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北京协和医学院博士研究生学位论文112条件性敲除RNFl38基因对小鼠生育力的影响5l2敲除RNFl38基因小鼠及对照小鼠睾丸深度测序分析5221测序样本的验证5222测序组装结果及统计522_3基因结构分析5524SSR分析5625基因表达量分析5726RNASeq整体质量评估5827差异表达分析5928基因功能注释613泛素连接酶RNFl38在同源重组修复通路的功能和机制研究6431RNFl 38可以被招募到DNA损伤部位6532RNFl 38可以通过ATM在Seri24磷酸化一6633RNFl 38积累的DNA损伤位点通过其锌指结构域6934RNFI 38在调控HR修复途径参与7135RNFl 38参与DNA损伤修复7236RNFl38泛素化RAD51D促进同源重组修复744锌指结构CTCF在DNA损伤应答中识别PAR7741前言7742CTCF是DNA损伤反应蛋白可以招募到DNA损伤7743CTCF招募到DNA损伤位点通过PAR介导7944CTCF的ZNF结构域识别PAR8045CTCF招募到DNA损伤位点ZNF46。8246ZNF46 CTCF域识别PAR8447CTCF与PAR结合和与DNA结合的关系研究8648CTCF参与DNA损伤修复8749介导的DNA损伤的DNA损伤反应中表征DNA损伤修复区域的边界89 讨论9l结仑一93参考文献94附录：英汉名词对照102综j盎l 03博士在读期间论文与会议摘要写作情况12l独创性声明l 22学位论文版权使用授权书1 22致谢1 23万方数据北京协和医学院博士研究生学位论文中文摘要精子发生是雄性生殖细胞受高度复杂调控的发育过程，包括三个重要阶段：精 原细胞有丝分裂、精母细胞减数分裂和精子细胞变形。随着核固缩，线粒体重排， 过渡蛋白和鱼精蛋白替换组蛋白，顶体形成等过程，最终形成具备传递父源遗传信 息能力的终末分化生殖细胞成熟精子。小鼠和大鼠高通量基因表达数据表明精子发 生过程需要大量的睾丸特异性表达基因参与调控。据估计在小鼠的基因组中，大约 有4的基因特异表达于精子发生过程的各个阶段。RNFl38，即RING(Really Interesting New Gene)Finger protein 138是本组前期 在精子发生的研究工作中首先发现的含有RING Finger结构域且具有E3泛素连接 酶活性的蛋白质。泛素化是蛋白质翻译后修饰的一种重要方式，由泛素激活酶E1、 泛素结合酶E2和泛素连接酶E3在内的一系列酶促反应协同完成。大量的研究证实， 泛素化修饰除了参与蛋白质降解，还与蛋白激酶的激活、膜泡转运、DNA损伤修 复和染色质重塑等一系列细胞生理过程密切相关。一些哺乳动物睾丸特异性表达的E3泛素连接酶在精子发生的不同阶段执行多种不同的生物学功能。其中一些E3泛 素连接酶以及相关复合物在减数分裂过程早期的DNA双链断裂(DSB)和组蛋白 修饰发挥重要作用。我们检测了不同日龄小鼠睾丸组织RNFl38蛋白质表达水平，结果显示RNFl38 的表达量随睾丸发育阶段的成熟而增加，在第一波生精波(5周)完成时，开始趋 于稳定，显示了其发育阶段表达特异性。免疫组化和免疫荧光结果显示RNFl38在 除精原细胞以外的各级生精细胞的胞浆均有不同程度的表达，尤其在初级精母细胞 表达最高，在这个阶段初级精母细胞开始进入减数第一次分裂，这也提示RNFl38 可能参与生精细胞的早期发育。为了深入研究RNFl38对雄性生殖的功能，我们利用Cre10xP或者FIpFRT同 源重组系统构建了VasaCre条件性基因敲除小鼠动物模型。结合RNFl38基因敲除 动物模型表型分析，与对照组比较发现RNFl38基因条件性敲除小鼠各个发育阶段 的睾丸重量和精子数量显著降低。形态学方面，RNFl38基因敲除后早期的精子发 生过程阻滞，早期部分生精细胞脱落，尤其是精母细胞数量显著减少。TUNEL结 果显示精母细胞凋亡增加。转录组测序被广泛应用于功能基因组学研究中。转录组测序数据可以丰富和验 证基因组数据的注释，同时用于不同样本间基因表达差异、可变剪接等的比较。大 量且快速地充实样本的遗传数据，这些数据资源可有助于深入开展分子生物学机制 研究。因此为了深入研究RNFl38在雄性生殖中的作用机制，我们对条件性RNFl38万方数据北京协和医学院博士研究生学位论文基因敲除小鼠睾丸进行转录组测序。差异表达基因共152个，与对照比较表达上调 基因共73个，表达下调基因共79个。根据RNAseq差异表达基因分析，差异表达基因COG注释显示功能性分类中参与DNA复制，重组和修复的频率最高，这些结果提示RNFl38在DNA损伤修复应答过程中参与重要功能。为了研究RNFl38是否参与DNA损伤应答，我们利用激光损伤细胞发现 RNFl38富集在DNA损伤部位，且与DNA损伤标志y H2AX重叠。对RNFl38进 行动态监视显示RNFl38快速有效招募到激光诱导的DNA损伤位点，而且这一过 程依赖于RNFl38的Zinc finger结构域。我们进一步发现RNFl38是ATM的底物， 可以被ATM在Serl24位点磷酸化。