分子生物学实验

编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径，学海无涯苦作舟页码：第10页 共10页实验操作1. 避免长时间的培养，大肠杆菌一般培养12个小时就可以挑取克隆子进行验证了。主要是因为培养时间过长，尤其是含有Amp抗性的质粒。重组菌能够分泌酶降解Amp，造成平板中局部Amp浓度太低。其他未重组菌在Amp存在的情况下只是生长受抑制而非死亡，当Amp浓度降低时就可以生长了。卫星菌落，由于阳性菌落大量分解抗生素，造成周围区域抗生素浓度降低，则无抗性的菌也生长出来了。一句话，你的板子培养时间过长了。这是amp抗性质粒特有的卫星菌落，就是又抗性的E col分泌beta内酰胺酶分解周围的amp，从而使没有抗性的e coli生长。 2.3. 乙醇能够消除核酸的水化层，使带负电荷的磷酸基团暴露出来。Na之类的平衡离子能够与这些带电基团结合，在沉淀形成部位降低多核苷酸链之间的排斥作用。因此只有在阳离子的量足以中和暴露的磷酸残基的电荷时才会发生乙醇沉淀。1.为什么用无水乙醇沉淀DNA？ 用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。 DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67左右。因而也可改用95乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95乙醇昂贵）。但是加95的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置1530分钟即可。 2.在用乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.10.25mol/L？ 在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。 DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67左右。因而也可改用95乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95乙醇昂贵）。但是加95的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置1530分钟即可。1。DNA不溶于乙醇2。乙醇可以吸附水分子（极性相同），使得溶液中相对的水分子减少，增大了DNA在水中的相对浓度。3。附：乙醇沉淀DNA需要盐离子，用金属离子屏蔽DNA上磷酸的负电荷，降低DNA分子间的斥力，才能沉淀完全。4. 溶菌酶是一种碱性球蛋白，分子中碱性氨基酸、酰胺残基和芳香族氨，酸的比例较高，酶的活动中心是天冬氨酸和谷氨酸。 溶菌酶是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，称包胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，它专一地作用于肽多糖分子中N-乙酰胞壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间的-1，4键，从而破坏细菌的细胞壁，使之松驰而失去对细胞的保护作用，最终使细菌溶解死亡。也可以直接破坏革兰氏阳性菌的细胞壁，而达到杀菌的作用，这主要是因为革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由胞壁质和磷酸质组成，其中胞壁质是由杂多糖和多肽组成的糖蛋白，这种多糖正是由N-乙酰胞壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间的-1，4键联结的。对某些革兰氏阴性菌，如埃希氏大肠杆菌，伤寒沙门氏菌，也会受到溶菌酶的破坏。溶菌酶是母乳中能保护婴儿免遭病毒感染的一种有效成分，它能通过消化道而保持其活性状态，溶菌酶还可以使婴儿肠道中大肠杆菌减少，促进双歧杆菌的增加，还可以促进蛋白质的消化吸收5. 酚、氯仿是变性蛋白质的（由于苯酚能溶进少量水损失DNA，因此与氯仿一起使用，减少DNA损失）异戊醇是消泡剂（蛋白质变性中常常产生气泡，会损失DNA，因此需消泡）抽提DNA去除蛋白质时，怎样使用酚与氯仿较好？酞与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约1015的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA。所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合（1:1）使用。 10为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊酵？