沙门氏菌检测.doc

沙门氏菌检测1 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：1.1 冰箱：25。1.2 恒温培养箱：361，421。1.3 均质器。1.4 振荡器。1.5 电子天平：感量0.1g。1.6 无菌锥形瓶:容量500ml，250ml。1.7 无菌吸管：1ml（具0.01ml刻度）、10ml（具0.1ml刻度）或微量移液器及吸头。1.8 无菌培养皿：直径90mm。1.9 无菌试管：3mm50mm、10mm75mm。1.10 无菌毛细管。1.11 pH计或pH比色管或精密pH试纸。1.12 全自动微生物生化鉴定系统。2 培养基和试剂2.1 缓冲蛋白胨水（BPW）：见附录中1。2.2 四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液：见附录中2。2.3 亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液：见附录中3。2.4 亚硫酸铋（BS）琼脂：见附录中4。2.5 HE琼脂：见附录中5。2.6 木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂：见附录中6。2.7 沙门氏菌属显色培养基。2.8 三糖铁（TSI）琼脂：见附录中7。2.9 蛋白胨水、靛基质试剂：见附录中8。2.10 尿素琼脂（pH7.2）：见附录中9。2.11 氰化钾（KCN）培养基：见附录中10。2.12 赖氨酸脱羧酶试验培养基：见附录中11。2.13 糖发酵管：见附录中12。2.14 邻硝基酚-D半乳糖苷（ONPG）培养基：见附录中13。2.15 半固体琼脂：见附录中14。2.16 丙二酸钠培养基：见附录中15。2.17 沙门氏菌O和H诊断血清。2.18 生化鉴定试剂盒。3 操作方法3.1 试验前准备3.1.1 将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆杯、试管、量筒、吸管（1ml、10ml）、稀释剂等移至操作室内。准备好足够用量，避免操作中出入操作间。3.1.2 开启无菌室紫外杀菌灯和洁净工作台的空气过滤装置30min。3.1.3 操作人员用肥皂洗手，关闭紫外杀菌灯，进入缓冲间，换工作鞋，用消毒液洗手或用乙醇棉球擦手，穿戴好无菌衣、帽、口罩、手套等。3.1.4 操作前先用乙醇棉球擦手、工作台面，再用乙醇棉球擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后用灭菌剪刀或镊子将供试品启封。3.2 前增菌称取25g（ml）样品放入盛有225ml BPW的无菌均质杯中，以8000r/min10000r/min均质1min2min，或置于盛有225ml BPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min2min。若样品为液态，不需要均质，振荡混匀。如需测定pH值，用1mol/ml无菌NaOH或HCl调pH至6.80.2。无菌操作将样品转至500ml锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于361培养8 h18h。如为冷冻产品,应在45以下不超过15min,或25不超过18h解冻。3.3 增菌轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1ml，转种于10ml TTB内，于421培养18 h24h。同时，另取1ml，转种于10ml SC内，于361培养18h24h。3.4 分离分别用接种环取增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板（或HE琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板）。于361分别培养18h24h（XLD琼脂平板、HE琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板）或40h48h（BS琼脂平板），观察各个平板上生长的菌落。各个平板上的菌落特征见表1。表 1 沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征选择性琼脂平板沙门氏菌BS琼脂菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变。HE琼脂蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色。XLD琼脂菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心。沙门氏菌属显色培养基按照显色培养基的说明进行判定。3.5 生化试验3.5.1 自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于361培养18h24h，必要时可延长至48h。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属的反应结果见表2。表2 沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果三糖铁琼脂赖氨酸脱羧酶试验培养基初步判断斜面底层产气硫化氢KA()()可疑沙门氏菌属KA()()可疑沙门氏菌属AA()()可疑沙门氏菌属AA/非沙门氏菌KK/非沙门氏菌注：K：产碱，A：产酸，：阳性，：阴性；()多数阳性，少数阴性；/：阳性或阴性。