我们发现敲低RNFl38后影响同源重组相关修 复蛋白RAD5l在DNA损伤位点的招募，且同源重组修复的效率显著降低。敲低RNFl38后细胞对DNA损伤刺激非常敏感，且这一表型可以被野生型质粒拯救，说 明RNFl38直接参与DNA损伤修复过程。为揭示这一机制我们利用优化的TAP技 术结合质谱发现RAD51D可以与RNFl38相互作用，进而调控RAD5lD募集到DNA 损伤位点的稳定性。另外我们对zinc finger结构域蛋白CCCTC结合因子(CTCF)在DNA损伤的 功能和机制进行了探讨和研究。CTCF通过结合DNA链，限定常染色体和异染色 体DNA之间的边界，调节染色质的结构。而CTCF在DNA损伤反应中的功能尚不 清楚。我们发现CTCF迅速招募DNA损伤位点，这过程由锌指结构域和多聚ADP 核糖(PAR)介导。进一步的分析表明，只有三个锌指基序是识别PAR必需的。缺 少这三个锌指，CTCF仍然可以与DNA结合。此外，CTCF敲低细胞对DNA损伤 刺激电离辐射敏感。另外IR诱导的DNA损伤IRIF大小受CTCF的调控。这些结果表明，CTCF参与调节DNA损伤修复区域的边界。关键词：RNFl38，基因敲除小鼠，RNAseq，DNA损伤修复，精子发生万方数据北京协和医学院博士研究生学位论文Study of function and molecular mechanism of Ring domain E3 ligase I蝌F138and the role of RNFl38 and 11 Zinc finger protein CTCF iDNA damage responseAbstractSperrnatogenesis is a complex process，including three important stages： spermatogonia mitosis，meiosis and sperm sperm cell deformability under the event of nuclear condensation，mitochondrial rearrangement，replacement of protein and transition protamine to histones，acrosome formation and spermmaturationIn highthroughput gene expression data in mice and rats showed that a lot of spermatogenesis testisspecific gene express in participationIt is estimated that about 4of the specific geneexpression occurs in all stages of spermatogenesis in the mouse genomeRNFl38，namely RING(Really Interesting New Gene)Finger protein 138，located in the 18q121Our previous work found that RNFl38 had E3 ubiquitin ligase activity of the proteinUbiquitination is an important way of posttranslational modification of proteinsThis reaction is processed by ubiquitin activating enzyme including E 1 ubiquitin conjugating enzyme E2 and E3 ubiquitin ligases，including a series of enzymatic reactions collaborativeNumerous studies confirmed that ubiquitylation involved in a series of cellular processes including protein degradation，activation of protein kinase，transport vesicles，DNA damage repair and chromatin remodelingSomemammalian testis-specific of the E3 ubiquitin ligase perform a variety of differentbiological functions in different stages of spermatogenesisSome E3 ubiquitin ligase complex play an important role in regulating early event of meiosis，DNA double strand breaks(DSB)and histone modificationsWe examined