贝类中麻痹性贝类毒素的测定 标准文本

中华人民共和国国家标准 GB 布 施 食品安全国家标准 贝类中麻痹性贝类毒素的测定 (征求意见稿 ) GB 前 言 本标准代替 类中麻痹性贝类毒素的测定 ， 23215类中多种麻痹性贝类毒素含量的测定 液相色谱 。 本标准与 23215主要变化如下： 标准名称修改为“食品安全国家标准 贝类中麻痹性贝类毒素的测定”； 第一 法 为 小鼠生物法 ， 作为 麻痹 性 贝类毒素总量 的检测方法； 增加了 第二法 酶联免疫 吸附 法 ， 作为 麻痹 性 贝类毒素 的 筛 查方法； 第 三法 为 高效液相色谱法 ，作为 麻痹 性 贝类毒素 的 常规检测 方法。 增加了第四法 液相色谱 为 麻痹 性 贝类毒素 确证 方法。 GB 食品安全国家标准 贝类中麻痹 性贝类毒素的测定 1 范围 本标准适用于贝类及其制品中 麻痹 性 贝类毒素的 测定 。 第一法 为 小鼠生物法 ， 适用于 麻痹性 贝 类毒素 的 总量 测定 ；第二法 为 酶联免疫 吸附 法 ， 适用于 麻痹性贝类毒素 的 筛 查 检测 ；第三法 为 高效液相色谱法 ， 适用于 麻痹性贝类毒素总量 (以及 常规检测 ；第四法为 液相色谱 适用于 、 、 、 0种麻痹性贝类毒素组分含量的测定及确证 。 第一法 小鼠生物法 2 原理 方法采用 小鼠生物法 对 据小鼠 腹腔 注射贝类提取液后的死亡时间，查出鼠单位，并按小鼠体重，校正鼠单位 (计算确定每 100 以石房蛤毒素 作为标准，将鼠单位换算成毒素的微克数 ， 计算确定每 100 测定结果代表存在于贝肉内各种化学结构的 3 试剂和材料 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为 6682规定的 二 级水。 氢氧化 钠 （ ： 将 4.0 g 氢氧化钠（ 于 1 L 蒸馏水中。 盐酸（ ：分析纯 。 酸溶液（ ） ： 将 15 盐酸（ 蒸馏水稀释至 1 L。 酸溶液（ 5 ） ： 将 41.7 蒸馏水稀释至 100 无水乙醇（ 分析纯 。 石房蛤毒素 标准品 （ ： 纯度 。 标准溶液的配制 房蛤毒素 贮备液 （ 100 g/用蒸馏水配制 20（ v/v）的乙醇溶液，用 5 盐酸调节备用。精确称取 用上述溶液 定容至 100 g/。 房蛤毒素 工作液 （ 1 g/：准确吸取 1 素 贮备液 ， 用 蒸馏水 稀释 ， 调节 定容 至 100 该标准工作液可在 3 4 下稳定 30天 。 GB 小鼠： 体重为 19 g21 g 的健康 雄性 小鼠。若小鼠重量 21 g，则根据附录 B 到小鼠体重校正系数 。 4 仪器和设备 均质器。 电炉 。 天平： 感量 0.1 g， g。 离心机：转速 2000 转 /分钟 。 一次性注射器： 1 5 分析步骤 试样 制备 样品采集 及保存 析样品要有充分的代表性，应从足量（一般应 2 混合样品中挑选良好的贝类去壳，用于分析的去壳肉量应达 200 能及时送检的新鲜贝类， 按 沥水后的 200 、200 4 冷藏保存，备检。 品制备 蛎、蛤及贻贝 用清水将贝壳外表彻底洗净，切断闭壳肌，开壳，用蒸馏水淋洗内部去除泥沙及其他异物。将闭壳肌和连接在胶合部的组织分开，仔 细取出贝肉，切勿割破贝体。严禁加热或用麻醉剂开壳。收集约200 要使肉堆积），检出碎壳等杂物，将贝肉粉碎备用。 贝 取可食部分用作检测，过程同 冻贝类 在室温下，使冷冻的样品（带壳或脱壳的） 自然融化 ， 按 洗、取肉、 粉碎、备用 。 