中兽药散剂中添加磺胺类药物的测定　超高效液相色谱-串联质谱法

ICS11.220B 41DB37山东省地方标准DB37/T XXXXXXXXX中兽药散剂中添加磺胺类药物的测定超高效液相色谱-串联质谱法Determination of sulfonamides added to chinese veterinary drug powderUltra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometryXXXX - XX - XX发布XXXX - XX - XX实施山东省市场监督管理局发布DB37/T XXXXXXXXX目次前言II1范围12规范性引用文件13原理14试剂或材料15仪器设备26试验步骤26.1阴性样品26.2提取26.3仪器参考条件26.4测定37试验数据处理38精密度4附录A（资料性附录）磺胺类药物特征离子参考质量色谱图5前言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省兽药质量检验所、威海市畜牧业发展中心。本标准主要起草人：魏秀丽、徐恩民、张传津、张志民、尹伶灵、刘霄飞、陈玲、王燕、陈志强、赵国清。 5中兽药散剂中添加磺胺类药物的测定超高效液相色谱-串联质谱法1 范围本标准规定了中兽药散剂中磺胺类药物的超高效液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于中兽药散剂（白头翁散，黄连解毒散、清瘟败毒散）中添加磺胺嘧啶、磺胺甲基异噁唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺喹噁啉的测定。本方法的检出限为0.2 mg/g，定量限为0.5 mg/g。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3 原理中兽药散剂中添加的磺胺类药物经提取后，超高效液相色谱-串联质谱测定，依据保留时间和离子丰度比定性，外标法定量。4 试剂或材料除非另有规定，所用试剂均为色谱纯。4.1 水符合GB/T 6682一级水的规定。4.2 乙腈（CH3CN）：色谱纯。4.3 甲酸（HCOOH）：色谱纯。4.4 甲醇（CH3OH）：色谱纯。4.5 流动相： 流动相A（0.1 %甲酸水溶液）：吸取甲酸（4.3）1.0 mL，加水稀释至1 000 mL，过0.22 m微孔滤膜备用； 流动相B (0.1 %甲酸乙腈)：吸取甲酸（4.3）1.0 mL，加乙腈（4.2）稀释至1 000 mL，过0.22 m微孔滤膜备用； 初始流动相：量取0.1 %甲酸乙腈50 mL与0.1 %甲酸水溶液450 mL，混匀，备用。4.6 五种磺胺类药物对照品：磺胺嘧啶，磺胺甲基异噁唑，磺胺间甲氧嘧啶，磺胺二甲嘧啶，磺胺喹噁啉，纯度95.0 %。4.7 混合标准储备液：称取五种磺胺类药物对照品（4.6）各10 mg（准确至0.01 mg），分别置10 mL容量瓶中，加甲醇（4.4）溶解并稀释至刻度，摇匀，得五种磺胺类药物对照品溶液。准确吸取五种磺胺类药物对照品溶液各1.0 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇（4.4）稀释至刻度，摇匀，得混合标准储备液，4 冰箱保存，有效期3个月。4.8 标准曲线制备：吸取混合标准储备液适量，用初始流动相稀释，制备成系列浓度为：10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL的标准工作液，作标准曲线。100 ng/mL工作液作为超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）的对照品溶液。4.9 有机微孔滤膜：0.22 m。5 仪器设备5.1 超高效液相色谱串联质谱仪：配电喷雾离子源（ESI）。5.2 分析天平：感量0.01 g，0.000 01 g。5.3 离心机：5 000 r/min。5.4 超声波清洗机。6 试验步骤6.1 阴性样品未添加五种磺胺类药物的样品。6.2 提取取试样1 g（准确至0.01 g），置离心管中，加10 mL甲醇，提取5 min，5 000 r/min离心10 min，取上清液，逐级稀释10 000倍，用滤膜（4.9）过滤，得UPLC-MS/MS供试品溶液，待测。6.3 仪器参考条件6.3.1 高效液相色谱参考条件色谱柱：C18，50 mm2.1 mm，粒径1.7 m，或性能相当者。流动相A：0.1 %甲酸水溶液。流动相B：0.1 %甲酸乙腈。流速：0.25 mL/min。进样量：10 L。柱温：35 。液相色谱梯度洗脱条件见表1。表1 液相色谱梯度洗脱条件时间minA%B%090104.055454.290105.090106.3.2 质谱参考条件扫描模式：电喷雾正离子（ESI+）。毛细管电压：3 kv。离子源温度：105 。脱溶剂温度：350 。脱溶剂氮气流速：500 L/h。采集方式：多反应监测（MRM）。磺胺类药物的定性、定量离子见表2。表2 五种磺胺的定性离子对、定量离子对、锥孔电压和碰撞能量品名定量离子对定性离子对锥孔电压V碰撞能量V保留时间min磺胺嘧啶251155.5251155.5251107.52715231.45磺胺二甲嘧啶279185.6279185.6279123.63218282.03磺胺间甲氧嘧啶281155.5281155.5281107.52817242.40磺胺甲基异恶唑254155.5254155.5254107.52515232.77磺胺喹噁啉301.1155.8301.1155.8301.1107.83020203.366.4 测定6.4.1 定性测定通过样品溶液色谱图的保留时间与相应标准溶液的保留时间、各色谱峰的特征离子与相应标准溶液各色谱峰的特征离子相对照定性。样品溶液与标准溶液保留时间的相对偏差不大于2.5 %；样品溶液特征离子的相对离子丰度与标准溶液的相对离子丰度一致，相对离子丰度偏差不超过表3的规定，则可判断样品中存在磺胺类药物。表3 定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度（%）5020至5010至2010允许的相对偏差（%）202530506.4.2 定量测定取样品溶液和对照溶液各10 L注入液相色谱串联质谱仪，在上述色谱-质谱条件下进行测定，记录质量色谱图，外标法定量。典型的磺胺类药物标准溶液中特征离子的质量色谱图参见附录A。7 试验数据处理样品中磺胺类药物的含量按下式计算：(1)式中：X 试样中磺胺类药物的含量，单位为毫克每克（mg/g）；C 试样溶液中磺胺类浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；V1 试样溶液总体积（按6.2描述为100 000，经三次稀释10100100=100 000），单位 为毫升（mL）；m 试样的取样量，单位为克（g）；1000 000 用于单位换算。测定结果用平行测定的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。8 精密度在重复性条件下两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15 %。AA附录A （资料性附录）磺胺类药物特征离子参考质量色谱图图A.1 10 ng/mL磺胺类药物对照溶液特征离子参考质量色谱图_