医学分子生物学复习重点.doc

1 分子生物学需要掌握的重点 一、 DNA、RNA、蛋白质、质粒、基因、端粒、聚合酶、密码子、突变、变性 的概念或结构、性质及特点； 二、 复制、转录、逆转录、翻译、加工修饰、靶向输送的主要过程及特点； 三、 癌基因的概念、原癌基因产物的类型及细胞定位、癌基因活化致癌的主 要机制； 四、 常用分子生物学技术的原理、主要步骤、酶学及特点； 五、 基因表及其调控的原理、主要过程或步骤，乳糖操纵子的正、负调节机 制； 六、 常用的基因诊断及基因治疗技术； 七、 基因克隆、基因诊断、基因治疗、管家基因、抑癌基因、Klenow 片段、 核蛋白体、限制性内切核酸酶、人类基因组计划、原位杂交的概念； 八、 双脱氧末端终止法 DNA 测序、重组 DNA 技术的主要步骤； 九、 结构基因、顺式作用元件、启动子、遗传密码、反式作用因子、氨基酰- tRNA、基因组文库、DNA 多态性、转位因子、探针、Tm 值、DNA 微阵列、 DNA 甲基化的概念、性质； 十、 核酸分子杂交的主要类型、PCR 的主要步骤及引物设计； 十一、 DNA、RNA 及多肽链的合成方向； 十二、 真核细胞转染的基本方法； 十三、 细胞周期的主要调控点； 十四、 DNA 损伤及修复的主要类型和机制； 十五、 基因文库筛选的主要方法及原理。 名词解释 质粒是细菌细胞内携带的染色体外的 DNA 分子，是共价闭合的环状 DNA 分子，能独立进行复制。质粒只有在宿主细胞内才能够完成自己的复制。 基因指贮存有功能的蛋白质多肽链或 RNA 序列及表达这些信息所需的 全部核苷酸序列，是核酸分子中贮存遗传信息的遗传单位。 癌基因是细胞内控制细胞生长和分化的基因，具有潜在的诱导细胞恶 性转化的特性，它的结构异常或表达异常，可以引起细胞癌变。 基因克隆是指把一个生物体的遗传信息（基因片段）转入另一个生物 2 体内进行无性繁殖，得到一群完全相同的基因片段，又称 DNA 克隆。 抑癌基因是指存在于正常细胞内的一大类可抑制细胞生长并具有潜在 抑癌作用的基因，当这类基因在发生突变、缺失或失活时可引起细胞恶性 转化而导致肿瘤发生。 基因诊断是以 DNA 和 RNA 为诊断材料，通过检查基因的存在、缺陷或 表达异常，对人体状态和疾病作出诊断的方法和过程。 管家基因是在生命过程都是必需的，是在一个生物个体的几乎所有细 胞中持续表达的基因，它较少受环境因素的影响，其表达方式为组成性基 因表达。 klenow 片段亦称 DNA 聚合酶 1 大片段，为 DNA 聚合酶 I 经枯草杆菌蛋 白酶裂解后产生的大片段，它除了保留 53聚合酶活性及 35外 切酶活性外，失去了 53外切酶活性，它具有的 35外切酶活性 能保证 DNA 复制的准确性，把 DNA 合成过程中错误配对的碱基去除，再把 正确的核苷酸接上去。 核蛋白体系 tRNA 与蛋白质结合生成的一种复合体，是蛋白质生物合成 的场所。 限制性内切核酸酶能识别 DNA 的特异序列，并在识别位点或其附近切 割双链 DNA 的一类内切核酸酶，是基因克隆中最重要的工具酶，通常所说 的限制酶是指 2 型酶。主要从原核细胞中提取，大多数限制性内切酶是错 位切割双链 DNA，产生粘性末端，部分酶则沿对称轴切割 DNA 而产生平端。 Tm 值DNA 变性是在一个相当窄的温度范围内完成的，在这一范围内， 紫外吸收值达到最大值的 50%时的温度称为 DNA 的解链温度，又称融解温度 （Tm），其大小与 G+C 含量成正比。或:双链 DNA 变性一半所需要的温度叫 DNA 的融解温度. DNA 的甲基化是指 DNA 的一级结构中，有一些碱基可以通过加上一个甲 基而被修饰，其作用是对自身 DNA 产生保护作用。 原位杂交是核酸保持在细胞或组织切片中，经适当方法处理细胞或组 织后，将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交的方法。 DNA 微陈列系直接将大量 DNA 探针以显微打印的方式有序地固化于支持 物表面所组成的微陈列（基因芯片）称为 DNA 微陈列。. 顺序作用元件是指那些与结构基因表达调控相关，能被基因调控蛋白 异性识别和结合的 DNA 序列,抱括启动子.上游启动子元件.增强子.加尾信 号和一些反应元件。 转位因子是指能够在一个 DNA 分子内或 2 个 DNA 分子之间移动的 DNA 片 段。 基因治疗-是指通过在特定靶细胞中表达该细胞本来不表达的基因，或采 用特定方式关闭和抑制异常表达基因，达到治疗疾病目的的治疗方法。 