类罐头 将罐内所有内容物（肉及液体）倒入均质器中充分均质。如果是大罐，将贝肉沥水并收集沥下的液体分别称重并存放固形物和汤汁，将固形物和汤汁按原罐装比例混合 ，均质后备用。 酸保存的贝肉 沥去酸液，分别存放贝肉及酸液，备用。 肉干制品 干制品可于等体积 盐酸 溶液中浸泡 24 h 48 h（ 4 冷藏 ） ，按 分别存放贝肉和酸液备用 。 测定步骤 GB 用 10 15 20 25 30 蒸馏水分别稀释 1 g/作 液10 制成系列浓度的标准稀释液。 位数死亡时间的标准液选择 取按 制的系列浓度的标准稀释液各 1 腔注射小鼠数只，选择中位数死亡时间为 5 7 浓度剂量。如某浓度稀释液已达到要求，还需以 1 馏水 的增减量进行补充稀释试验。例如：用 25 馏水 稀释的 10 准液在 5 7 死小鼠，还需进行 24 10 6 10释度的试验。 每只小鼠试验前称重，以 10 只小鼠为一组，用中位数死亡时间在 5 7 围内的二个浓度含量的标准稀释液注射小鼠，测定并记录 每只小鼠腹腔注射完毕至停止呼吸的所需死亡时间。 素转换系数 ( 计算 鼠中位数死亡时间的选择 计算所选择浓度的标准稀释液受试组中位数死亡时间。弃去中位数死亡时间小于 5 大于 7 择中位数死亡时间在 5 7 受试组，该受试组中可有个别小鼠的死亡时间可小于 5 大于 7 正鼠单位 (计算 对于所选定的中位数死亡时间为 5 7 据附录 再根据附录 一只小鼠的体重校正系数与鼠单位相乘得该只受试小鼠的校正鼠单位（ 素 转换系数 (计算 对于选定的受试组，用该受试组所选稀释液每毫升实际毒素含量的微克数（以 石房蛤毒素 为例计算），除以受试组中每只小鼠的 ，得到单只小鼠的毒素转换系数（ 计算见公式（ 1） ，再计算每组 10 只小鼠的平均 ，即为组内毒素转换系数。 C （ 1） 中： 毒素 转换系数； C 每毫升 际毒素含量，单位为微克每毫升（ g/ 校正鼠单位。 组间毒素转换系数 (计算 取不同受试组组内毒素转换系数的平均值，即为组间毒素转换系数。以组间毒素转换系数进行 如 测间隔时间较长，每次测定时要用适当的标准稀释液注射 5 只小鼠，重新测定 。如果一周有几次检测，则用中位数 死亡时间 5 7 标准稀释液每周检查一次，测得的 应在原测定 的 20范围内。若结果不符，用同样的标准稀释液另外注射 5 只小鼠，综合先前注射的 5 只小鼠结果，算出 。并用同样的标准稀释液注射第二组 10 只小鼠，将第二组求出的和第一组的 进行平均，即为一个新的 。 重复检查的 通常在原结果的 20之内，若经常发现有较大偏差，在进行常规检测前应调GB 查该方法中是否存在未控制或未意识到的可变因素。 试样提取 100 g 按 理的样品于 800 杯中，加 盐酸溶液 100 分搅拌，均质，调整 围内；按 理的样品，取 100 g 贝肉，加入相应的酸液 100 均质。必要时，可逐滴加入 5 盐酸溶液或 0.1 氢氧化钠溶液调整 碱时速度要慢，同时需不断搅拌，防止局部碱化破坏毒素。 混合物加热 煮沸 5 却至室温，将混合物移至量筒 中并稀释至 200 节 切勿 混合物倒回烧杯，搅拌均匀，自然沉降至上清液呈半透明状，不堵塞注射针头即可，必要时将混合物或上清液以 3000 r/心 5 用滤纸过滤。收集上清液备用。 小鼠试验 19.0 g 21.0 鼠 6只， 称重并记录重量。 随机分 为实验 组和空白对照组（ 盐酸 ） 两组，每组 三 只。 每只试验小鼠腹腔注射 1 取液或空白对照液。