testicular tissue of mice of different ages RNF 1 3 8 protein expressionlevels showed that the expression of RNF 1 38 increases with testicular developmental stage during the first wave of the seminiferous wave(5 weeks)Immunohistochemistry and immunofluorescence showed that RNF 1 3 8 have different profile of expression inspermatogenic cells other than spermatogonial cells，especially in primary spermatocytes which is with highest expressionAt this stage，primary spermatocytes began to enter the first divisionTaken together,these results prompted RNF 1 3 8 may be involved in early development of spemmtogenic cellsIn order to study the function of RNF 1 3 8 in male reproduction，we used the Cre-loxP or Flp-FRT homologous recombination system constructed Vasa-Cre万方数据竺er-of：每=一d,t烛hes渤e d ata socurces。mca。n，hwel叩p c舳arrytoeodut t hemec唑吣aVclK。1唱ka：雠：=：m眦ice弦Byn叭an儿aKly“sis“w“ith contr。38sequencing oftestis川of圳RNF删I coialndlvitloeXprnal=：neserefo吼一clu出973s雄燃=152 m鼢朗nmb要d篙：罨罴赢淼mupregulated genes and 79dowrn。-rfe；gudlajste。d】agyenfuesncAtic。cn01ding：u弋“_。“，!一-in DNAgene expression RNAseq，Gli絮嚣(：n致cl讯ass啦ific峨atmn。妇mvo删tveu，t孟estthereplication，recombination and repair Wlthlalgne吼u叫“一一 ，。=r卿nse淼ntn u：慧篙d洲tomDNeA加da。m姗age。s删ite q蚵uic觚klyMth搬rougmh it4sZTimnc。finger domainsWe found蝴姗138u竺叩h竺?町A17篡淼gsDNAphosphorylafiondamagesite,d-u-,一n二wasRADSfo，110w。in。g，ir。ra。d；，iantiao。nhH旧evncTeb,RmN，aFvle38。hmeigmhet=iun。ir。eizgeudlamtin。gdinnoemdoktmogdoeumadispensablReof RNFl38NfoFrlr3e8crui仰en。the1一assemulyalso indicated that depletionat L, Oodramaticablley ianffve。clvteeddsitesthat RAD5m。d：n吼nwe1 DL：u儿“j：RN8rec。幽nation唧aIp抽w斜T0唧州d也etodirectlyinteractedd；二。：liaffinity purification technologyandfinid3F1$。篡孟三：。：e二。werewhich was recruited to DNA lesionsiteDepdl锄etio赡neofs沁RNF刚1of RAD5 1 DunstablehvnPrse谳iverec rui+tm。enttodamage insults such aS IR and Mr哪!e1111U上c，uI儿。，esse二roe in regulating the structure ofchromatin疵by洲binAding wDeNvA乩s山treanmds。efo。rfbe鸺twee呲n ac，t咖iveaand heteroehrom砒K“?：二at cTc，F is quickly defining the boundarydamage豫驴m“锄aisniteselThuseive协Ht erecrem,witemsennto：s=diated by孟zincCTCF in DNArecruited to the sites of DNAs1e1 he。51ecl。11u1111一1。111：。