3 综合内容 DNA 的结构、性质及特点 一级结构是指 DNA 分子中核苷酸的排列顺序，二级结构是指两条 DNA 单链形成的双 螺旋结构、三股螺旋结构和四股螺旋结构；三级结构是指双链 DNA 进一步扭曲盘旋形 成的超螺旋结构。DNA 一级结构的基本特点：4 种脱氧核糖核苷酸以 3，5磷 酸二酯键相连，形成长链，链中的脱氧核糖和磷酸都是相同的。组成 DNA 的碱基有腺 嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）和胸腺嘧啶（T）。DNA 是由两条单链结合 在一起形成的双链分子，两条单链都是由 A、T、G、C 以千变万化的排列组合而形成的。 大多数生物的遗传信息都是储存在 DNA 分子中。DNA 分子主要携带两类遗传信息， 即有功能活性的 DNA 序列所携带的信息和调控信息。DNA 二级结构是指 DNA 的双螺 旋结构，其特点为：脱氧核糖与磷酸交替排列构成了 DNA 主链；两条脱氧核苷酸链是 反向平行排列，一条是 53方向，另一条为 35方向；以右手方向盘绕成双 螺旋构型；A 配 T，G 配 C。生物体的闭环 DNA 都以超螺旋形式存在，如细菌质粒、 一些病毒、线粒体的 DNA 等。 RNA 的结构、功能、特点 由 4 种基本的核苷酸以 3，5-磷酸二酯键连接而成的长链，碱基中没有 T， 而为尿嘧啶（U）。分为 mRNA（信使 RNA），tRNA（转 RNA，转运氨基酸）和核 蛋白体 RNA（rRNA）。mRNA 结构特点：不稳定、代谢活跃，更新迅速，寿命短。 原核生物 mRNA 具有操纵子结构，主要是多顺反子，mRNA5端无帽子结构，3端 一般无多聚 A 尾巴，没有修饰碱基；真核 mRNA5端有帽子结构、3端大多有多 聚腺苷酸尾巴、分子中可能有修饰碱基，主要有甲基化、有编码区和非编码区。 tRNA 的结构特点及作用：作用：在蛋白质合成过程转运氨基酸，参与蛋白质的翻 译。一级结构含有稀有碱基如 DHU，3端为 3 个同样的核苷酸序列（CCA）序列， 此序列是 tRNA 结合和转运安基酸而生成氨酰 tRNA 所必需的。5端为 G、具有 TC；二级结构为三叶草形，三级结构为倒 L 形； C、rRNA 即核蛋白体 RNA：为 细胞内含量最丰富的 RNA，约占细胞总 RNA 的 80%以上,参与组成核蛋白体，作为 蛋白质生物合成的场所。原核生物核糖体的沉降系数为 70S，由 50S 和 30S 两个 大小亚基组成，30S 小亚基含 16SrRNA 和 21 种蛋白质,50S 大亚基含 23S 和 5SrRNA 以及 34 种蛋白质；真核生物细胞核糖体的沉降系数为 80S，由大小亚基组 成，40S 小亚基含 18SrRNA 及 30 多种蛋白质，60S 大亚基含 3 种 rRNA(28S.5.8S.5S)以及大约 45 种蛋白质。hnRNA 即核内不均-RNA，为真核生 物转录生成的 mRNA 前体。SnRNA 即小分子核内 RNA，不单独存在，常与多种特 异的蛋白质结合在一起，形成小分子核内核蛋白颗粒，在 mRNA 的剪接中起重要作 用。反义 RNA，又称调节 RNA，主要封闭 RNA。 参与蛋白质合成的氨基酸在特异的氨基酰 tRNA 合成酶催化下，与其相应的 tRNA 结合 成氨基酰tRNA。真核生物起始 tRNA 结合的氨基酸为蛋氨酸，结合形成 Met- 4 tRNAimet，翻译起始时首先与 40S 核糖体小亚基结合形成复合物。原核生物的起始氨基 酸为甲酰化蛋氨酸，结合形成 fMet-tRNAffmet。导致 DNA 变性的常用方法有热变性、碱 变性和化学试剂变性。DNA 变性的结果：粘性降低，密度增加，A260 紫外吸收值增加。 蛋白质的结构、功能特点 蛋白质又称为“功能分子”，根据功能分为结构蛋白、活性蛋白和信息蛋白。蛋白 质的一级结构是指蛋白质多肽链中氨基酸排列的顺序。蛋白质一级结构发生改变，可 以使蛋白质的功能发生改变，严重时可导致疾病的发生。因基因突变而导致的蛋白 质一级结构改变后表现出生理功能的异常，使机体出现病态现象，称为分子病。蛋 白质的二级结构单元（形式）有 a-螺旋、-折叠、-转角、无规则卷曲。一级结构 的化学键是肽键及二硫键；二级结构主要化学键为氢键；三级结构的主要靠疏水作用、 离子键、氢键和范得华力等；四级结构的结合力主要是疏水作用、氢键和离子键。 