注射过 程中若有一滴以上提取液溢出，须将该只小鼠丢弃，并重新注射一只小鼠。 录注射完毕时间，仔细观察并记录小鼠停止呼吸时的死亡时间（到小鼠呼出最后一口气止）。 注射样品原液后， 1 只或 2 只小鼠的死亡时间大于 7 需再注射至少三只小鼠以确定样品的毒力。 小鼠的死亡时间小于 5 要稀释样品提取液后，再注射另一组小鼠（ 3 只），直至得到 5 7 死亡时间；稀释提取液时，要逐滴加入 盐酸溶液，调节 6 分析结果的表述 力的计算 每 100 2）计算。 X = 200 （ 2） 式中： X 每 100 g 样品中 含量，单位为微克每百克（ g /100 g）； 检测样品受试组小鼠的中位数 校正鼠单位； 毒素转换系数； 稀释倍数； 200 表示样品提取液定容的体积 ， 单位 为毫升（ 提示： 作中该定容体积为 200 力的结果表述 若 空白对照组 小鼠正常，则报告待测 样品 中 素含量为： g /100 g。 U 毒力的计算 GB 对于取得麻痹性贝类毒素标准品有困难的实验室，可按公式（ 3），使用鼠单位 Y = 200 （ 3） 式中： Y 每 100 g 样品的 ，单位为鼠单位每 百克（ 100 g）； 检测样品受试组小鼠的中位数 校正鼠单位； 稀释倍数； 200 表示样品提取液定容的体积 ， 单位 为毫升（ 提 示： 作中该定容体积为 200 注：检验结果的仲裁 以 准 。 U 毒力的 判断 与结果表述 在 空白对照组 小鼠正常的情况下进行如下判断和表述： 若小鼠 的死亡时间大于 60 待测 样品的鼠单位即相当小于 U/g。 若 实验 组中位数死亡时间小于 5 应对样品提取液进行稀释，再选取 3 只小鼠进行 试验 ，直至 得到中位数死亡时间为 5 止，根据最后的稀释液实验结果计算样品的 鼠单位 毒力 ，报告该样品的 鼠单位为： 00 g。 若 实验 组中位数死亡时间大于 7 直接计算确定样品 鼠单位 毒力 ， 报告该样品的 鼠单位为： 00 g。 若 实验 组中所有小鼠在观察 15 均不死亡，则 也可报告 该样品的鼠单位 小于 400 00 g。 力单位转换 样品中的毒力单位按公式 (4)计算。 80g /100g = 40000g （ 4） 式 中： 毒素转换系数； 80g /100g 样品中 量 (g /100g)； 40000g 样品中 量 (00g)。 7 其他 为避免毒素的危害，应戴手套进行检验操作。移液管等用过的器材应在 5%的次氯酸钠溶液中浸泡1使毒素分解 。同样， 废弃的提取液等也应以 5%次氯酸钠 溶液处理。 对于动物实验过程中产生的 污水、废弃物及动物尸体处理，应参照实验动物 环境及设施 4925执行。 GB 第二法 酶联免疫 吸附 法 8 原理 本方法的测定基础是竞争性酶联免疫吸附试验 反应。游离麻痹性贝类毒素与麻痹性贝类毒素酶标记物竞争麻痹性贝类毒素抗体，同时麻痹性贝类毒素抗体与捕捉抗体连接。没有被结合的酶标记物在洗涤步骤中被除去。结合的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物。加入反应停止液后使颜色由蓝转变为黄色。在 450 品中的麻痹性贝类毒素溶液与吸光度值成反比，按绘制的校正曲线定量计算。 9 试剂和材料 除另有规定外，所有化学试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。 0.1 盐酸 。 盐酸 。 半对数坐标纸 。 标 准物质 浓缩液：经酸化，含有 20 % 乙醇作为保护液，冷藏时，无限期稳定 。 