水溶解，取10 ul稀释至1ml测OD260和OD280,Trizol试剂盒方法,原 理本实验类似于“异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法”。方法采用强RNA酶抑制剂异硫氰酸胍，抑制RNA酶的活性，防止RNA的降解；酚/氯仿使蛋白质变性。离心后，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相。之后通过异丙醇沉淀，75%乙醇洗涤等，便可得到较为完整与纯洁的总RNA。,实验步骤1取50毫克植物细嫩组织，加入1ml Trizol液，剪碎，快速匀浆。222，静置5min。3加入氯仿0.2ml，颠倒15s。422，静置3min。5离心：415000转/分15min。6取上清液0.45ml。7加入0.45ml异丙醇，混匀。,822，静置10min。9离心：415000转/分10min。10弃上液。11加入1ml 4 75%乙醇。12离心：410000转/分5min。13弃上液，真空干燥5min。14用高压消毒过的去离子水25ul水冰上溶解，-70保存。15紫外分光光度计测定RNA的含量：,取样本5ul加入石英比色杯内，加入蒸水1ml，充分混匀。与蒸镏水对照。读260nm、280nm两个测得值，记录。计算：OD260为1时，为40ug RNA，所以计算如下：样本RNA含量（ug/ul）= OD260*200*40/1000当OD值260/28030min;20过夜将有助于增加核酸的沉淀量。,9、 在核酸提取过程中有机溶剂沉淀后复溶时可加水因此时离子浓度可能较高，而到高度纯化后低温保存时最好复溶于TE缓冲液中，因溶于TE的核酸储藏稳定性要高于水溶液中的核酸。另外核酸样品保存时要求以高浓度保存，低浓度的核酸样品要比高浓度的更易降解。,10、 核酸提取后可通过PCR 、RTPCR直接扩增出目的基因片断，也可首先构建文库、然后由dd-PCR等差异显示技术、AFLP等标记技术、差异杂交或文库扣除技术等方法筛选出特异探针，再用此探针从文库中筛选出完整基因。,11、 在抽提过程中，若蛋白质含量或其它的杂质还较多，可以增加抽提次数.提取RNA请尽量在低温下操作，如果条件不容许，在室温下操作的时间要尽可能的短。,克服多糖污染可采用以下一些办法1) CTAB多次抽提。2) 在有机溶剂沉淀时先稀释样品浓度（可到10倍左右），对低浓度样品再进行沉淀。3) 在有机溶剂沉淀时选用异丙醇和5MNaCL作为沉淀溶剂，此时氯化钠的用量可用到1/5-1/2的体积，异丙醇可用到0.6-1的体积。异丙醇沉淀核酸时，高浓度盐存在将使大量多糖存在在溶液中，从而可达到去多糖的作用。但高浓度的盐存在会影响核酸的进一步操作，因此必须用乙醇多次洗涤脱盐。,针对RNA酶的一些注意事项,防止RNA酶污染的措施：1、 所有的玻璃器皿均应在使用前于180的高温下干烤6hr或更长时间。2、 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。3、 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。,4、 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22m滤膜过滤除菌。5、操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。6、 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。,7、 DEPC能与胺和巯基反应,因而 含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理8、 加样原则是DNA最后加，其他试剂按照体积大小从大往小的加。如果是同种引物和探针有多管的话只是DNA不同，那么采取的方法是算出总体积后加在一个管子里面，混合均匀之后再分装到各个管子里去，这样可以有效地避免误差及污染。9、 普通实验室容易污染，且污染程度很高，与跑电泳还有质粒制备提取都在同一个房间里有比较大的关系，最容易造成高浓度污染的就是产物的开盖和质粒的稀释。因此要格外注意一些。,谢谢！,Thank you,