端粒的主要特点和功能：特点为：位于真核生物染色体末端、端粒酶催化端粒 DNA 延 长、在决定细胞寿命中起重要作用、含短的高度重复序列。其主要功能有：保护线性 DNA 的完整复制、保护染色体末端、决定细胞的寿命。 DNA 聚合酶（DNApol） 作用是催化 DNA 合成，其活性需要 Mg2+的存在。大肠杆菌 DNA 聚合酶有 I-II、II3 种（即原核生物 DNA 聚合酶）。DNApolI 的功能有：a、聚合作用，使 DNA 链沿 53方向延伸，b、35外切酶活性，即能从 DNA 链 3端开始沿 35进 行水解反应，产生 5单核苷酸，纠正复制过程中的错误，保证 DNA 复制的正确性， 因而具有校对功能；C、53外切酶活性，参与 RNA 生物的切除、填补冈崎片段间 的空隙以及 DNA 损伤的修复。DNApolII：具有 53DNA 聚合酶活性及 35 外切核酸酶活性，可能参与 DNA 损伤的应急状态修复。DNApolII： 亚基具有催化 合成 DNA 的功能； 亚基具有 35外切酶活性及编辑和校对功能， 则为装配 所必需，是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。DNA 聚合酶的共同性质是：需 要 DNA 模板；RNA 或 DNA 作为引物；ATP 与 Mg2+的参与；以 dNTP 作底物；DNA 合成的 方向是 53。反应特点：新生链的延伸方向为 53；半保留方式合成子代 DNA 双链；反应需要 DNA 引物。共同具有的酶活性：53聚合酶活性；35核酸外切 酶活性。 RNA 聚合酶 RNA 聚合酶也称依赖 DNA 的 RNA 聚合酶，能以 DNA 为模板，四种核苷三磷酸为底物， 按照碱基配对原则，从 53方向延长 RNA 链。原核生物的 RNA 聚合酶只有一种， 是由四种亚基 2 组成的五聚体蛋白质，称为全酶。去掉 亚基后，剩下的 2称为核心酶。活细胞的转录起始，需要全酶；而核心酶负责催化 RNA 链的延 伸。 真核生物 RNA 聚合酶有三种，即 RNA 聚合酶 I、II、III。RNA 聚合酶 I 定位在 核仁，主要转录 5.8S、18S、28S-rRNA 基因；酶 II 定位在核浆，主要转录编码蛋白质 的基因，即主要转录产生 mRNA；酶 III 定位在核浆，主要转录 tRNA 和 5S-rRNA 基因。 RNA 聚合酶催化聚合反应时需要有 Mg2+或 Mn2+的存在，无 35外切酶海性，无 5 校对功能。 密码子分为起始密码和终止密码，起始密码为 AUG，终止密码为 UAA、UAG 和 UGA，共 有 64 种不同的密码。可作为原核生物起始密码的是：AUG.GUG.UUG。 遗传密码具有以下特点： 连续性：两个密码子之间没有任何核苷酸加以分隔，即密码是无标点的。B、方向 性：mRNA 中密码子的排列是有方向性的，即起始密码子总是位于编码区 5末端， 而终止密码子位于 3末端。每个密码子的三个核苷酸也是 53方向阅读， 不能倒读。C、简并性：是指遗传密码中除色氨酸和甲硫氨酸仅有一个密码子外， 其余氨基酸有 26 个密码子为其编码。D、通用性：从最简单的病毒、原核生物、 直至人类，都使用同一套遗传密码。E、摆动性：翻译过程中，氨基酸的正确加入， 要靠 mRNA 上的密码子与 tRNA 上的反密码子相辩认。密码子与反密码子配对辩认 时，有时不完全遵守碱基互补规律，即使不严格互补也能辩认配对，这种现象称 为摆动。 转录的过程及特点 转录是以 DNA 为模板，以 4 种 NTP 为原料，依碱基配对规律，在 DNA 指导的 RNA 聚 合酶催化下合成 RNA 的过程，其过程包括：起始、延长和终止三个阶段。转录的特 点：A、对于一个基因组来说，转录只发生在一部分基因，而且每个基因的转录都受到 相对独立的控制。B、转录是不对称的。C、转录时不需要引物，而且 RNA 链的合成是 连续的。D、转录的单向性，即 RNA 生物合成时，只能向一个方向进行聚合，所依赖的 模板 DNA 链的方向为 35，而 RNA 链的合成方向为 53。E、有特定的起始 和终止位点。参与转录终止的因素为 因子或转录产物的 3端发夹结构,转录终止的 修饰点:AATAAA+GT 序列。 原核生物 DNA 复制的过程及特点 复制过程包括：起始（复制起始位点识别、解螺旋酶解开 DNA 双链，引发体合成 RNA 引物）延伸（DNA 聚合酶催化聚合反应，连续合成前导链，不连续合成随从链）。 终止（RNA 引物去除、冈崎片段连接、在特殊的终止结构区域停止）。