酶标记物 浓缩液 。 抗体 浓缩液 。 基质 （过氧化尿素） /发色剂 （四甲基联苯胺） 。 反应终止液 : 1 硫酸。 商业化试剂盒若评价 技术 参数达到本标准的要求则也适合于本标准 （附录 D） 。 10 仪器和设备 酶标仪 ： 450 均质器 。 离心机： 4 3000 g。 微量加样器： 50 L， 100 L， 500 L， 微量多通道加样器： 50 L， 100 L。 11 分析步骤 样制备 GB 砺、蛤及贻贝 用清水将贝壳外表彻底洗净，切断闭壳肌，开壳，用重蒸馏水淋洗内部去除泥沙及其他外来物。将闭壳肌和连接在胶合部的组织分开，仔细取出贝肉，切勿割破肉体。开壳前不要加热或用麻醉剂。收集约 200 g 肉置于筛子中沥水 5 要使肉堆积 )，检出碎壳等杂物，将贝肉均质。 贝 取可食部分用作检测。沥干及均质过程同 类罐头 将罐内所有内容物 (肉及液体 )倒入 均质器充分均质。如果是大罐， 将贝肉沥水并收集沥下的液体，分别称重，将固形物和汤汁按比例 (1:1)混合，充分均质。 酸保存的贝肉 沥去酸液，分别存放贝肉及酸液，将沥干的贝肉充分均质。 冻贝类 在室温下，使冷冻的样品 (带壳或脱壳的 )呈半冷冻状态，按 洗、取肉、均 质。 样的提取和净化 称取 10.0 g 试样 (精确至 加入 70 .1 盐酸溶液 (如果样品为较干燥的贝肉， 加入 140 .1 盐酸溶液，稀释系数等同 )，煮沸并搅拌 5 4 3500 g 离心 10 心后控制 ，用 5 盐酸溶液调节到 下，取 100 L 上清液，用缓冲液按 1： 10 稀释 (1+9)，取 50 L 按 行酶联免疫测定。此时的稀释倍数是 80。高浓度的样品，如超出标准曲线范围，可进一步用缓冲液稀释，直至样品浓度在标准曲线范围以内。 酶联免疫测定 将足够数量的微孔条插入微孔架 (标准液和样液分别做复孔 )，记录标准液和样液的位置。加入 6 个适当的麻痹性贝类毒素标准液和样液各 50 入 50 记物至每个微孔，轻轻混合，再加入 50 底混合，用粘胶纸封住微孔以防溶液挥发，20 黑暗避光处孵育 15 微孔架倒置在吸水纸上拍打数次，以保证完全除去微孔中的液体，每个微孔注满重蒸馏水冲洗后拍干，再重复以上洗板操作 5次。加入 100 发色试剂至每个微孔中，轻拍混匀， 20 黑暗避光处孵育 15 入 100 拍混匀后，以空白调零，测量并记录每个微孔溶液 450 12 分析结果的 计算与 表述 计算百分比吸光度值 计算麻痹 性贝类毒素标准液和样液的平均吸光度值，按公式 （ 5）分别求得每个 麻痹性贝类毒素标准液和样 液的百分比吸光度值： A S 100%.（ 5） 中： A百分比吸光度值； S 6个适当的麻痹 性贝类毒素标准液或样液的平均吸光度值 ； GB 0 g/贝类毒素标准液的平均吸光度值。 绘制校正 曲线 以百分比吸光度值（算术级）为纵坐标，以麻痹 性贝类毒素 溶 液 浓度（ g/对数级）为横坐标，绘制出麻痹性贝类毒素标准液百分比吸光度值与麻痹 性贝类毒素 溶液浓度的校正 曲线。每次试验均应重新绘制 校正 曲线。 结果的计算 在 读取样液百分比吸光度值所对应的麻痹性贝类毒素浓度即为试样中麻痹 性贝类毒素含量（ g/ 为了获取样品中麻痹性贝类毒素的实际浓度（ g/从校正曲线上读出的浓度值必须乘以相对应的稀释系数。 结果的表述 当测定值小于 50 g/报告麻痹 性贝类毒素含量 为小于 50 g/ 当测定值 大于等于 50 g/报告 麻痹性贝类毒素实际测定 值。 