1，：， 一一：，一domain anddaimagefi，ngerpoly(ADP-ribPoAsRe)(PAR)tFi。unrthAernandfor PARalaclyskeins1Klllggshthowesteaamtu忆汕u一reome yzitnrlcrecnnLg,er,。川q6n证er motifs are essentialrecognitlonAna万方数据北京协和医学院博士研究生学位论文motifs does not affect the DNAbindingMoreover,CTCF-deficient cells are hypersensitive tO genotoxic stress such as ionizing radiation(IR)Interestingly,the size control of IRinduced DNA damage loci is impaired in CTCF-deficient cellsTaken together,these results suggest that CTCF regulates the boundary of DNA damage repairregionKey words：RNFl38，Gene Knockout mice，RNA-seq，DNA damage repair， Spermatogenesis5万方数据北京协和医学院博士研究生学位论文1Lj日IJ舌近年来男性生殖健康受到越来越全面的关注。而男性生殖健康形势却不容乐观。 据统计，男性生育能力逐年下降，突出的临床表现是男性精子数量每年平均以2 速度下降，近50年成年男性精子数量己降低了3050，而且畸形精子，死精子 以及无精症和少精症发生率呈上升趋势。男性生殖系统疾病发病率也在持续升高。 1要改善这种局面，关键是明确男性生殖疾病的病因及其发病机理和病理过程，而 精子发生过程是研究男性生殖生理病理状态的基础。精子发生(Spermatogenesis)是雄性生殖细胞受高度复杂调控的发育过程，包括 三个重要阶段：精原细胞有丝分裂、精母细胞减数分裂和精子细胞变形，随着核固 缩，线粒体重排，过渡蛋白和鱼精蛋白替换组蛋白，顶体形成等过程，最终形成成熟精子【24】。在小鼠和大鼠高通量基因表达数据表明整个精子发生过程需要大量的 睾丸特异性基因表达参与，约有4的基因特异表达于精子发生过程的各个阶段【5。 泛素化是蛋白质翻译后修饰的一种重要方式，由包括泛素激活酶El、泛素结合 酶E2和泛素连接酶E3在内的一系列酶促反应协同完成。大量的研究证实，泛素化 修饰除了参与蛋白质降解，还与蛋白激酶的激活、膜泡转运、DNA损伤修复和染 色质重塑等一系列细胞生理过程密切相关。RING结构域E3泛素连接酶的RING结 构域包含七个高度保守的半胱氨酸残基和一个高度保守的组氨酸残基坐标结合两 个中央Zn2+的离子。一些哺乳动物睾丸特异性表达的E3泛素连接酶在精子发生不 同阶段执行多种不同的生物学功能。某些E3泛素连接酶以及相关复合物在减数分 裂过程早期的DNA双链断裂(DSB)和组蛋白修饰发挥重要作用【6，7】。大多在单倍体生殖细胞特异性高表达的E3泛素连接酶可能参与精子形成过程的调控8。 RING结构E3泛素连接酶RNF8是细胞DNA损伤应答中磷酸化和泛素化之间的关 键环节。RNF8的FHA结构域结合ATM磷酸化的MDCl，与UBCl3在DNA损伤 位点介导泛素K63连接，这对于53BPI和RAP80BRCAl复合物在DNA损伤位 点招募是必需的9】。在精子发生过程中，RNF8介导的组蛋白H2A的泛素化修饰同 样发挥着举足轻重的作用。RNF8能够泛素化XY小体的组蛋白H2A和H2B，泛素 化修饰的H2A和H2B继而引发了组蛋白H4发生乙酰化，由于组蛋白H4的乙酰化 很可能起始了核小体组蛋白被鱼精蛋白替换，最终完成圆形精子向长形精子的转变。因而，RNF8基因敲除的雄性小鼠精子发生明显异常10一121。 RNFl38是本组前期在精子发生机制研究中发现的一个基因。随后的研究证实，RNFl38是含有RING结构域的E3泛素连接酶，除了含有RING结构域外，还包括 三个Zinc finger结构域。据报道RNFl38能够与蛋白激酶NLK(Nemo1ike kinase， NLK)结合，并催化转录因子TCFLEF发生多聚泛素化，泛素化的TCFLEF最终6万方数据北京协和医学院博士研究生学位论文通过泛素蛋白酶体途径降解，在胚胎发育过程中发挥重要作用【13。为深入研究 RNFl38对雄性生殖及早期发育的功能，我们构建了VasaCre条件性RNFl38基因 敲除小鼠动物模型。为了深入研究RNFl38在雄性生殖中的作用机制，我们对条件性RNFl38基因 敲除小鼠睾丸进行转录组测序。转录组测序被广泛应用于功能基因组学研究中。转 录组测序数据可以丰富和验证基因组数据的注释，用于不同样本问基因表达差异、 可变剪接等的比较。大量且快速地充实样本的遗传数据，这些数据资源可有助于深 入开展分子生物学机制研究。结合RNFl38基因敲除动物模型表型分析，并在此基 础上揭示RNFl38的功能及其分子机制。万方数据北京协和医学院博士研究生学位论文材料与方法 材料1实验动物C57BL，以上小鼠购自中国医学科学院实验动物研究所。 