复制的共同 特点为：半保留复制和半不连续复制、聚合反应都需要模板、底物、DNA 聚合酶及其 它酶和蛋白质。 真核生物染色体 DNA 复制的特点：（原核相反） 复制起始点为多个；复制叉移动速度慢；复制方向大多数为双向；RNA 引物 短；冈崎片段短，不可连续复制 翻译的主要过程及特点 起始：形成翻译起始复合物延长：指每加一个氨基酸经过进位、成肽和转位，使 肽链从 N 端向 C 端延长。终止（当 mRNA 分子中的终止密码子出现后，多肽链合成停 止，肽链从肽酰-tRNA 中释出，mRNA、核蛋白体等分离）。蛋白制合成是一个耗能过 程，每生成一个肽键，要消耗 2 个高能磷酸键，氨基酸活化要消耗 2 个高能磷酸键， 整个过程可能多于 4 个高能磷酸键。14、原核生物 mRNA 的加工：转录产物 mRNA 分子 不需加工。tRNA 结构基因的初级转录产物需要加工，才能成为具有生物功能的成熟分 6 子。tRNA 前体的加工包括剪切作用（切除多余核苷酸）、添加和修复 3端 CCA 序列， 某些碱基的化学修饰（成熟 tRNA 分子中有稀有碱基）。 翻译后的加工修饰： 加工包括：A、去掉 N-甲酰基、N-蛋氨酸或 N 端序列。B、个别氨基酸的修饰（羟化、 磷酸化形成-S-S-等）。C、多蛋白水解修饰，D、分子伴侣，蛋白质二硫键异构酶，肽 -脯氨酰顺反异构酶辅助折叠成空间构象。E、亚基聚合，F、辅基的结合（糖基化等）。 其中 A、B、C 属一级结构修饰，D、E、F 属空间结构修饰。多肽链形成后，氨基酸 残基可进行多种共价修饰，包括；磷酸化，羟基化，ADP-核糖基化，形成胱氨酸及乙 酰化。翻译过程涉及多种分子之间的相互作用，可以归纳为：RNA-蛋白质相互作用， 蛋白质-蛋白质相互作用及 RNA-RNA 相互作用。参与翻译终止的蛋白质因子包括： RF、PR、IF。广义的核蛋白体循环包括：翻译起始，进位，成肽，转位和翻译终止。 真核生物 mRNA 的加工包括： 5端加帽（由加帽酶催化 5端加入 7-甲苷乌苷酸，形成帽子结构 m7GpppmNP-）。 3端加入 Poly(A)尾（A、组蛋白的成熟 mRNA 无需加 polyA 尾；B、加尾信号包括 AAUAAA 和富含 GU 的序列；C、加尾不需模板；D 剪切过程需要多种蛋白质因子的辅助） 。mRNA 前体的剪接（剪接加工以除去内含子序列，并将外显子序列连接成为成熟的 有功能的 mRNA 分子。内含子两端的结构通常是 5-GUAG-3。选择性剪接的作 用机制包括；A 使用不同的剪接位点，B 选择使用外显子，C、反式剪接，D、使用不同 的启动子，E、使用不同的多腺苷酸化位点）。RNA 的编辑（发生于转录后水平，改 编 mRNA 序列，CU 或 AG，增加遗传信息容量）。 基因表达是指生物基因组中结构基因所携带的遗传信息经过转录、翻译等一系列过程， 合成特定的蛋白质，进而发挥特定的生物学功能和生物学效应的全过程。但并非所有 基因表达过程都产生蛋白质，tRNA、rRNA 编码基因转录生成 RNA 的过程也属于基因表 达。基因表达受到多级水平的调控，具有阶段特异性（时间特异性）和组织特异性 （空间特异性）。基因表达分为几个阶段：基因活化、转录、转录后加工、翻译、翻 译后加工等、产物是 RNA 和有功能的蛋白质。 原核生物基因表达调控的环节，主要在转录水平，其次是翻译水平。原核生物基因多 以操纵子的形式存在，转录水平的调控涉及到启动子、 因子（能与 RNA 聚合酶结合） 、阻遏蛋白(负调控)、正调控蛋白、倒位蛋白、RNA 聚合酶抑制物、衰减子等多种因 素。而翻译水平的调控涉及到 SD 序列（位于 AUG 前）、mRNA 的稳定性（不稳定，其 5端和 3端的发夹结构可保护其不被酶水解，mRNA 的 5端与核糖体结合，可明显 提高其稳定性）、翻译产物及小分子 RNA 的调控作用。 真核生物基因表达的调控环节较多，在 DNA 水平可通过染色体丢失，基因扩增、基因 重排、DNA 甲基化以及染色体结构改变影响基因表达，在转录水平则主要通过反式作 用因子的作用调控转录因子与 TATA 盒的结合、RNA 聚合酶与转录因子-DNA 复合物的结 合及转录起始复合物的形成；在转录后水平主要通过 RNA 修饰、剪接及 mRNA 运输的控 制来影响基因表达；影响翻译水平的因素有影响起始翻译的阻遏蛋白、5AUG、5端 7 非编码区的长度、mRNA 的稳定性调节及小分子 RNA 等。真核基因调控中最重要的环节 是基因转录，真核生物基因表达需要转录因子、启动子、沉默子和增强子。 