13 其他 测定低限 方法的测定低限 为 50 g/ 回收率 方法的回收率为 90 %。 健康和安全 任何麻痹 性贝类毒素含量值大于 800 g/ 际惯例表示方式为 80 g/ 100 g） 的样品即被认为是有害的，对人类食用不安全。 标准液含有麻痹 性贝类毒素，应特别小心，避免接触。 反应终止液为 1 硫酸，避免接触皮肤。 第三法 高效液相色谱法 14 原理 试样中的麻痹性贝类毒素用 0.1 的盐酸提取，离心后，将上清液过 相萃取柱净化，再经过分子质量 10 000 的分子筛超滤离心管过滤，滤液用高效液相色谱进行分离，经在线柱后衍生反应后，进行荧光检测，外标法定量。 15 试剂和材料 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为 6682规定的一级水。 乙腈：色谱纯。 无水乙酸 。 GB 盐酸： 36% 38%（质量分数） 。 庚烷磺酸钠 。 磷酸： 85%（质量分数）。 二水合高碘酸。 磷酸氢二钾。 氢氧化钾。 氨水。 100 庚烷磺酸钠溶液：称取 庚烷磺酸钠（ 用水溶解定容至 1 000 500 磷酸溶液：称取 49.0 g 磷酸（ 用水溶解定容至 1 000 250 磷酸氢二钾溶液：称取 43.5 g 磷酸氢二钾（ 用水溶解定容至 1 000 1.0 氢氧化钾溶液：称取 氢氧化钾（ 用水溶解定容至 1 000 500 高碘酸溶液：称取 二水合高碘酸（ 用水溶解定容至 1 000 1.0 乙酸溶液：称取 无水乙酸（ 用水溶解定容至 1 000 乙酸溶液：量取 10.0 .0 乙酸溶液（ 用水稀释定容至 1 000 0.1 盐酸溶液：量取 9.0 酸（ 用水稀释定容至 1 000 标准溶液 ：麻痹性贝类毒素 、 、 、 光保存于 以下。 标准储备液：将标准溶液用 乙酸溶液（ 释成一定浓度的标准储备液，避光保存于 以下。 混合标准溶液：分别准确吸取适量各标准储备液，用 乙酸溶液（ 成所需浓度的混合标准溶液，现配现用。 流动相 A：量取 15.0 00 庚烷磺酸钠溶液（ 8.5 00 磷酸溶液( 用约 450稀释，用氨水（ 水定容到 500 流动相 B：量取 20.0 00 庚烷磺酸钠溶液（ 45.0 00 磷酸溶液( 用约 450稀释，用氨水（ 水定容到 500 氧化液：量取 10.0 00 高碘酸（ 100 50 磷酸氢二钾溶液(用约 450溶解，用 1.0 氢氧化钾溶液 ( 水定容到 500 中和液： 1.0 乙酸溶液 ( GB 0 181)， 3相当者。 滤膜： m。 16 仪器和设备 高效液相色谱仪 ： 配有荧光检测器，柱后衍生反应装置。 离心机 ： 转速 2000 转 /分钟。 固相萃取装置。 旋涡震荡器。 恒温水浴锅。 超滤离心管 ： 分子质量 10 000： 0.5 相当者。 。 具塞离心管： 15 刻度玻璃离心管： 10 17 分析步骤 试样制备与保存 从所取全部样品中取出有代表性样品可食部分约 500 g，充分捣碎均匀，均分成两份，分别装入洁净容器中，密封，并标明标记。 在制样的操作过程中，应防止样品污染或发生残留物含量的变化。 试样 置 于 以下避光保存。 试样提取 准确称取 5 g 试样，精确至 g，于 15 塞离心管中，加入 10 盐酸溶液（ 振荡均匀 。 将离心管置于 100C 的沸水浴中，加热 5却后，以 5000 心 10 试样净化 相 萃取柱 （ 用前依次用 6.0 醇和 6.0 活化，将 心得到的上清液过柱，收集流出液，用水定容至 10 约 1 集液，于分子质量 10 000 的超滤离心管（ 离心，滤液供液相色谱测定。 