基因工程的操作过程.ppt

4基因工程的操作过程,C转化子的筛选和鉴定（检）,B重组DNA分子的转化和扩增（转、增）,ADNA的体外重组（切、接）,4基因工程的操作过程,切,接,转,增,检,ADNA的体外重组（切与接）,4基因工程的操作过程,同种内切酶生产的粘性末端的连接,同尾酶生产的粘性末端的连接,重组率,同种内切酶生产的粘性末端的连接,5,5,EcoRI,退火,G,CTTAA,AATTC,G,G,CTTAA,AATTC,G,T4-DNAligase,5,5,5,5,同尾酶生产的粘性末端的连接,BamHI,5,G,CCTAG,GATCC,G,5,5,5,GATCA,T,5,退火,G,CCTAG,GATCC,G,5,GATCA,T,T4-DNAligase,5,5,BclI,G,CCTAG,GATCC,G,5,GATCA,T,5,5,重组率,重组率的定义,重组率=含有外源DNA的重组分子数/载体分子总数在常规实验条件下，重组率一般为25-75%重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以大大简化DNA重组的后续操作。,重组率,提高重组率的方法,提高外源DNA片段与载体的分子比：5:1-10:1,载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团：,5,5,EcoRI,5,G,CTTAAp,AATTC,G,5p,5,5,AATTC,G,5HO,退火,5,G-A-A-T-T-C,C-T-T-A-AG,5,GA-A-T-T-C,C-T-T-A-A-G,OH,HO,OH,HO,碱性磷酸单酯酶,碱性磷酸单酯酶,B重组DNA分子的转化和扩增（转与增）,4基因工程的操作过程,转化的原理与技术,转化率,转化细胞的扩增,转化的原理与技术,Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化,Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），1970年建立此技术，其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态,转化的原理与技术,Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化,大肠杆菌感受态细胞的制备：,100ml菌体培养至OD600=0.5，离心收集菌体,用10ml冰冷的20mMCaCl2溶液悬浮菌体，离心,用1ml冰冷的100mMCaCl2溶液悬浮菌体,冰浴放置12-24小时，备用,收集菌体,转化的原理与技术,Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化,大肠杆菌感受态细胞的质粒转化：,取100ml感受态细胞，加入相当于50ng载体的重组,冰浴放置半小时,在42保温2分钟（热脉冲）,快速将转化细胞转移至冰浴中放置1-2分钟,DNA连接液，混匀,加入1ml新鲜培养基，于37培养1小时（扩增）,涂在合适的固体培养基平板上进行筛选,转化的原理与技术,细菌原生质体的转化,革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源DNA的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用原生质体（细胞去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组DNA分子,酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进行转化,转化的原理与技术,电穿孔转化,将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大同样的原理，电穿孔法也可用于质粒消除实验,转化率,转化率的定义,转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此转化率的定义也可以表征为：每微克载体DNA转化后，受体细胞接纳DNA的个数，即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不长）,转化率,转化率的定义,例如，pUC18对大肠杆菌的转化率为108，即每微克pUC18中只有108个分子能进入受体细胞。一微克pUC18共有3.4X1011个分子（6.02X1017/2686X660），也就是说，每3400个pUC18分子才有一个分子进入受体细胞另一方面，在实际操作过程中，转化一微克pUC18共需2ml感受态细胞，大约含有2X1010个大肠杆菌细胞，也就是说，每200个细胞只有一个细胞能接纳pUC18DNA,转化率,转化率的用途,利用转化率和重组率等参数可以帮助设计DNA重组实验规模,例如，某一DNA重组实验的重组率为20%，转化率为107/mg载体，,经切接处理后的载体转化率比天然的载体低100倍，欲获得104个,重组克隆，需投入多少载体DNA进行重组实验？