在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异戊酵为24：1之比。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：24:1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24：1的氯仿与异戊醇即成），同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。1.酚/氯仿/异戊醇的作用：从核酸样品中除去蛋白质时常常使用酚和氯仿都能使蛋白质变性，并使其溶于有机相或中间相内，而异戊醇则有助于消除抽提过程中出现的气泡。6. -巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除7. 8. 说得对。75%乙醇清洗DNA的目的是脱盐的。其机理如下：75%乙醇中含有25%的水，这部分水可以溶解和DNA沉淀中混有的、DNA沉淀前加入的钾盐（或钠盐），但同时也会溶解（损失）少部分DNA（盐离子比DNA更易溶于水中）。为了减少DNA损失，所以用含量较高的乙醇溶液（DNA不溶于乙醇）。蛋白质、糖、脂类等都可以溶于75%酒精，而DNA不溶9.10. RNase A的作用是使RNA降解，减少提取得到的DNA中的RNA，以便减少对后续实验的影响。RNaseH是一种逆转录酶。消化mRNA用的。RNase H，即Ribonuclease H，中文名为核糖核酸酶H，是一种核糖核酸内切酶，可以特异性地水解DNA-RNA杂合链中的RNA。RNase H不能水解单链或双链DNA或RNA中的磷酸二酯键，即不能消化单链或双链DNA或RNA。 特点：特异性消化DNA-RNA杂合链中的RNA，常用于cDNA第二链的合成编辑本段用途 在cDNA第二链合成前去除mRNA DNA-RNA杂交体的鉴定 在Oligo(dT) 存在下去除mRNA 的poly(A)尾11. 当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。0.2 N NaOH：是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。由于质粒和细菌染色体的拓扑结构不同，变性时前者虽然两条链分离，却仍然缠绕在一起不分开；但后者完全变性分甚至出现断裂。因此，在裂解细菌时要注意：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下DNA片断会慢慢断裂；第二，混合必须轻柔，不然DNA也会断裂。1% SDS（十二烷基磺酸钠）：是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。 12. 这一步的K置换了SDS（十二烷基磺酸钠）中的Na，得到PDS（十二烷基磺酸钾）沉淀；SDS易与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了，同时基因组DNA也被PDS共沉淀。当加入pH4.8的酸性乙酸钾降低溶液pH值，使溶液pH值恢复较低的近中性水平时， 质粒的两条小分子单链可迅速复性恢复双链结构，但是主染色体DNA则难以复性。 SDS遇到钾离子后变成十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是不溶于水的，而高浓度的盐使得沉淀更完全。SDS极易和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了。 同时，尽管SDS并不与DNA分子结合，由于大肠杆菌的基因组DNA很长，很容易和变性的蛋白质缠绕在一起。在离心时，大部分主染色体与细胞碎片，变性蛋白质等缠绕一起被沉淀，而复性的质粒DNA以可溶性状态留在上清夜中。13. 所谓星活性又称Star活性。是指由于反应条件不同而产生的切断与原来认识序列不同的位点的现象，也就是说产生Star活性后，不但可以切断特异性的识别位点，还可以切断非特异性的位点。产生Star活性的结果是酶切条带增多。 所以说Star活性与粘端变平端没关系。另外，Star活性除了与酶本身的性质有关外，与甘油浓度，pH值及离子浓度有关。 一般正规厂家生产的限制酶出厂前都做相关的检测，buffer体系也都做了相应的考虑。因此正常情况下酶切，可以先不必考虑Star活性的问题。 一旦出现底物DNA不好切断，需要增加酶量或延长反应时间时，如果使用的是易产生StaR活性的限制酶切，一般优先考虑增加酶量，而不是延长反应时间，换句话说，延长时间比增加酶量更易产生Star活性。 另外，实际上几乎所有的限制性内切酶都可能产生Star活性。但目前Star活性对实际实验室操作过程中的影响并不太大，可以先不考虑。