RNFl38卅由南京模式动物研究所制备。2菌株实验所用大肠杆菌菌株由本实验室保存。实验所用菌种的基因型和用途列表菌株基因型用途EcoliF-q)80dLacZ zxM 1 5 recA 1 endA 1gyrA96用于质粒的转化与DH5athi一1 h sdR l(rkmk+)supE44 relA 1 deoRA扩增 (LacZYA-argF)U 1 69EcoliF-ompT gal dcm Ion hsdSB(rBmB-)用于原核蛋白诱导BL2lk(DE3【lacI lacUV5一T7 gene 1 ind l sam7表达 nin5)3质粒载体(1)p3XFLAGCMV-14(Fig 1)：用于真核细胞中基因表达。 (2)pEGFPN1(Fig 2)：用于真核细胞中基因表达和定位的荧光观察。 (3)pEGFPC1(Fig 3)：用于真核细胞中基因表达和定位的荧光观察。 (4)pcDNA6myc-HisB(Fig 4)：用于真核细胞中基因表达。(5)pCMV-HA(Fig 5)：用于真核细胞中基因表达。 (6)pEGX4T1(Fig 6)：用于GST标签原核蛋白表达。(7)Lenti Lox 37(P LL37)(Fig 7)：用于基因的重组慢病毒包装。万方数据北京协和医学院博士研究生学位论文 “j：；C卫幅墨l皇：” ”i：I1一 -Fig 1Structure and MultipLe Cloning Site(MCS)ofp3FLAG-CMV-14 Vector-噌盗pEGFP-N1l 7h妒L擀IImI,一、洲，冶 ，、洲一誉H懿“1篙雠=普砦警暑，留争铲鼍争圈黉窖q铲“。篙。00，一=：Fig 2Structure and Multiple Cloning Site(MCS)of pEGFP-N 1 Vectorfc001f38,54lS山12577”“鼍晋“。篙觥篇器。岩冯笋骈篙呼笔黼产“丐器1111?17：_口1717?墨。1嗜警埘驯。“赫。HM裂端：忑。蠢砧-渤hiI“纠鲫一。jk旷 Fig 3Structure and Multiple Cloning Site(MCS)of pEGFPC 1 Vector9万方数据北京协和医学院博士研究生学位论文Fig 4Structure and Multiple Cloning Site(MCS)of pcDNA6myc-His Vector删蛳即鲫ACCATGTACCCATAC 6AT6TTCcGATTAC 6CT CTTHAZel啪0900870910ATGGCCATGGAG6CC1矿丽可可1丽可i丽一CGAATrCGGTCGA。Cc6A6ATcT卉c666TAccjcGGCC GCFig 5Structure and Multiple Cloning Site(MCS)ofpCMV-HA VectoFig 6Structure and Multiple Cloning Site(MCS)ofpEGX4T110万方数据北京协和医学院博士研究生学位论文签|一Fig 7Structure and Multiple Cloning Site(MCS)of Lenti Lox 37(pLL37)4细胞系与培养基实验中所用的细胞，其中HEK293T、Hela、HCTll6细胞系来自实验室保存， HBLl00、U20S结直肠癌细胞系来自XiaochunYu教授提供，其余细胞系均购置协 和基础医学细胞中心。DMEM、IMDM及1640液体培养基购自Hyclone公司；双抗、胰蛋白酶及胎牛血清(FBS)购自GIBCO公司以及天津灏洋生物公司。5实验中用到的细胞系：细胞名称培养条件HEl293TDMEM+10GIBCO血清HEK273DMEM+10GIBCO血清HelaDMEM+1 0GIBCO血清U20SDMEM+1 0GIBCO血清HBLl00DMEM+1 0GIBCO血清HCTll6DMEM+1 0GIBCO血清6工具酶及DNA分子量标准名称用途来源Taq PolymerasePCRCloningTakarapfu PolymerasePCRCloningTransgen万方数据北京协和医学院博士研究生学位论文Fusion High FidelityPCRCloningNEB DNA Polymerase各种限制性内切酶DigestionCloning疋ll(araNEBT4 DNA LigaseLigationC loningTransgen DL2000 DNA MarkerDNA MarkerTakaraRNaseADigestionMerck碱性磷酸酶CloningMerck7试剂盒名称用途来源 质粒提取试剂盒真核细胞转染TiallGen DNA快速纯化回收试剂盒DNA extraction道普生物技术有限公司BCA蛋白定量分析试剂盒Protein quantitationpierceECL化学发光显色试剂盒WestemblotENGREE Reverse Transcription KitsIT-PCRInvitrogen质粒提取试剂盒Plasmid preparation天根生物技术有限公司CCK8细胞增殖同仁化学研究所Annexin