,若重组率为100%，则转化后产生104个重组克隆需要：,104/107X10-2=0.1mg载体DNA,考虑到实验系统的重组率为20%，所以实际投入载体应为：,0.1/20%=0.5mg载体DNA,载体投入量确定后，外源DNA的投入量即可按101的要求算,出（5mg），甚至还可以估算需要涂布多少块平板进行筛选,转化率,转化率的影响因素,载体及DNA重组分子方面：,载体本身的性质：,不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同,载体的空间构象：,质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载,体由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的,超螺旋质粒低两个数量级,插入片段的大小：,对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低,转化率,转化率的影响因素,受体细胞方面：,受体细胞必须与载体相匹配，例如：pBR322转化大肠杆菌JM83株，转化率很低；但对大肠杆菌ED8767株的转化率则较高,转化率,转化率的影响因素,转化方法方面：,受体细胞的预处理：影响最大,供受体的比例：,Ca2+诱导转化0.1ml感受态细胞50ngDNA,转化方法：,Ca2+诱导转化106-107/mgDNA,原生质体转化109个原生质体50ngDNA,原生质体转化105-106/mgDNA,l-DNA转染107-108/mgDNA,电穿孔转化106-109/mgDNA,转化细胞的扩增,扩增操作,转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如：Ca2+诱导转化后的37培养一个小时原生质体转化后的再生过程l噬菌体转染后的30培养等，均属扩增操作,转化细胞的扩增,扩增操作的目的,增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序,扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选,表达外源基因，便于筛选和鉴定,C转化子的筛选和鉴定（检）,4基因工程的操作过程,载体遗传标记检测,克隆DNA序列检测,外源基因产物检测,C转化子的筛选和鉴定（检）,4基因工程的操作过程,由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子,转化子,重组子,目的重组子,载体遗传标记检测,抗药性筛选法,ROP,ROI,SalI,BamHI,Tc,r,PvuI,PstI,PstI,EcoRI,ClaI,HindIII,HindII,BalI,Ap,r,抗药性筛选法的基本原理：,pBR322,4363bp,ori,抗药性筛选法可区分转化子与非,转化子、重组子与非重组子,将外源DNA片段插在EcoRI位点：,非重组子呈Apr、Tcr,重组子呈Apr、Tcr,将外源DNA片段插在BamHI位点：,非重组子呈Apr、Tcr,重组子呈Apr、Tcs,载体遗传标记检测,抗药性筛选法,抗药性筛选法的基本操作：,先将转化液涂布含有Ap的平板,再将Ap平板上的转化子影印至,含有Ap和Tc的平板上,在Ap平板上生长、但在Ap和Tc,平板上不长的转化子即为,Ap,Ap+Tc,影印,挑选,重组子,载体遗传标记检测,营养缺陷型筛选法,营养缺陷型筛选法的基本原理：,营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转化子，一般不能区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种营养组份的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组份，将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上，长出的便是转化子,载体遗传标记检测,营养缺陷型筛选法,常见的营养缺陷型筛选标记：,哺乳动物细胞中存在两条dTTP的合成途径：,用于大肠杆菌的营养标记基因常选用色氨酸生物合成基因trp+,用于高等哺乳动物细胞的营养标记基因常使用胸腺嘧啶核苷激,酶基因tk，相应的受体细胞则选择tk-缺陷型,dCDP,dTDP,dTTP,TR,dTMP,dTDP,dTTP