3.5.2 接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时,可直接接种蛋白胨水（供做靛基质试验）、尿素琼脂（pH7.2）、氰化钾（KCN）培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。于361培养18h24h，必要时可延长至48h，按表3判定结果。将已挑菌落的平板储存于25或室温至少保留24h，以备必要时复查。表3 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表反应序号硫化氢（H2S）靛基质pH7.2尿素氰化钾（KCN）赖氨酸脱羧酶A1A2A3/注：阳性，：阴性，/：阳性或阴性。3.5.2.1 反应序号A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN 和赖氨酸脱羧酶3 项中有1项异常，按表4可判定为沙门氏菌。如有2项异常为非沙门氏菌。表4 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表pH7.2尿素氰化钾（KCN）赖氨酸脱羧酶判定结果甲型副伤寒沙门氏菌（要求血清学鉴定结果）沙门氏菌IV或V（要求符合本群生化特性）沙门氏菌个别变体（要求血清学鉴定结果）注：阳性，：阴性。3.5.2.2 反应序号A2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。3.5.2.3 反应序号A3：补做ONPG。ONPG 阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳性。甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。3.5.2.4 必要时按表5 进行沙门氏菌生化群的鉴别。表5 沙门氏菌属各生化群的鉴别项 目IIIIIIIVVVI卫矛醇山梨醇水杨苷ONPG丙二酸盐KCN注：阳性，：阴性。3.5.3 如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，可根据3.5.1的初步判断结果，从营养琼脂平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。3.6 血清学鉴定3.6.1 抗原的准备一般采用1.21.5琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。O血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的（如23）培养基上再检查；如果是由于Vi 抗原的存在而阻止了O凝集反应时，可挑取菌苔于1ml生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。H抗原发育不良时，将菌株接种在0.550.65半固体琼脂平板的中央，俟菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过装有0.30.4半固体琼脂的小玻管1 次2次，自远端取菌培养后再检查。3.6.2 多价菌体抗原（O）鉴定在玻片上划出2个约1cm2cm的区域，挑取1环待测菌，各放1/2环于玻片上的每一区域上部，在其中一个区域下部加1滴多价菌体（O）抗血清，在另一区域下部加入1滴生理盐水，作为对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合1 min，并对着黑暗背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。3.6.3 多价鞭毛抗原（H）鉴定同3.6.2。3.7 结果与报告综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告25g（ml）样品中检出或未检出沙门氏菌。附录 培养基和试剂1 缓冲蛋白胨水（BPW）1.1 成分蛋白胨 10.0g氯化钠 5.0g磷酸氢二钠（含12 个结晶水） 9.0g磷酸二氢钾 1.5g蒸馏水 1000mlpH 7.20.21.2 制法将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，静置约10 min，煮沸溶解，调节pH，高压灭菌121 ，15min。2 四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液2.1 基础液蛋白胨 10.0g牛肉膏 5.0g氯化钠 3.0g碳酸钙 45.0g蒸馏水 1000mlpH 7.00.2除碳酸钙外，将各成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，再加入碳酸钙，调节pH，高压灭菌121，20 min。2.2 硫代硫酸钠溶液硫代硫酸钠（含5个结晶水） 50.0g蒸馏水 加至100ml高压灭菌121，20 min。2.3 碘溶液碘片 20.0g碘化钾 25.0 g蒸馏水 加至100 ml将碘化钾充分溶解于少量的蒸馏水中，再投入碘片，振摇玻瓶至碘片全部溶解为止，然后加蒸馏水至规定的总量，贮存于棕色瓶内，塞紧瓶盖备用。2.4 0.5煌绿水溶液煌绿 0.5g蒸馏水 100ml溶解后，存放暗处，不少于1d，使其自然灭菌。2.5 牛胆盐溶液牛胆盐 10.0g蒸馏水 100ml加热煮沸至完全溶解，高压灭菌121 ，20min。2.6 制法基础液 900ml硫代硫酸钠溶液 100ml碘溶液 20.0ml煌绿水溶液 2.0ml牛胆盐溶液 50.0ml临用前，按上列顺序，以无菌操作依次加入基础液中，每加入一种成分，均应摇匀后再加入另一种成分。