反式作用因子：指能直接或间接辨认和结合转录上游区段 DNA 的蛋白质，其主要特点 包括三个功能结构域（DNA 识别结合域、转录活性域、结合其它蛋白的结合域）、能 识别并结合上游调控区的顺式作用元件、对基因表达有正性和负性调控作用。其活性 调节方式：表达式调节，共价修饰，配体结合及蛋白质-蛋白质相互作用。作用方式: 成环、扭曲、滑动、Oozing。DNA 结构域包括：锌指、螺旋转角螺旋、亮氨酸拉 链和螺旋环螺旋。转录激活域富含：酸性氨基酸、脯氨酸和谷氨酰胺。 参与 DNA 复制（合成）的物质包括： 模板（解开成单链的 DNA 母链）。引物（提供 3OH 未端使 dNTP 可以依次 聚合）。底物（dATP，dGTP，dCTP 和 dTTP）。聚合酶（依赖 DNA 的 DNA 聚合 酶（DNApol）。其它的酶和蛋白质因子。DNA 复制的基本过程包括：DNA 双链解开，RNA 引物的合成，DNA 链的延长，切除引物，填补缺口，连接相 邻 DNA 片段，切除和修复错配碱基。 结构基因突变的类型包括点突变、缺失、插入和倒位四类，遗传密码的改变分为错义 突变、无义突变、同义突变和移码突变。 癌基因恶性激活的机制包括：原癌基因点突变，原癌基因获得外源启动子而激活， 原癌基因因甲基化程度降低而激活，基因易位或重排使原癌基因激活。 逆转录病毒载体是基因治疗中最常用的载体。造血肝细胞是基因治疗中最重要的靶细 胞，禁用生殖细胞。基因转移技术(基因治疗技术)包括生物学方法和非生物学方法:生 物学方法有:逆转录病毒载体.腺病毒载体.腺相关病毒载体.单纯疱疹病毒载体;非生物 学方法有：脂质体、直接注射、受体介导基因转移技术、DNA磷酸钙沉淀法、电穿孔 法、显微注射、颗粒轰击。 DNA 甲基化的一个特点是它们经过细胞许多代分裂之后仍保持稳定。在真核生物 DNA 中，几乎所有甲基化均发生于二核苷酸序列 5mCG3上。 一个基因所包括的序列有：编码蛋白质肽链或 RNA 的核酸序列、保证转录所必需的调 控序列、位于编码区 5端上游的非编码序列、内含子、位于编码区 3端下游的非编 码序列。 启动子是 RNA 聚合酶特异性识别和结合的 DNA 序列,启动子具有方向性，真核生物的启 动子必须与转录因子结合后，才能被 DNA 聚合酶识别和结合，真核生物的启动子元件 是 TATA 盖,TATA 盒的核心序列是 TATA(A/T)A(A/T)，位于转录起始点上游25bp 处, 启动子决定转录方向.模板链及转录效率。上游启动子元件包括：CAAT 盒，CACA 盒和 GC 盒。 逆转录：是指以 RNA 为模板，利用宿主细胞中 4 种 dNTP 为原料，在引物的 3端以 53方向合成与 RNA 互补的 DNA 链的过程，此过程与中心法则方向相反，故称为逆 转录。 原癌基因产物的类型及细胞定位 生长因子及其类似物，由细胞分泌，如 C-sis 家族 （sis 编码血小板源生长因子， 8 表达产物与 PDGF 链结构同源）。跨膜生长因子受体型的酪氨酸蛋白激酶，如 erb-B,表 皮细胞生长因子（EGF）受体；fims,巨噬细胞集落刺激因子受体；定位于质膜。细 胞内信号传导分子，定位于胞夜,包括 A、低分子量 G 蛋白，如 H-ras 等基因表达产物； B、胞内蛋白激酶（包括与膜结合的蛋白酪氨酸激酶和胞浆丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶）， 如 src、abl。核内转录因子：如 myc、fos 等，定位于细胞核内。胞浆调节蛋白， 如 crk 的产物是存在于胞浆中的调节蛋白，定位于胞浆。可溶性蛋白酪氨酸激酶受 体和非蛋白激酶受。 细胞周期的主要调控点 细胞周期的运行受多种因素所调控，有 2 个主要调控点，亦称为检测点。 G 1/S 期 检测点：在酵母中称起点，在哺乳细胞中称限制点,是控制细胞进入 S 期检测点（G1 期检测点）,cyclinB 与 CDK4 和 CDK6 结合，cyclinE 与 CDK2，CDK3 结合，通过磷酸化 使它们活化。cyclin-CDK 复合物可使 Rb 蛋白磷酸化，从而释放转录因子 E2F，促进 DNA 复制相关基因的表达。CDK2 也可和 cyclinA、cyclinA1 结合，促进早 S 期 DNA 合 成的起始。 G 2/M 期检测点：是控制细胞进入 M 期检测点（G 2期检测点），促有丝 分裂因子（MPF）由 cyclinB 和 CDK1 组成，是启动有丝分裂的关键因子。