,AP,TK,AP氨基喋呤,TK胸腺嘧啶核苷激酶,载体遗传标记检测,显色筛选法,显色筛选法的基本原理：,显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也可区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒pUC18携带的lacZ基因（蓝色反应）、链霉菌质粒pIJ702携带的melC基因（黑色反应）等,载体遗传标记检测,显色筛选法,显色筛选法的基本操作：,pUC18,Ap,r,lacZ,ori,Ap+X-gal,重组子（Apr+lacZ-）,将外源基因克隆在pUC18的lacZ标记基因内部，使之灭活，此时重组子呈Apr、lacZ-，淡黄色菌落；而非重组子则呈Apr、lacZ+，蓝色菌落,克隆DNA序列检测,限制性酶切图谱法,所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源DNA片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，因此利用这种方法不仅能区分重组子与非重组子，而且还能鉴定目的重组子。但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工作量极大，实验成本也高。,克隆DNA序列检测,限制性酶切图谱法,全酶解图谱法：,B,B,E,P,4.0kb,1.0kb,0.8kb,区分重组子与非重组子,用BamHI酶切转化子质粒DNA,电泳观察酶解产物片段,重组子：2.7kb+4.0kb,非重组子：2.7kb,如果外源DNA片段也是2.7kb，最好选用单一切口的酶将质粒线型化，然,后通过其长度来鉴定其是否为重组子,克隆DNA序列检测,限制性酶切图谱法,全酶解图谱法：,S,S,B,P,4.0kb,1.0kb,0.8kb,区分重组子与非重组子,如果外源DNA片段插在pUC18的SphI位点处，原则上也可用SphI酶解鉴定，但这样做很不经济，因为SphI非常昂贵（每100单位50美元）。用HindIII和EcoRI联合酶解同样可以达到目的，但这两种酶的价格只及SphI的1/50,克隆DNA序列检测,限制性酶切图谱法,全酶解图谱法：,B,B,E,P,4.0kb,1.0kb,0.8kb,区分目的重组子与非目的重组子,用EcoRI酶切转化子质粒DNA,目的重组子：3.0kb+3.7kb,或者：1.0kb+5.7kb,用PstI酶切转化子质粒DNA,目的重组子：3.2kb+3.5kb,或者：0.8kb+5.9kb,克隆DNA序列检测,限制性酶切图谱法,全酶解图谱法：,B,B,E,4.0kb,2.0kb,2.0kb,区分目的重组子与非目的重组子,对图示的克隆片段，转化子质粒DNA用EcoRI酶切开后，只出现2.0kb和2.7kb两条带子，实际上2.0kb的条带中含有两种不同的分子,2.7kb,2.0kb,E,克隆DNA序列检测,限制性酶切图谱法,部分酶解图谱法：,该重组质粒经酶解后，分别得到下列几组数据：,BamHI全酶解：0.60.81.83.4kb,BamHI+EcoRI全酶解：0.60.81.81.22.2kb,其中，1.2kb片段的存在表明该片段位于一端,BamHI部分酶解：1.42.64.0kb,其中，1.4kb的片段必为0.6kb和0.8kb两片段，表,明两者是连在一起的；同理，2.6kb的片段必为0.8,kb和1.8kb两片段，表明两者是连在一起的；最后，,4.0kb的片段必为0.6kb和3.4kb两片段，表明两者,是连在一起的,克隆DNA序列检测,菌落噬菌斑原位杂交法,菌落或噬菌斑原位杂交法的工作原理是根据克隆的目的基因或DNA片段的同源序列设计并合成探针，以此搜寻筛选含有目的基因的目的重组子。其中，DNA同源序列之间的特异性互补杂交是该技术的基本理论依据,克隆DNA序列检测,菌落噬菌斑原位杂交法,菌落原位杂交法的基本操作：,影印,用硝酸纤维素薄膜影印克隆平板,洗涤,杂交,感光,用0.4N的NaOH溶液浸泡影印薄膜,用SSC溶液浸泡清洗影印薄膜,80烘干固定影印薄膜,薄膜置于含有探针的杂交溶液中保温,用SSC-SDS液洗涤杂交薄膜,用X光胶片覆盖薄膜感光,克隆DNA序列检测,菌落噬菌斑原位杂交法,杂交探针的制备：,用于菌落或噬菌斑原位杂交的探针必须满足下列条件：,单链结构（双链DNA可用碱变性）,足够长度（至少12个碱基）,内部不含互补区,探针的制备方法或来源包括：,人工合成,cDNA合成,同源序列,mRNA,克隆DNA序列检测,菌落噬菌斑原位杂交法,杂交探针的标记：T4-PNP介导的末端标记,5HO,3HO,OH3,OH5,T4-PNP,Mg2+pppATP（g-32P-ATP）,5p,3HO,OH3,p5,克隆DNA序列检测,菌落噬菌斑原位杂交法,