仪器参考条件 液相色谱参考条件 色谱柱： 82505m） ，或相当者。 a） 色谱柱温度： 30C。 1) 18 固相萃取柱是 司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品 的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 2) 滤离心管是 司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 GB 1 流动相： 流动相 A（ 流动相 B（ ,流动相 C: 乙腈（ 流动相时间梯度，见表 1： 表 1 流动相时间梯度 时间 /动相 A/% 流动相 B/% 流动相 C/% 流速 /（ mL/ 0 100 0 0 00 0 0 00 0 0 00 0 0 1.0 b） 柱后衍生：氧化液 (中和液 (反应温度： 50 ，反应液流速梯度见表 2： 表 2 柱后衍生反应液流速梯度 单位为毫升每分钟 反应液 时间 0 5 5.5 5 5.5 0 化液 和液 .4 c） 荧光检测：激发波长 330 射波长 390 d） 进样量： 10 L。 色谱 测定 根据样液中麻痹性贝类毒素的含量情况，选定峰面积相近的标准工作液。标准工作液和样液中麻痹性贝类毒素的响应值均应在仪器检测的线性范围内。标准工作液和样液等体积参插进样测定。在上述色谱条件下，标准品的色谱图见 图 空白实验 除不加试样外，均按上述测定步骤进行。 平行试验 按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。 回收率试验 阴性 样品 中添加标准溶液，按 作，测定后计算样品添加的回收率。本标准中 10 种麻痹性贝类毒素添加浓度及其回收率范围的试验数据参见 表 18 分析结果的表述 结果计算 样品中各种麻痹性贝类毒素的含量按式（ 6）计算 。 10001000 （ 6） 式中： X 试样中被测组分残留量，单位为微克每千克（ g/ GB 2 c 从标准工作曲线上得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升（ ng/ V 样品溶液定容体积，单位为毫升（ m 样品溶液所代表试样的质量，单位为克（ g）。 计算结果应扣除空白值。 毒性转换 按照国际惯例， 素的毒性因子被设为 1，其他各种麻痹性毒素按照相对于 毒性大小来确定毒性因子（如表 3 所列）；样品中麻痹性贝类毒素的含量则按照毒性因子，统一转换为 算公式见式（ 7）： ni ii （ 7） 式中： 各种麻痹性贝类毒素的含量 毒性因子 表 3 麻痹性贝类毒素毒性因子 毒素 TX 性因子 9 精密度 般规定 本部分的精密度数据是按照 B/T 复性和再现性的值以 95%的可信度来计算。 复性 在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限 r，元贝和扇贝中 10种麻痹性贝类毒素的添加 浓度范围及重复性方程见表 4。 表 4 添加浓度范围及重复性和再现性方程 单位 ： 微克 /千克 化合物名称 添加浓度范围 样品基质 重复性限 r 再现性限 R 467 元贝 贝 507 元贝 贝 48 元贝 贝 1 319 元贝 贝 173 元贝 贝 B 3 65 元贝 贝 196 元贝 贝 157 元贝 贝 125 元贝 贝 145 元贝 贝 ： 如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。 