一般来说，限制性内切存在严格的识别在序列特异性，但某些条件改变，会使其对识别序列特异性的放宽，而导致在DNA内产生附加切割，限制性内切酶表现的这种活性称为星活性，或第二活性，在名称右上角加一星号表示。产生星活性的条件甘油浓度离子强度 高盐缓冲液酶降低盐pH值 7.585产生有机溶剂 DMSO(二甲亚砜)12%(V/V)二价阳离子Mn2+代替Mg2+酶与DNA的比例 酶与DNA比为(50Ug)产生星活性。为了防止星活性的出现，所有限制性内切酶反应在标准条件下(特别是pH、离子强度、二价离子浓度的条件下)进行。 某些限制性内叨酶诱导产生星活性的反应条件 酶 诱导星活性条件 AvaI A,B,DEcoRI A,B,D,E,FHae B,DHhaI B,D,GBamHI A,B,C,D,E,H A乙二醇(45)；B.甘油(1120)；C.乙醇(12)；D高酶：DNA比值()25Ug)；EMn2+代替Mg2+；FpH85；GDMSO(8)；H无NaCl14. 同步双酶切是一种省时省力的常用方法。选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer，以保证100%的酶活性。NEBuffer的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见内切酶在不同缓冲液里的活性表及每支酶的说明书。能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。由于内切酶在非最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓，因此使用时可根据每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时间。要保证双酶切实验的高效、准确，就要选择合适的通用buffer。这样就能避免质粒和基因没有切动或者被切散。常用的几家内切酶公司有MBI、 NEB、Promega、Roche、Takara，要查找双酶切体系的通用buffer，最好到出品该内切酶的公司网站上查询。15. 缓冲液在电泳过程中的一个作用是维持合适的pH。电泳时正极与负极都会发生电解反应，正极发生的是氧化反应（4OH-4e-2H2O+O2)，负极发生的是还原反应（4H+4e-2H2)，长时间的电泳将使正极变酸，负极变碱。一个好的缓冲系统应有较强的缓冲能力，是溶液两极的pH保持基本不变。电泳缓冲液的另一个作用是使溶液具有一定的导电性，以利于DNA分子的迁移，例如，一般电泳缓冲液中应含有0.01-0.04mol/L的Na+离子，Na+离子的浓度太低时电泳速度变慢；太高时就会造成过大的电流使胶发热甚至熔化。电泳缓冲液还有一个组分是EDTA，加入浓度为1-2mmol/L，目的是螯合Mg2+ 等离子，防止电泳时激活 DNA酶，此外还可防止Mg2+离子与核酸生成沉淀。16.17. 对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.52之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。注意高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。孔径大的琼脂糖。19. 、细胞的生长状态和密度最好从-70或-20甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用已经过多次转接，及贮存在4的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5107个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD600控制。对TG1菌株，OD600为05时，细胞密度在5107个/ml左右。（应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同）。密度过高或不足均会使转化率下降。此外，受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。、质粒DNA的质量和浓度用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的，转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，则会使转化率下降。一般地，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%，1ng的cccDNA即可使50ul的感受态细胞达到饱和。对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低，实验证明，大于30kb的重组质粒将很难进行转化。