3 亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液3.1 成分蛋白胨 5.0g乳糖 4.0g磷酸氢二钠 10.0g亚硒酸氢钠 4.0gL-胱氨酸 0.01g蒸馏水 1000mlpH 7.00.23.2 制法除亚硒酸氢钠和L-胱氨酸外，将各成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，冷至55以下，以无菌操作加入亚硒酸氢钠和1g/L L-胱氨酸溶液10ml（称取0.1g L-胱氨酸，加1mol/L氢氧化钠溶液15ml，使溶解，再加无菌蒸馏水至100ml 即成，如为DL-胱氨酸，用量应加倍）。摇匀，调节pH。4 亚硫酸铋（BS）琼脂4.1 成分蛋白胨 10.0g牛肉膏 5.0g葡萄糖 5.0g硫酸亚铁 0.3g磷酸氢二钠 4.0g煌绿 0.025g或5.0g/L水溶液5.0ml柠檬酸铋铵 2.0g亚硫酸钠 6.0g琼脂 18.0g20g蒸馏水 1000mlpH 7.50.24.2 制法将前三种成分加入300 ml 蒸馏水（制作基础液），硫酸亚铁和磷酸氢二钠分别加入20ml和30ml蒸馏水中，柠檬酸铋铵和亚硫酸钠分别加入另一20ml和30ml蒸馏水中，琼脂加入600ml蒸馏水中。然后分别搅拌均匀，煮沸溶解。冷至80 左右时，先将硫酸亚铁和磷酸氢二钠混匀，倒入基础液中，混匀。将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠混匀，倒入基础液中，再混匀。调节pH，随即倾入琼脂液中，混合均匀，冷至5055。加入煌绿溶液，充分混匀后立即倾注平皿。注：本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性，贮于室温暗处，超过48h会降低其选择性，本培养基宜于当天制备，第二天使用。5 HE琼脂（Hektoen Enteric Agar）5.1 成分蛋白胨 12.0g牛肉膏 3.0g乳糖 12.0g蔗糖 12.0g水杨素 2 .0g胆盐 20.0g氯化钠 5.0g琼脂 18.0g20.0g蒸馏水 1 000ml0.4溴麝香草酚蓝溶液 16.0mlAndrade 指示剂 20.0ml甲液 20.0ml乙液 20.0mlpH 7.50.25.2 制法将前面七种成分溶解于400 ml 蒸馏水内作为基础液;将琼脂加入于600 ml 蒸馏水内。然后分别搅拌均匀，煮沸溶解。加入甲液和乙液于基础液内,调节pH。再加入指示剂,并与琼脂液合并,待冷至5055倾注平皿。注:本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性。甲液的配制硫代硫酸钠 34.0g柠檬酸铁铵 4.0g蒸馏水 100ml乙液的配制去氧胆酸钠 10.0g蒸馏水 100mlAndrade指示剂酸性复红 0.5g1mol/L氢氧化钠溶液 16.0ml蒸馏水 100ml将复红溶解于蒸馏水中,加入氢氧化钠溶液。数小时后如复红褪色不全,再加氢氧化钠溶液1ml2ml。6 木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂6.1 成分酵母膏 3.0gL-赖氨酸 5.0g木糖 3.75g乳糖 7.5g蔗糖 7.5g去氧胆酸钠 2.5g柠檬酸铁铵 0.8g硫代硫酸钠 6.8g氯化钠 5.0g琼脂 15.0g酚红 0.08g蒸馏水 1 000mlpH 7.40.26.2 制法除酚红和琼脂外，将其他成分加入400ml蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。另将琼脂加入600ml蒸馏水中，煮沸溶解。将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂，待冷至 5055倾注平皿。注:本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性，贮于室温暗处。本培养基宜于当天制备，第二天使用。7 三糖铁（TSI）琼脂7.1 成分蛋白胨 20.0g牛肉膏 5.0g乳糖 10.0g蔗糖 10.0g葡萄糖 1.0g硫酸亚铁铵（含6 个结晶水） 0.2g酚红 0.025g或5.0 g/L溶液5.0ml氯化钠 5.0g硫代硫酸钠 0.2g琼脂 12.0g蒸馏水 1000mlpH 7.40.27.2 制法除酚红和琼脂外，将其他成分加入400ml蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。另将琼脂加入600ml蒸馏水中，煮沸溶解。将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂，混匀，分装试管，每管约2ml4ml，高压灭菌12110 min 或115 15min，灭菌后置成高层斜面，呈桔红色。8 蛋白胨水、靛基质试剂8.1 蛋白胨水蛋白胨（或胰蛋白胨） 20.0g氯化钠 5.0g蒸馏水 1000mlpH 7.40.2将上述成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH，分装小试管,121高压灭菌15min。8.2 靛基质试剂8.2.1 柯凡克试剂：将5g对二甲氨基甲醛溶解于75ml戊醇中,然后缓慢加入浓盐酸25ml。8.2.2 欧-波试剂：将1g对二甲氨基苯甲醛溶解于95ml95乙醇内。然后缓慢加入浓盐酸20ml。8.3 试验方法挑取小量培养物接种,在361培养1d2d，必要时可培养4d5d。