细胞何时进 入 M 期取决于 Cdc2 的磷酸化状态。 真核细胞转染的基本方法： 磷酸钙沉淀法。电穿孔法。脂质体介导的基因导入法。DEAE-葡聚糖法。显 微注射法。 DNA 损伤的主要类型 碱基和糖基破坏错配DNA 链断裂：电离辐射致 DNA 损伤的主要形式DNA 变联。 上述 DNA 损伤可导致 DNA 模板发生碱基的置换、插入、缺失、链的断裂，并可影响到 染色体的高级结构。DNA 链中一种嘌呤被另一种嘌呤取代，或嘧啶被另一种嘧啶所取 代，称为转换；嘌呤被嘧呤取代，或反之，称为颠换；转换和颠换在 DNA 复制时可引 起碱基错配，导致基因突变；碱基的插入和缺失可引起移码突变。 DNA 修复机制的主要类型 光修复；切除修复；重组修复；SOS 修复；错配修复。 基因文库筛选的主要方法及原理 根据抗药性标志筛选：对于带有某种抗药性标志基因，只有转化成功的受体 菌才可能在含该抗生素的培养基中生存并形成菌落；而没有转化成功的受体 菌，不能在培养基中生长，以此可选择阳性菌。(2)根据菌落的呈色反应筛选 （互补、蓝-白筛选）：根椐菌落的颜色并结合插入片段的序列测定筛选。(3)营 养缺陷型标记法:(4)核酸分子杂交法：即采用与目的基因部分互补的 DNA 片 段作为探针，与含有重组体的细菌菌落进行杂交，以确定重组体中带目的基 因。包括原位杂交和 southern 印迹杂交。（5）遗传互补法：载体上的营养 代谢标记可以对宿主细胞的营养代谢缺陷进行互补，以此作为筛选重组体的 标记。（6）免疫学方法：如果克隆基因的产物是已知的，并且在菌落或噬菌 斑中表达，因而可以用相应的抗血清或单克隆抗体，通过放射免疫、化学发 9 光或显色反应进行筛选。 PCR 的主要步骤及引物设计的基本要求 PCR 的主要步骤：PCR 又称聚合酶链式反应，是在体外进行的 DNA 复制反应过程。其 基本过程包括：A、双链 DNA 模板加热变性成单链(变性),温度 95 度左右。B、在低温 下引物与单链 DNA 互补配对(退火),85-90 度。C、延伸：在四种 DNTP 底物及 Mg2+存在 条件下，TaqDNA 聚合酶在最适作用温度（7075）下，根据碱基互补配对原则，从 特异结合到 DNA 模板上的引物 3-OH 端开始掺入单核苷酸，合成新的 DNA 分子。引 物设计的基本要求：A、引物长度一般为 1530 个核苷酸。B、引物中的碱基组成尽可 能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶碱基堆积现象，尤其在 3端避免连续 3 个 G 或 C。C、引物自身不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构，引物自身存在的连续互补 序列，一般不超过 3bp。D、两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免 3端的互 补重叠。E、引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过 70%，引物 3末端连续 8 个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列。F、引物与模板结合时，引物的 5端可 以修饰。 乳糖操纵子的正、负调节机制 乳糖操纵子包含 3 个结构基因 Z.Y.A（编码 -半乳糖苷酶，-半乳糖苷通透酶 和转乙酰基酶）、3 个调控元件（启动子、操纵基因和 CAP 结合位点）和 1 个调 节基因（编码阻遏蛋白）。乳糖操纵子的转录起始是由 CAP 和阻遏蛋白两种调控 因子来调控的。（1）阻遏蛋白的负调控：无乳糖时，阻遏蛋白结合操纵基因，妨 碍 RNA 聚合酶结合启动子，从而抑制结构基因转录。有乳糖时，生成半乳糖（诱 导剂）结合阻遏蛋白，使阻遏蛋白构象改变，变构的阻遏蛋白不能与操纵序列结 合，阻遏机制解除，结构基因可以转录，基因得以表达。cAMP-CAP 复合物的正 调控:无葡萄糖时，cAMP 浓度高，形成的 cAMP-CAP 复合物结合于 CAP 结合位点， 增强启动子转录活性，促进下游基因得以表达；有葡萄糖时，cAMP 浓度低， cAMP-CAP 复合物形成受阻，影响转录活性。正、负调控机制相辅相成：cAMP- CAP 复合物是转录必需的，同时阻遏蛋白进一步控制转录启动。综上，乳糖操纵 子最强的表达条件是有乳糖而无葡萄糖。 