此外，重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10100倍，因此重组DNA大都构成环状双螺旋分子。、试剂的质量所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，最好分装保存于4。、防止杂菌和杂DNA的污染整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。、整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。20. TAE是Tris-乙酸，缓冲容量小，但是溶解度大，易于储存TBE是Tris-硼酸，缓冲容量大，但是溶解度小，不易长期储存，易产生沉淀TAE与TBE的区别首先要知道 TAE 與 TBE 緩衝溶液的成份如下：50x TAE Buffer (Tris-Acetate-EDTA) 242 gm Tris base 57.1 ml Acetic acid 100ml 0.5M EDTA Add ddH2O to 1 liter and adjust pH to 8.5.10x TBE Buffer (Tris-Borate-EDTA) 108 gm Tris base 55 gm Boric acid 9.3 gm Na4EDTA Add ddH2O to 1 liter. The pH is 8.3 and requires no adjustment.它們的分別有下列幾點：1. TBE 不能太濃 (它只可有 10 times)，因為 borate 會很容易沉澱，但一般有少許沉澱是不會有太大問題。2. TBE 的 buffering capacity 比 TAE 高，用 TBE 來跑出來的 gel，分辨率 (resolution) 會比較高。3. 因為 TBE 有 borate 離子 (ion)，它會影嚮酵素 (enzyme) 的工作。因此，若要為分離出的 DNA 進行下一步酵素處理，如 cloning 或 restriction cut 的話，就要切記不要讓 DNA 碰上 borate ion。4. TAE的 buffer capacity 比較差，gel 一般比較模糊，但它不會對影嚮酵素三种缓冲液的配制方法Tris-乙酸（TAE）：50浓贮存液（每升）：242g Tris 碱57.1ml 冰乙酸100ml 0.5mmol/L EDTA(pH8.0)使用时再稀释50倍。Tris-磷酸（TPE）：10浓贮存液（每升）：108g Tris 碱15.5ml 85磷酸（1.679g /ml）40ml 0.5mmol/L EDTA(pH8.0)使用时再稀释10倍。Tris-硼酸（TBE）：5浓贮存液（每升）：54g Tris 碱27.5g 硼酸20ml 0.5mmol/L EDTA(pH8.0)21. 标准的PCR反应体系：10扩增缓冲液 10ul4种dNTP混合物 各200umol/L 800ul引物 各10100pmol模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ulPCR反应五要素： 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+22. 1、考虑是否引物有问题，不特异；2、是否Taq酶加多了，一般50ul体系加1U Taq就可以了；3、是否是Mg2加多了，Mg2加多了会造成非特异扩增；4、是否退火温度不好？5、是否循环数过多，PCR扩增后期，进入平台期扩增，错误扩增增加，非特异性也增强.23. 可能有如下原因:1, 模板量过低;2, 引物浓度多大;3, 退火时间过长.4, 最重要的一点是,在引物设计过程中避免引物间有互补序列,尤其是3末端, 并且尽量使引物3末端的GC含量高一点,使与模板紧密结合.做到以上各点,一般不会出现引物二聚体了.24. 由于RNase能迅速降解RNA，且耐热、耐酸、耐碱，不需要辅助因子，用蛋白质变性剂只能使之暂时失活，变性剂去除后，其活性又可恢复。因此，分离提取RNA时，为确保RNA的完整性，必须创造一个无RNase的环境，操作时应特别注意以下几个方面：1操作者在整个实验过程中必须戴消毒手套和口罩，并经常更换。2玻璃器皿冲洗干净后，需180250干烤4小时以上。3尽可能使用一次性塑料制品(Ep管、吸头等)，用0.1%DEPC溶液浸泡过夜，80烤干后高压灭菌。4电泳槽冲洗干净后，于3%H2O2中浸泡30分钟以上，然后用0.1%DEPC溶液或高压灭菌水彻底冲洗。5除Tris类试剂外，所有溶液用0.1%DEPC处理12小时以上，然后高压消毒。所用试剂应未开封或RNA专用试剂。6使用强烈、有效的RNase抑制剂以抑制内源RNase。