杂交探针的标记：逆转录酶介导的反转录标记,3AAAAAAAAAAACCAGCTTCCGAACTGATTTAGGCT,5mRNA,反转录酶,Mg2+dNTP+pppdATP（a-32P-dATP）,5TTTTTTTTTTT,5mRNA,3cDNA,3AAAAAAAAAAACCAGCTTCCGAACTGATTTAGGCT,5TTTTTTTTTTTGGTCGAAGGCTTGACTAAATCCGA,克隆DNA序列检测,菌落噬菌斑原位杂交法,杂交探针的标记：ABC荧光标记,GCTTGAGCAGTAACCTG,荧光胺,Biotin生物素,Avidin,生物素结合蛋白,烷烃连接臂,克隆DNA序列检测,菌落噬菌斑原位杂交法,杂交探针的标记：ABC显色酶标记,GCTTGAGCAGTAACCTG,显色酶,Biotin生物素,Avidin生物素结合蛋白,烷烃连接臂,生色底物,颜色产物,克隆DNA序列检测,菌落噬菌斑原位杂交法,杂交探针的标记：地高辛系统标记,dUTP-连接臂-甾醇半抗原,digoxigeninDIG,抗体-显色酶交联复合物,克隆DNA序列检测,DNA序列分析法,双脱氧末端终止测序法的基本原理：,DNA序列测定是精确鉴定目的基因的重要手段，目前国际上流行采用Sanger发明的双脱氧末端终止法测定DNA序列，其工作原理是在DNA聚合反应的进程中，通过位点特异性终止测定DNA序列其关键技术有：,DNA链聚合反应时的定点随机中断（ddNTP）,聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨率（600bp/601bp）,电脑自动检测、记录、编辑程序,用于DNA测序的专一性试剂盒（Kit）,克隆DNA序列检测,DNA序列分析法,双脱氧末端终止测序法的基本操作：,DNA聚合反应,聚丙烯酰胺凝胶电泳,克隆DNA序列检测,DNA序列分析法,双脱氧末端终止测序法的基本反应：,Klenow,OH3,5P,T,dNTP+ddATP,T,T,T,T,T,OH3,5P,A,G,T,C,GGCATTGCGTTACTAGTCCAGTACA,外源基因产物检测,蛋白质生物功能测定法,淀粉酶目的基因的鉴定：,淀粉酶能将淀粉水解为多糖或单糖。将难溶,淀粉酶能将淀粉水解为多糖或单糖。将难溶于水,的淀粉加入固体培养基内，培养基呈混浊状。将,待鉴定的重组克隆涂布在此培养基上，含目的基因的目的重组子可,其表达的淀粉酶分泌出胞外，并均匀扩散，同时降解淀粉为可溶性,的多糖或单糖。因此，目的重组子菌落周围会形成透明圈。如果透,明圈不明显，还可往培养板上喷碘，使淀粉所在区域呈蓝色本底，,易于辨认。,蛋白酶、脂肪酶等目的基因也可采用类似的方法进行鉴定,外源基因产物检测,蛋白质生物功能测定法,抗菌素抗性基因的鉴定：,抗菌素抗性基因表达的蛋白质能使受体细胞产生对该抗生素的抗性。据此，只需往培养板中加入适量抗生素，理论上长出的菌落即是含有目的基因的目的重组子在实际操作过程中，由于抗生素有时会诱导受体细胞产生抗性，因此必须从抗性重组克隆中抽出重组质粒，二次转化受体细胞。如果此时转化平板上出现大量的抗性菌落，即可认为这种抗性确由目的基因的编码产物产生,外源基因产物检测,蛋白质生物功能测定法,抗菌素抗性基因的鉴定：,目的重组子,诱导抗性,抽取重组质粒,再次转化,外源基因产物检测,蛋白质生物功能测定法,DNA结合蛋白编码基因的鉴定：,影印,用聚乙烯薄膜影印裂解平板,洗涤,杂交,感光,轻轻漂洗影印薄膜，干燥固定,80烘干固定影印薄膜,与探针溶液中杂交,洗涤、干燥、感光,用氯仿蒸汽或烈性噬菌体喷洒克隆平板,聚乙烯膜,探针选用能与,目标蛋白特异,性结合的DNA,片段,外源基因产物检测,蛋白质生物功能测定法,杂交释放转译鉴定：,合并,变性,挂柱,制备,上样,淋洗,洗脱,翻译,测活,重组DNA,单链DNA,mRNA,杂交的mDNA,蛋白质,蛋白质,无细胞体外翻译系统：麦胚提取物、网织红细胞提取物,外源基因产物检测,蛋白质生物结构鉴定法,放射免疫原位杂交鉴定：,影印,用固定了特异性抗体的聚乙烯薄膜影印,洗涤,与I125标记的IgG保温,感光,轻轻漂洗影印薄膜，干燥固定,与I125标记的IgG保温,洗涤、干燥、感光,用氯仿蒸汽或烈性噬菌体喷洒克隆平板,含抗体的聚乙烯膜,裂解平板,外源基因产物检测,蛋白质生物结构鉴定法,免疫沉淀鉴定：,在琼脂培养基中加入目标蛋白的特异性抗体,然后涂布转化液,37培养,经培养后，目的重组子菌落变会分泌出目标,蛋白，后者与特异性抗体发生免疫沉淀,反应，在菌落周围形成白色的圆斑,此法简便快速，但灵敏度低，抗体消耗量大,外源基因产物检测,聚丙烯酰胺凝胶电泳法,如果待筛选鉴定的目标蛋白既不能测定生物活性，又无现成的抗体使用，则可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行粗略的筛选,