加入柯凡克试剂约0.5ml，轻摇试管,阳性者于试剂层呈深红色；或加入欧-波试剂约0.5ml，沿管壁流下，覆盖于培养液表面,阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。注：蛋白胨中应含有丰富的色氯酸。每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用。9 尿素琼脂（pH 7.2）9.1 成分蛋白胨 1.0g氯化钠 5.0g葡萄糖 1.0g磷酸二氢钾 2.0g0.4酚红 3.0ml琼脂 20.0g蒸馏水 1000ml20%尿素溶液 100mlpH7.20.29.2 制法除尿素、琼脂和酚红外，将其他成分加入400ml蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。另将琼脂加入600 ml 蒸馏水中，煮沸溶解。将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂后分装，121高压灭菌15min。冷至5055,加入经除菌过滤的尿素溶液。尿素的最终浓度为2。分装于无菌试管内，放成斜面备用。9.3 试验方法挑取琼脂培养物接种,在361培养24h，观察结果。尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为红色。10 氰化钾（KCN）培养基10.1 成分蛋白胨 10.0g氯化钠 5.0g磷酸二氢钾 0.225g磷酸氢二钠 5.64g蒸馏水 1000ml0.5氰化钾 20.0ml10.2 制法将除氰化钾以外的成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，分装后121高压灭菌15min。放在冰箱内使其充分冷却。每100ml 培养基加入0.5氰化钾溶液2.0ml（最后浓度为1:10000），分装于无菌试管内,每管约4ml,立刻用无菌橡皮塞塞紧,放在4冰箱内,至少可保存两个月。同时，将不加氰化钾的培养基作为对照培养基,分装试管备用。10.3 试验方法将琼脂培养物接种于蛋白胨水内成为稀释菌液，挑取1环接种于氰化钾（KCN）培养基。并另挑取1环接种于对照培养基。在361培养1 d2 d，观察结果。如有细菌生长即为阳性（不抑制），经2d细菌不生长为阴性（抑制）。注:氰化钾是剧毒药,使用时应小心，切勿沾染，以免中毒。夏天分装培养基应在冰箱内进行。试验失败的主要原因是封口不严,氰化钾逐渐分解，产生氢氰酸气体逸出，以致药物浓度降低，细菌生长，因而造成假阳性反应。试验时对每一环节都要特别注意。11 赖氨酸脱羧酶试验培养基11.1 成分蛋白胨 5.0g酵母浸膏 3.0g葡萄糖 1.0g蒸馏水 1000ml1.6溴甲酚紫-乙醇溶液 1.0mlL-赖氨酸或DL-赖氨酸 0.5g/100ml 或1.0g/100mlpH 6.80.211.2 制法除赖氨酸以外的成分加热溶解后,分装每瓶100ml，分别加入赖氨酸。L-赖氨酸按 0.5加入，DL-赖氨酸按1加入。调节pH。对照培养基不加赖氨酸。分装于无菌的小试管内，每管0.5ml，上面滴加一层液体石蜡，115高压灭菌10min。11.3 试验方法从琼脂斜面上挑取培养物接种，于361培养18h24h，观察结果。氨基酸脱羧酶阳性者由于产碱，培养基应呈紫色。阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。对照管应为黄色。12 糖发酵管12.1 成分牛肉膏 5.0g蛋白胨 10.0g氯化钠 3.0g磷酸氢二钠（含12个结晶水） 2.0g0.2溴麝香草酚蓝溶液 12.0ml蒸馏水 1000mlpH 7.40.212.2 制法12.2.1 葡萄糖发酵管按上述成分配好后，调节pH。按0.5加入葡萄糖，分装于有一个倒置小管的小试管内，121高压灭菌15min。12.2.2 其他各种糖发酵管可按上述成分配好后,分装每瓶100ml，121高压灭菌15min。另将各种糖类分别配好10溶液，同时高压灭菌。将5ml糖溶液加入于100ml培养基内，以无菌操作分装小试管。注：蔗糖不纯,加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌。12.3 试验方法:从琼脂斜面上挑取小量培养物接种，于361培养,一般2d3d。迟缓反应需观察14d30d。13 ONPG 培养基13.1 成分邻硝基酚-D半乳糖苷（ONPG）60.0mg0.01mol/L磷酸钠缓冲液（pH7.5） 10.0ml1蛋白胨水（pH7.5） 30.0ml13.2 制法将ONPG溶于缓冲液内，加入蛋白胨水，以过滤法除菌，分装于无菌的小试管内，每管0.5ml，用橡皮塞塞紧。13.3 试验方法自琼脂斜面上挑取培养物1 满环接种于361培养1h3h 和24h 观察结果。如果-半乳糖苷酶产生，则于1h3h 变黄色，如无此酶则24h不变色。14 半固体琼脂14.1 成分牛肉膏 0.3g蛋白胨 1.0g氯化钠 0.5g琼脂 0.35g0.4g蒸馏水 100mlpH 7.40.214.2 制法按以上成分配好,煮沸溶解,调节pH。分装小试管。121高压灭菌15min。直立凝固备用。注:供动力观察、菌种保存、H抗原位相变异试验等用。15 丙二酸钠培养基15.1 成分酵母浸膏 1.0g硫酸铵 2.0g磷酸氢二钾 0.6g磷酸二氢钾 0.4g氯化钠 2.0g丙二酸钠 3.0g0.2溴麝香草酚蓝溶液 12.0ml蒸馏水 1000mlpH 6.80.215.2 制法除指示剂以外的成分溶解于水，调节pH，再加入指示剂，分装试管，121高压灭菌15min。15.3 试验方法用新鲜的琼脂培养物接种，于361培养48h，观察结果。阳性者由绿色变为蓝色。