常用的RNase抑制剂有异硫氰酸胍（GTC）、氧钒核糖核苷复合物（VRC）、RNasin及焦碳酸二乙酯（DEPC）等。评价RNA质量的标准是RNA的均一性和完整性。均一的RNA取决于有效的去除RNA提取物中的DNA、蛋白质和其他杂质；完整的RNA则取决于最大限度地避免纯化过程中内源性及外源性RNase对RNA的降解。通常采用紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度，纯RNA 的A260/A280=2.0，但由于所用的标本不同，此比值有一定的变化，一般在1.72.0之间，低于该值表明有蛋白污染，需进一步用酚/氯仿抽提。有时样本的A260/A280可能大于2.0，如重复读数无误，并不表示纯度有问题。RNA的完整性可通过琼脂糖电泳法进行鉴定。完整的RNA电泳时，28S（约4.8Kb）和18S（约1.9Kb）rRNA经EB染色后，两条电泳条带的显色强度近似为2比1。25. RNA提取提取RNA可以分为总RNA，mRNA，Virus RNA（RNA病毒）几类Trizol即异硫氰酸胍-苯酚法，这种方法的原理是：首先用强变性剂异硫氰酸胍裂解细胞，同时使核蛋白复合体中的蛋白变性，释放出核酸。释放出来的DNA和RNA由于在特定pH时溶解度不同，分别位于整个体系中的中间相和水相，从而使DNA和RNA分离开来。进一步通过有机溶剂来抽提沉淀RNA，就可以得到纯净的RNA；26.27. 一、 防止RNA酶污染的措施1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180的高温下干烤6hr或更长时间。2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22m滤膜过滤除菌。5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。6. 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。二、常用的RNA酶抑制剂1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。2. 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。3. 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。4. RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。28.29。配1000ml的DEPC处理水，加1mlDEPC。 磁力搅拌器搅拌 过夜 。第二天 高压蒸汽灭菌 121c，25min DEPC分解成二氧化碳和酒精，封闭冷藏备用。 最好分装小瓶来用，尽量避免污染。DEPC水是用DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压消毒的MiliQ纯水。经检测不含RNase、DNase和proteinase。 DEPC水可以用于RNA沉淀的溶解，含有RNA的各种反应体系如反转录、siRNA的退火等，以及其它各种要求无RNase、DNase和proteinase的反应体系。 DEPC水一般是指千分之一浓度的DEPC,在搅拌器上搅拌至完全溶解，即看不到“油珠”为止，用来处理枪头、EP管的DEPC水不需高压灭活，而用于配制DEPC酒精等试剂和用来这种RNA相关试验的DEPC水需灭火后使用。 DEPC气味芳香浓烈，强挥发性，有毒，需在通风橱中操作。 方法是：取市售DEPC 1ml，加入1L待处理水（蒸馏水等）中，经猛烈振摇后，于室温静止数小时，然后高压灭菌，以除去降解DEPC（DEPC分解为CO2和乙醇）。有些试剂 可直接加入DEPC，终浓度一般为0.1%0.4%，原则上在杂交及其以前的步骤中，所有液体试剂均需用DEPC处理，或用DEPC水配制，包括乙醇的 稀释。此外，接触标本以及标本有关的空中的洗涤也需DEPC水洗涤。 注意：DEPC是 潜在的致癌物质，在操作中应尽量在通风的条件下进行，并避免接触皮肤。含有Tris缓冲液的溶液中，不能加入DEPC。 去离子纯净水加入DEPC达浓度0.1%，室温下持续搅拌过夜，分瓶包装后湿热高压灭菌彻底挥发去除DEPC后可以长期保存在室温或4度冰箱，不宜反复使用。30.31. 非变性凝胶里面没加变性剂，一般是SDS。非变性胶跑出来的蛋白能保持其活性一般用做功能试验，如EMSA。由于没有变性剂的原因非变性胶电泳时除了与蛋白分子量有关也会受都电荷的影响，因此对蛋白等电点的确定和缓冲液的酸碱性有注意，有时需要倒转电泳时的正负极。从跑的胶来看，变性胶会比较好看，带比较窄，非变性胶跑出来则比较粗糙。32. 140ml水中加7g琼脂糖，煮沸溶解，冷却到60，加7ml10MSE缓冲液，11.5ml 甲醛，加水定容至70ml，混匀后倒入盛胶槽。 