现性 在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限 R，元贝和扇贝中 10种麻痹性贝类毒素的添加浓度范围及再现性方程 见表 4。 20 其他 方法的测定低限： g/g/g/g/kg；g/g/g/g/g/g/麻痹性贝类毒素总量 ( 125 g/ 第四法 液相色谱 21 原理 以甲酸 乙酸乙酯、氯仿液 蛋白， 固相萃取 柱净化 后，加乙腈除蛋白，超滤离心管过滤， 液相色谱 测 ， 外 标法定量。 22 试剂和材料 除非另有说明，本方法所用试剂均为色谱纯，水为 6682规定的一级水。 0 种麻痹性贝类毒素标准溶液 : 、 、 、 酸乙酯 （ 仿 （ 酸 （ ： 分析纯 。 酸 铵 （ ： 分析纯 。 GB 4 腈 （ 醇 （ 酸 铵 缓冲 溶液 （ 5 ） ：称取 入 5 水 溶解并稀释 至 1000 酸溶液 （ ： 量取 500 水稀释至 100 化乙腈 （ ： 量取 5 乙腈 稀释至 1000 白样品基质液：空白样品基质液的制备同 60 用前预先用 3 3 3 化。 滤离心管 ： 4 10 合标准中间溶液：根据贝类毒素各组 分的浓度，准确移取适量各组分标准溶液，用水稀释配成 00 ng/g/g/g/g/4 避光保存，有效期 3个月。 23 仪器和设备 相色谱 联质谱仪 ： 配电喷雾（ 子源 。 平： 感量为 g。 速冷冻离心机 ： 10000 r/ 心机： 4000 r/ 声波清洗器。 涡混匀器。 质器。 吹仪。 相萃取装置 24 分析步骤 试样制备 用水将贝壳外表洗净。撬开贝壳，切断闭壳肌，用水淋洗，去除内部泥沙及其它异物，仔细取出贝肉，切勿割破贝体，在筛子上平铺沥水 5 后将贝肉均质、混匀。 取 称 取 试样（ 5g，置 于 50 心管中 ，加入 5 酸溶液（ 涡旋混匀 1 000 r/0 上清液至另一 50 心管中，残渣中再加入 4.5 酸溶液按上GB 5 述方法重复提取 2次，上清液合并至 50 心管中，用 甲酸溶液定容至 15 匀后待净化。 化 向所得提取液中加入 20 旋混匀 后 ， 10000 r/0 去上层溶液；再向提取液中加入 20 旋混匀 后 ， 10000 r/0 3 入已活化的固相萃取柱中， 过柱速度 控制在每秒 1滴 ， 接 流出液至 10 甲酸溶液淋洗柱子，收集流出液至 3.5 流出液中加入 4.5 置 5 混匀， 10000 r/ 10 1 10000 r/ 10 得滤液供液相色谱 器分析条件 相色谱参考条件 a) 色谱柱 2.0 50 5 m， 或性能相当者； b) 流动相： A： 甲酸铵缓冲溶液（ B： 酸化乙腈 ( 梯度 洗脱 条件 见表 5； c) 流速： mL/ d) 柱温： 30 ； e) 进样量： 20 L； f) 样品盘温度： 5 。 表 5 流动相 梯度洗脱条件 时 间 /（ B/酸化乙腈 （ %） A/甲酸铵溶液 （ %） 0 30 0 30 0 40 0 40 94 94 0 30 0 30 谱参考条件 g) 离子源：电喷雾离子源； h) 扫描方式：正离子扫描； i) 检测方式：多反应监测； j) 喷雾电压： 4500 V； k) 离子传输毛细管温度： 300 ； l) 锥孔电压： ； m) 雾化气流速： ； n) 辅助气流速： ； o) 碰撞 气压 力： 1.5 p) 母离子、子离子和碰撞能量见表 6。 