双脱氧末端终止法 DNA 测序的主要步骤：双脱氧末端终止法是以单链或双链 DNA 为模 板，采用 DNA 引物引导新生 DNA 的合成，又称为引物合成法，或酶促引物合成法。其 主要步骤为：制备单链模板。模板与测序引物结合。掺入法标记反应。延伸- 终止反应。 变性胶电泳。放射自显影。阅读测序结果。 常用的分子生物学技术的原理、过程及特点 核酸分子杂交技术：基本原理是：具有互补序列的两条单链核酸分子在一定条件下 碱基互补配对结合，重新形成双链；在这一过程中，核酸分子经历了变性和复性的变 化，以及复性过程中各分子间键的形成和断裂等。特点：直接检测血清中病毒基因组， 无须扩增，灵敏度较 PCR 低。在杂交体系中已知的核酸序列称作探针。 聚合酶链反应（PCR）：PCR 的原理是根据待测 DNA 片段两端的核苷酸序列，设计并 人工合成两个分别与 DNA 片段两端互补的寡聚核苷酸引物，在有过量的引物、过量的 10 底物（4 种 dNTP）、DNA 聚合酶以及模板（待扩增片段的 DNA 分子）的反应体系中， 经过高温变性（使 DNA 链解开）、低温退火（使引物与模板结合）和适温延伸（新合 成的 DNA 片段）三个阶段的循环周期，对 DNA 分子进行扩增。特点:极强的扩增能力, 度高灵敏性,高度特异性，只需微量模板,只需数小时,扩增产物量大,变性.复性.延伸 三个步聚循环进行,操作简便，适用广泛，但可出现假阳性. DNA 序列测定：DNA 序列测定是在高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的基础上建 立起来的，包括 Sanger 双脱氧链末端终止法和化学降解法。Sanger 法的基本原理是： 双脱氧核苷酸（ddNTP）在 DNA 合成过程中代替相应的脱氧核苷酸（dNTP）作为底物， 不能形成 3，5-磷酸二酯键而导致链延伸终止。化学降解法：是采用化学试剂处 理末端放射性标记的 DNA 单链片段，造成碱基特异性切割，由此产生一组具有不同长 度的 DNA 链的反应混合物，经凝胶电泳按分子大小分离和放射自显影，直接读出待测 DNA 的核苷酸顺序。 DNA 芯片技术：DNA 芯片技术是一种大规模集成的固相核酸分子杂交，以大量已知碱 基序列的寡核苷酸片段为探针，检测样品中哪些核酸序列与其互补，然后通过定性、 定量分析得出待测样品的基因序列及表达的信息。DNA 芯片的主要技术流程包括：芯 片的设计与制备、靶基因的标记（常用荧光色素.生物素或放射性核素标记 dNTP）、 芯片杂交与杂交信号检测。特点：高通量.鉴别诊断。酶：DNA 聚合酶。所需探针：合 成的寡核苷酸片段，cDNA，已克隆的基因片段，双链或单链 DNA 或 RNA，肽核酸。 基因克隆技术（重组 DNA 技术）：基因克隆是指某种目的基因的扩增与分离过程， 具体是从基因组或 DNA 大片段中分离并获得某一特定的基因或 DNA 片段，再通过 DNA 序列扩增形成由众多拷贝组成的 DNA 拷贝群体的过程。其基本过程为：A-目的基因的 制备；栽体的选择与制备；B-DNA 分子的体外连接；C-将外源 DNA 导入宿主细胞；D- 目的基因的筛选与鉴定；E-DNA 重组体的扩增与表达 原核生物与真核生物转录调控的特点比较： 两者均涉及 RNA 聚合酶和转录调控序列（启动子等）的相互作用。真核需要多种 转录因子辅助、原核不需要。真核以正调控为主，原核以负调控为主。真核 3 种 RNA 聚合酶负责不同种类基因的转录，原核只有 1 种 RNA 聚合酶。 原核生物和真核生基因表达调控特点的比较。 相同点：转录起始是基因表达调控的关键环节不同点：A、原核基因表达调控 主要包括转录和翻译水平；真核基因表达调控主要包括染色质活化、转录、转录 后加工、翻译、翻译后加工多个层次。B、原核基因表达调控主要为负调节，真核 主要为正调节。C、原核转录起始不需要转录因子，RNA 聚合酶直接结合启动子， 由 因子决定基因表达的特异性；真核转录起始需要基础、特异两类转录因子， 依赖 DNA-蛋白质、蛋白质-蛋白质相互作用，调控转录激活。D、原核基因表达调 控主要采用操纵子模型，转录出多顺反子 RNA，实现协调调节；真核基因转录产 物为单顺反子 RNA，功能相关蛋白质的协调表达机制更为复杂。 质粒的特征： 11 原核细胞中染色体外的共价闭合的环状 DNA 分子。能独立于细胞的染色体而 进行复制，并依赖于宿主细胞。在同一宿主中具有不相容性，即具有相同复制 起始位点和分配区的两种质粒不能共存于一个宿主菌。