V-FITCPI apoptosis assay凋亡检测欣博盛kitAlexa Fluor SFX试剂盒免疫荧光Invitrogen PoLink-2plusPolymerHRPDetection System For Rabbit Primary免疫组化中杉金桥AntibodyPower SYBRGreen PCR Master quantitativeReal-TimeApplied BiosystemsMix(2)PCR(qRT-PCR)Annexin V-FITC Apoptosis Detection细胞凋亡检测InvitrogenKit(488)8抗体12万方数据北京协和医学院博士研究生学位论文H2AX(Serl 39)MouseMilliporePLZFRabbitSantaCruzSox9RabbitMilliporeSYCP3MouseAbeamRNF8RabbitSelf-madeRAD51IhbbitAbcamRAD5lDRabbitAbeamRNFl38IhbbitSantaCruz53BPlRabbitSelf-madeMDClMouseMilliporeBRCAlMouseSelf-madeTubp1inRabbitCell signalingPARPRabbitCell signalingf3-aetinMouseSigmaHAMouseSigmaFLAGMouseSigmaMYCMouseSigmaGFPMouseSigmaGSTMouseSigmaGAPDHMouseSigma辣根过氧化物酶偶联二抗山羊抗兔IgG中杉金桥9主要仪器、设备和软件名称 其它常用化学试剂均为分析纯，购自北京化学试剂公司10引物的设计和合成所用引物均使用DNAMAN软件设计，根据一般引物设计原则选择所需引物。 然后对所选择引物进行同源性比较分析，针对每一个基因选择特异的引物对。最后， 通过进一步基因比对分析，确保所选择的每对引物中的两个引物都分别来自同一基 因的两个不同外显子，以避免总RNA中可能存在的基因组DNA影响PCR结果。 引物合成由Invirogen公司完成。(1)用于构建RNFl38及其相关质粒引物：引物名称序列GFPNRNF I 38FCCGCTCGAGATGGCCGAGGACCTCTCTGCG万方数据北京协和医学院博士研究生学位论文GFPNRNF l 38RCCCAAGCTTGATGr门1ACTrGAAAAGATTC CAGATAGTTCCTGTGACAGCTGCTGCTGCTGTGTCTCRNFl38C189AFTTCCTTGGGGCCCCAAGGAAGAGACACAGCAGCAGCAGCTGTCAC RNFl38C189ARAGGAACTATCTGRNFl38一C18C54AFATTGTCCCCTATGTCGTGGAAATGTRNF 1 38C 1 8C54ARACATTTCCACGGGCTAGGGGACAAT RNFl38124SAFATTCCAAACTTTCAGATCGCTCAAGATTCAGTAGGGA RNFl38124SARTCCCTACTGAATCTTGAGCGATCTGAAAGTTTGGAATStrepFlag FCGGAArTCGCCACCAllGGCCGAGGACCTCTCT Strep-Flag R CGGCTAGCCTACTTGTCATCGTCATCCTTGTAGTCp1137MRNFl38-FCCCTCGAGGCCACC ATGGCCGAGGACCTCTCTGCGp1137M-RNFl38FCGGGATCC GATGTTTACT TGAAAAGATT CTTCAAC SiRNATargetI-MutFCGTTTACTAGACCATTGCA ATAGCAACCACCSiRNATargetlMut-RGGTGGTTGCTf气TTGCAATGGTCTAGmACGSiRNATarget2MutFGAATTTGTGAATCTCCAACTGGACGAGGAGACCCASiRNATarget2-MutR TGGGTCTCCTCGTCCAGTTGGAGATTCACAAATTC Strep-Flag FCGGAATTCGCCACCATGGCCGAGGACCTCTCT StrepFlag R CGGCTAGCCTACTTGTCATCGTCATCCTTGTAGTCTGGATCACTGTAACAGlAATTTCAAGAGAATTACTGT shRNA-Target 1-FTACAGTGATCCTTTTTCTCGAGAAAAAGGATCACTGTAACAGTAATTCTCTTGshRNATarget 1-RAAATlACTGTTACAGTGATCCATGCTTCAGCTAGATGAAGAAATTCAAGAGATTTCTTC shRNA-Target2-FATCTAGCTGAAGTTTTTCTCGAGAAAAACTTCAGCTAGATGAAGAAATCTCTTGshRNATarget2RA Ar丌CTTCATCTAGCTGAAGCA(2)用于构建RAD51D及其相关质粒引物：RAD51DFCGGAATTCTGCCACCATGGGCGTGCTCAGGGTCGGACTG