GB 6 表 6 10 种麻痹性贝类毒素 母离子 、 子离子 和 碰撞能量 目标化合物 母离子 /m/z 子离子 /m/z 碰撞能量 /20 5 19 3 19 3 23 9 7 5 20 5 21 2 21 2 18 8 18 8 注： *为定量离子 质标准曲线的制作 分别取一定量混合标准中间液，氮气吹干后， 用空白样品基质液配制系列基质标准工作液。标准工作液中 、 、 、 ng/00 ng/度范围 10 ng/00 ng/供液相色谱 麻痹性贝类毒素 的 峰面积 为纵坐标，以 相应 的浓度为横坐标 ， 绘制 基质 标准曲线 ，求回归方程和相关系数。 定 性测定 在相同测试条件下测定标准溶液和样品溶液，样品溶液中麻痹性贝类毒素的保留时间与标准工作液中麻痹性贝类毒素的保留时间的比值，偏差应在 5% 以内。且检测到的离子的相对丰度，应当与浓度接近的标准溶液中离子的相对丰度一致，其偏差应符合表 7规定的范围，则可判定试样中存在被测化合物。 表 7 定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 50% 20%至 50% 10%至 20% 10% 允许的相对偏差 20% 25% 30% 50% 量测定 GB 7 取 待测样品 溶液和相应的 基质 标准溶液等体积进样测定，按外标法 以 标准曲线对样品进行定量。标准溶液及 待测样品 溶液中 麻痹性贝类毒素 的 响应值均应在仪器检测的线性范围之内。标准溶液 、空白溶液 和 标准添加 溶液中 麻痹性贝类毒素 特征离子流图参见 附录 G。 25 空白试验 除不加试 样 外，均按上述测定步骤进行。 26 结果计算和表述 样品 中 麻痹性贝类毒素的含量 按 公式（ 8） 计算，计算结果需扣除空白值 ，结果保留三位有效数字。 m . .（ 8） 式中 ： 样品 中 麻痹性贝类毒素 的 含 量， 单位为微克每 千克 （ g/ 从标准工作曲线得到的 试样溶液中 麻痹性贝类毒素 的浓度， 单位为 纳 克每毫升（ ng/ V 样品最终定容体积，单位为毫升（ f 稀释倍数 ； m 试样质量 ，单 位为克（ g）。 按照国际惯例， 毒性因子设为 1，其他各种麻痹性贝类毒素按照相对于 。样品中麻痹性贝类毒素的含量则按照毒性因子，统一转换为 换公式见式（ 9）： ni . .（ 9） 式中： 各种麻痹性贝类毒素的含量，单位为微克每千克（ g/ 毒性因子 表 8 麻痹性贝类毒素的毒性因子 毒素 TX 性因子 7 方法灵敏度 本方法 出限为 25 g/量限为 50 g/出限为 50 g/量限为 100 g/10种麻痹性贝类毒素在定量限下按毒性因子转换 后相当于 g/ 28 准确度 GB 8 本方法 麻痹性 贝类 毒素 添加 浓度为 50 g/600 g/收率为 70 % 120 %。 29 精 密度 本方法批内相对标准偏差 15 %， 批间相对标准偏差 15 %。 GB 9 附 录 A 麻 痹性贝类毒素死亡时间 鼠单位的关系 麻痹性贝类毒素死亡时间 表 麻痹性贝类毒素死亡时间 鼠单位的关系 时间 鼠单位 （ 分秒） （ 时间 鼠单位 （分秒） （ 1： 00 100 1： 10 ： 15 ： 20 ： 25 ： 30 ： 35 ： 40 ： 45 ： 50 ： 55 ： 00 ： 05 ： 10 ： 15 ： 20 ： 25 ： 30 ： 35 ： 40 ： 45 ： 50 ： 55 ： 00