2等胶凝固后，去掉梳子和胶布，将盛胶槽放入1MSE缓冲液的电泳槽。 3使RNA变性（最多20g），RNA4.5ml,10MSE缓冲液20ml，甲醛3.5ml，去离子甲酰胺10ml。 455加热15min，冰浴冷却。 5加2ml5载样缓冲液。 6上样、同时加RNA标记物（同位素（32P）dCTP）。 760伏电泳过夜。 8取出凝胶，水中浸泡2次，每次5min。 9室温下将胶浸到50mmol/L NaOH和10mmol/L NaCl中45min，水解高分子RNA，以增强转印。 10室温下将胶浸到0.1mmol/L Tris HCl(pH7.5)中45min,使胶中和。 1120SSC洗胶1h。 1220SSC中过夜转印到硝酸纤维素膜上。 13取出硝酸纤维素膜，80真空烘烤2h。 注意事项1严格遵守试验规则，物必准确。2由于好多药品是有毒的，对人体有害，请注意自身安全，做好防护。33. 要进行北方杂合反应前，必须先将RNA自洋菜胶体转移至硝化纤维纸（nitrocellulose membrane） 或尼龙膜 （nylon membrane） 上，这一个过程称为转印 （blotting）。 一般常用的方法包括毛细管转移法 （capillary transfer）、真空转移法 （vacuum transfer） 与电转印法 （electroblotting）。 毛细管转移法借助吸水纸吸收转移缓冲液时所产生的牵引力量将RNA自洋菜胶体转移至膜上；要转印完全，起码需要作用6 h以上。 虽然所需花费的时间比较长，以其不须要特别的仪器设备，毛细管转移法目前仍被普遍采用。 若分析RNA时采用变性聚丙烯酰胺胶体电泳，则必须以电转印法进行RNA转印。至于膜的选择，硝基纤维素膜的优点是比较不会产生非专一性反应；不过其一旦被润湿再烘干的后，容易碎裂，不适用于进行多次杂合反应。 尼龙膜的优点是韧性好，与核酸结合的能力也相当强，正可以弥补硝基纤维素膜的缺点，现已成为主流。 一旦将RNA转移至膜上后，即可以利用紫外线照射法 （uv irradiation） 或真空干燥法 （在真空下80加热2 h） 将其固定于转印膜上。34. 观察结果 紫外灯下可见28S、18S和5S rRNA三条带，观察28S和18S二条带是否清晰，若28S的荧光强度为18S的二倍以上，则说明RNA分子没有降解。溴化乙锭等荧光染料示踪的核酸电泳结果可用于判定核酸的纯度。由于DNA分子较RNA分子大许多，电泳迁移率低；而RNA中以rRNA最多，占到80%85%，tRNA及核内小分子RNA占15%20%，mRNA占1%5%。故总RNA电泳后可呈现特征性的三条带。28sRNA、18sRNA、5sRNA的确是rRNA，并且理论上讲28S条带的亮度应该为18S条带亮度的12倍，否则，当18S条带的亮度过高时说明28SrRNA可能降解为18SrRNA了，意味着RNA可能严重的讲解了。 最后，这三条带代表的是总RNA的提取程度，不能说明mRNA的提取量。28S比18S亮点比较好，5S亮的话就说明RNA降解了35. 通过电泳看5s 18s 28s的情况，分解后5s变亮，18和28连成一片，呈弥散状。具体参考生物谷上面 这个RNA方面很多内容的。使用普通的电泳也可以检测，但是要用DEPC水来处理电泳槽和配缓冲液，电泳前最好在65摄氏度变温一下。1、 裂解液要预热,以抑制DNase,加速蛋白变性,促进DNA溶解。2、 酚一定要碱平衡。苯酚具有高度腐蚀性，飞溅到皮肤、粘膜和眼睛会造成损伤，因此应注意防护。氯仿易燃、易爆、易挥发，具有神经毒作用，操作时应注意防护。3、 各操作步骤要轻柔,尽量减少DNA的人为降解。4、 取各上清时,不应贪多,以防非核酸类成分干扰。5、 异丙醇,乙醇.NaAc,KAc等要预冷,以减少DNA的降解,促进DNA与蛋白等的分相及DNA沉淀。6、 提取DNA过程中所用到的试剂和器材要通过高压烤干等办法进行无核酸酶化处理。7、 所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。RNA酶是RNA降解的主要原因，RNA酶是一类生物活性非常稳定的酶，除细胞内RNA酶外，环境中的灰尘、各种实验器皿和试剂、人类皮肤的汗液、唾液中均存在RNA酶，且RNA酶耐热、耐酸碱，煮沸也不能使之完全失活，蛋白变性剂可使之暂时失活，但变性剂去除后，又可恢复活性。所以在RNA提取过程中必须避免外源性RNA酶的污染和抑制内源性RNA酶的活性。1 去除外源性的RNA酶污染实验过程必须戴手套操作，所有溶液和水均需加0.1%的DEPC（焦碳酸二乙酯，是RNA酶的强抑制剂）室温搅拌过夜，然后高压处理，玻璃器皿洗净后在250摄氏度烘烤4小时。塑料器材最好使用灭菌的一次性用品等。2 抑制内源性的RNA酶的活性细胞破碎时，RNA酶释放出来，所以力争在RNA提取的初始阶段，通过加入RNA酶抑制剂来抑制内源性的RNA酶的活性。36.烘干第 10 页 共 10 页