RAD51DRTTGCGGCCGCCTGTCTGArCACCCTGTAATGTGGCAC(3)用于构建CTCF及其相关质粒引物：EGFPCTCFFLFCGGAATTC T ATGGAAGGTG ATGCAGTCGA AGC EGFPCTCFFLRGCGTCGACTCACCGGTCC ATCATCCTGA GGAT14万方数据北京协利医学院博士研究生学位论文EGFPCTCFNFCGGAATTC T ATGGAAGGTG ATGCAGTCGA AGC EGFPCTCFNR GCGTCGAC TCA CTGGAATGTC TTCTTTACAC C EGFPCTCFCF CG GAATTC T GCTGGCCCAGATGGCGTAG EGFPCTCFCR GCGTCGACTCACCGGTCC ATCATGCTGA GGATEGFPCTCFZNFF CGGAATTC T TTCCA GTGTGAGCTT TGCAGT EGFPCTCFZNFRGCGTCGAC TCAACAATTATCA GCATGTCTTG CEGFPCTCFZNF 16F CGGAATTC T TTCCA GTGTGAGCTT TGCAGT EGFPCTCFZNF 16R GC GTCGAC TCA GTGAAATTTGGCCACATTTTCT EGFPCTCFZNF49F CG GAATTC T TGTTCCArGTGCGArrACGEGFPCTCFZNF49R GC GTCGAC TCA GGCGTAAGGCTTCTCCCCG EGFPCTCFZNF71 1FCG G A A兀C T TGTCCCCACTGTGACACAGTEGFPCTCFZNF7一l 1一RGC GTCGAC TCA ACAATTATCAGCArGTCTTGCC EGFPCTCFZNF 13FCGGAATTC T TTCCA GTGTGAGCTT TGCAGT EGFPCTCFZNF 13RGCGTCGAC TGA GTGGGTGTGT TTGTAACGAC G EGFPCTCFZNF24FCGGAATTC T TGCCATCTCTGTGGCAGGGCAr EGFPCTCFZNF24一R GC GTCGAC TCA CTGAAACGGACGCTCTCCAGT EGFP-CTCF-ZNF3-5-FCGGAATTC T TGCCCAGACTGCGACATGGC EGFPCTCFZNF35R GC GTCGAC TCA TTCATA AGGCTTTTCCCCTGAAT EGFPCTCFZNF46FCGGAATTC T TTCAAGTGTT CCATGTGCGA T EGFPCTCFZNF46R GCGTCGAC TCA TGTCACAGTG GGGACAGTGA AAT EGFPCTCFZNF79FCG GAATTC T TGTCCCCACTGTGACACAGT EGFPCTCFZNF79R GC GTCGAC TCA GGCGTAAGGCTTCTCCCCG EGFPCTCFZNF91 1FCGGAATTC T CTTAAAGCGCTTCTCATTCTTGTEGFPCTCFZNF911RGC GTCGAC TCA ACAATTATCAGCATGTCTTGCC EGFPCTCFZNF45FCGGAATTC T TTCAAGTGTT CCATGTGCGA T EGFPCTCFZNF45一R GC GTCGAC TCA TTCATA AGGCTTTTCCCCTGAAT EGFPCTCFZNF56FCGGATC T TGCAGTTrGTGCAGTTATGC EGFPCTCFZNF56R GC GTCGAC TCA GTGAAATTTGGCCACATTTTCTCTCFdelZNF46F CACACCCACGAGAAGCCAGGCCAAATTTCACTGTCC CTCFdelZNF46R GGACAGTGAA汀TTGGCCTGGCTTCTCGTGGGTGTGGEX4T1CTCFFLFCGGATC ATGGAAGGTG ATGCAGTCGA AGC GEX4T 1CTCFFLR GCGTCGACTCACCGGTCC ATCATGCTGA GGAT GEX4T lCTCFNF CGGA芦TC ATGGAAGGTG ATGCAGTCGA AGC15万方数据北京协和医学院博士研究生学位论文GEX4T l-CTCFjNR GCGTCGAC TCA CTGGAATGTC TTCTTTACAC C GEX4T1CTCFCFCG GAATTC GCTGGCCCAGATGGCGTAG GEX4T lCTCFCR GCGTCGACTCACCGGTCC ATCATGCTGA GGATGEX4T 1CTCFZNFF CGGAATTC TTCCA GTGTGAGCTT TGCAGT GEX4T 1CTCFZNFRGCGTCGAC TCAACAATTATCA GCATGTCTTG CGEX4T 1CTCFZNF46FCGGAATTC TTCAAGTG丌CCATGTGCGA TGEX4T lCTCFZNF46R GCGTCGAC TCA TGTCACAGTG GGGACAGTGA AAT(4)用于RT-PCR定量的引物：mRNF l 