具有严格的遗传控制系 统（复制调控系统，分配系统，细胞分裂控制系统 ，位点特异重组系统）。其 所携带的遗传信息能赋予宿主细胞特定的遗传性状。是 DNA 重组技术中所使用 的主要载体。作为克隆载体的质粒具有的特点：分子量较小，能在细菌内稳定存 在，有较高的拷贝数；具有一个以上的遗传标志；具有多个限制酶的单一切点， 称为多克隆位点，便于外源基因的插入。 真核生物基因组结构与功能的特点。 每一种真核生物都有一定的染色体数目， 体细胞一般为双倍体。真核基因组 远远大于原核生物的基因组，具有许多复制起点。真核基因组由一个结构基因 与相关的调控区组成，转录产物为单顺反子，即一分子 mRNA 只能翻译一种蛋白质。 真核生物分子含有大量重复顺序。真核生物基因组内非编码的顺序占 90%以 上。真核基因是断裂基因。功能相关的基因构成各种基因家族。真核生物 基因组中也存在一些可移动的遗传因素。 蛋白质生物合成后的靶向输送过程及特点： 蛋白质合成后，定向地被输送到最终发挥生物学功能的部位称为靶向输送。靶向输送 的蛋白质的 N 端往往有一些特异的氨基酸序列，称为信号序列，是决定蛋白质靶向输 送特性的重要元件，通过信号序列引导蛋白质从胞浆进入内质网.线粒体.叶绿体和核 内，靶向不同的蛋白质各有特异的信号序列。分泌型蛋白合成后进入内质网，经加工， 包装成分泌小泡，再转移.融合到靶部位或分泌出细胞，其靶向输送主要靠信号肽与胞 浆中的信号肽识别粒子（SRP）识别并特异结合，然后再通过 SRP 与膜上的对接蛋白 （DP）识别并结合后，将所携带的蛋白质送出细胞；线粒体蛋白的靶向输送靠导肽与 多种蛋白复合体介导进入基质和膜间腔，然后自发的或在分子伴侣 HSP70 帮助下折叠 形成有功能的蛋白质；而细胞核蛋白的靶向输送则通过核定位信号与核输入受体结合 形成核蛋白-受体复合物，被导出核孔，再与核孔复合体结合后进入细胞核。 核酸分子杂交的基本方法包括：Southern 印迹杂交（鉴别 DNA 靶分子的杂交、待测核 酸是 DNA 片段）、Northern 印迹杂交（鉴别 RNA 靶分子、待测核酸是 RNA）、斑点杂 交、原位杂交和液相杂交。 DNA 复制与转录的异同。 相同点：模板是 DNA遵守碱基互补规律新链合成方向为 53催化核苷酸以 磷酸二酯链连接合成部位在细胞核。 不同点：复制的原材料是 dNTP，转录的原料是 NTP复制的主要酶类是 DNA 聚 合酶，转录酶是 RNA 聚合酶复制需要 RNA 引物，转录不需要引物复制的产物 是双链 DNA，转录的产物是单链 RNA复制的模板是 DNA 双链（半保留复制），转 录的模板是 DNA 单链（不对称转录）复制的功能是传递遗传信息给子代 ,转录 是表达信息所需步聚. 双脱氧核苷酸末端终止法 DNA 序列测定中所需要的顺序试剂：M 13载体、dNTP、DNA 聚 12 合酶 I 的 klenow 片段，逆转录酶，TqaDNA 聚合酶（耐热 DNA 聚合酶），经过修饰的 T7 噬菌菌体 DNA 聚合酶，测序酶 2.0 版，双脱氧核苷三磷酸（即 2,3-ddNTP）、 dNTP 类似物，放射性标记的a -32PdNTP。 PCR 体系的主要成分。 引物、TaqDNA 聚合酶、dNTP、模板核酸、缓冲液。 DNA 聚合酶 I 的作用特点： 模板为 DNA，底物为 4 种脱氧核苷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP），Mg 2+参 与，DNA 合成方向为 53，具有 DNA 聚合酶活性，35及 53核酸外 切酶活性，其 53核酸外切酶活性，用于缺口平移法标记 DNA 探针。 基因治疗的方法有两种：体内直接转基因，称为体内法；细胞介导的基因治疗， 称为回体法。基因灭活技术有：反义核酸技术，核酶技术，三链技术，干扰 RNA 技术。人的 DNA 端粒含有 TTAGGG 重复序列。 49.信号肽的特点:能与细胞质中的信号识别颗粒结合,SRP 受体是蛋白质进入内质 网所必需的,N 端一小段富含蔬水氨基酸的序列,翻译的同时引导新生多肽链穿过 内质网. 基因组文库采用限制酶将基因组 DNA 切成片段，每一 DNA 片段都与一个载体分子拼接成 重组 DNA，将全部 DNA 分子都引入宿主细胞并扩增所得到的分子克隆混合体叫基因组文库。 50.基因重组是指 DNA 之间的共价连接.在分子克隆中的克隆是指无性繁殖 DNA。 基因工程中目的基因的来源可以是:化学合成.PCR 合成.细胞 DNA.组织 DNA.cDNA 文库。