38一RTPCRF2CCTGTCAGCACGTTTTCTGllA mRNF 1 38RTPCRR2CCACGACATAGGGGACAATGTA mGAPDHIHPCRR lTGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA hGAPDHRTPCRF 1TCAACGACCACTTTGTCAAGCTCAhGAPDHIHPCRRlGCTGGTGGTCCAGGGGTCTTACT(5)用于基因敲除小鼠基因型鉴定的引物：Ddx4cIeFCACGTGCAGCCGTTL蚣GCCGCGTDdx4creRTTCCCATTCTA A ACAACACCCTGAA Rnfl 38-loxptFCTCATCCTTCTTTCTGAGTGRnfl 38-loxptRATTTGTGACAGGTTAATTAC11SiRNA的设计与合成RNFl38 siRNA的设计与合成委托上海吉玛制药技术完成，针对人 RNFl38序列的RNA干扰靶点序列如下5to 3：靶点1：GGATCACTGTAACAGTAAT 靶点2：CTTCAGCTAGATGAAGAAA 阴性对照(NC)：UUCUCCGAACGUGUCACGUTTCTCF siRNA购自Dharmacon，SMARTpool：ONTARGET plus CTCF siRNA L一020 1 6500000516万方数据北京协和医学院博士研究生学位论文方法12基因克隆121目的片断的扩增5PCR反应buffer10 gL模板1 laL上游引物(59M)051xL下游引物(59M)051aLdNTP混合物(25 mM)3 gLPfu or Phusion DNA聚合酶1 laLddH20X gL终体积50 pL退火温度随引物Tm值不同而异，Tm主要通过DNAMAN软件预测获得(延 伸温度=引物预测Tm5。C)，所用退火温度以Tm(56)为宜；延伸时间由扩增片 段长度决定，pill酶一般lkbmin，若使用phosion酶为2kbmin，延伸时间需适当缩短。122 PCR产物回收使用凝胶纯化试剂盒对上述PCR产物进行切胶纯化。方法如下： (1)切取琼脂糖凝胶的DNA条带，放入离心管中，称重，每100mg视为100 gL (100mg100 laL)。(2)加入3倍体积熔胶液，于60熔胶。(3)将融化的凝胶液加入吸附柱中，13，500rpm，室温离心1min。(吸附柱使用 前用平衡液平衡：在吸附柱内加入5009L平衡液，13,500rpm，室温离心lmin，弃去流出液)万方数据北京协和医学院博士研究生学位论文(4)将流出液重复上柱，13，500rpm，室温离心lmin，弃去流出液。 (5)加入6509L漂洗液，13，500rpm，室温离心lmin，弃去流出液。 (6)重复上述(5)。(7)13500rpm，室温离心2min。 (8)将吸附柱置于一个清洁的离心管中，开盖在65干燥10min。 (9)在柱中央加入309 L已预热至65洗脱液(可用灭菌水)，65静置5min。 (10)13，500rpm，室温离心1min，洗脱DNA；重复上柱洗脱一次。将洗脱的DNA于一20保存。123 PCR产物的克隆(1)将纯化后的PCR产物和克隆载体直接双酶切，然后进行连接。 选用两个限制性内切酶通用的缓冲液，采用下面的体系和程序进行双酶切反应：10通用bu舵r2皿Vector or PCR productX rtLEl(10-15U)1 gLE2(1015U)1 ItLddH20x rtL终体积20 laL其中载体一般用量为100 ng；PCR产物用量101aL：酶切后的载体和PCR产物 进行切胶纯化回收(方法同上述方法的12)，用于连接反应。连接反应体系如下：(16过夜或25lhr)1 0T4 ligase buffer1 ItLVector059LPCR productx pLT4 DNA Ligase1 IxL终体积10“L124突变体编码片段的扩增利用重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR，简称SOE PCR)将不相邻的两个基因或DNA片段拼接起来构成融合基因来构建突变体。构建引物 末端互补，PCR产物形成了重叠链，在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不 同来源的扩增片段重叠拼接起来，形成了不靠限制性内切酶连接的杂交基因片段。18万方数据北京协和医学院博士研究生学位论文因此，利用这一技术可以快速获得依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物。 重叠延伸PCR技术成功的关键是重叠互补引物的设计。重叠延伸PCR在基因的定 点突变、融合基因的构建、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方 面有其广泛而独特的应用。以下是重叠延伸PCR的原理(Fig 8)：假设引物PF、Pl扩增基因片段A，引物P2、PR扩增基因片段B；P1、P2
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