实验四小鼠精子畸形试验学习教案

实验实验(shyn)四四 小鼠精子畸形试验小鼠精子畸形试验第一页，共16页。 精子畸形试验是检测受试化学毒物能精子畸形试验是检测受试化学毒物能否破坏哺乳动物精子正常形态的实验方法否破坏哺乳动物精子正常形态的实验方法(fngf)(fngf)。通过实验，学习和掌握小鼠。通过实验，学习和掌握小鼠精子畸形试验的原理和步骤。精子畸形试验的原理和步骤。 实验实验(shyn)目的目的1.1. 1.第1页/共16页第二页，共16页。实验原理实验原理2.2. 精子畸形是指精子的形状异常和异常精子畸形是指精子的形状异常和异常精子数量精子数量(shling)(shling)的增多。生殖系统对的增多。生殖系统对化学毒物的作用十分敏感，在其他系统还化学毒物的作用十分敏感，在其他系统还未出现毒性反应前，生殖系统可能已出现未出现毒性反应前，生殖系统可能已出现了损害作用。正常情况下，哺乳动物的精了损害作用。正常情况下，哺乳动物的精液中也存在少量的畸形精子，但在某些化液中也存在少量的畸形精子，但在某些化学毒物的作用下，特别是在可引起生殖细学毒物的作用下，特别是在可引起生殖细胞遗传性损伤的化学毒物作用下，哺乳动胞遗传性损伤的化学毒物作用下，哺乳动物睾丸产生的畸形精子数量物睾丸产生的畸形精子数量(shling)(shling)可可大量增加。因此，可以用大量增加。因此，可以用 第2页/共16页第三页，共16页。实验原理实验原理2.2.检查雄性动物接触化学毒物后精子畸形率的高低，检查雄性动物接触化学毒物后精子畸形率的高低，来反映该化学毒物的生殖毒性和对生殖细胞潜在来反映该化学毒物的生殖毒性和对生殖细胞潜在(qinzi)(qinzi)的致突变性。的致突变性。 化学毒物引起精子畸形的机制尚未完全清楚。化学毒物引起精子畸形的机制尚未完全清楚。正常情况下，精子的成熟和正常形态发生过程受正常情况下，精子的成熟和正常形态发生过程受多种基因调控，一旦这些基因中的一个或多个在多种基因调控，一旦这些基因中的一个或多个在化学毒物的作用下发生突变，就会导致畸形精子化学毒物的作用下发生突变，就会导致畸形精子数量的大量增加。一般认为，常染色体上的基因数量的大量增加。一般认为，常染色体上的基因控制控制 第3页/共16页第四页，共16页。实验原理实验原理2.2.精子畸形，精子畸形，Y-Y-性连锁基因控制畸形精子的表现性连锁基因控制畸形精子的表现(bioxin)(bioxin)。某些特异的染色体重排，如性、。某些特异的染色体重排，如性、常染色体易位，是化学毒物诱发哺乳动物畸形常染色体易位，是化学毒物诱发哺乳动物畸形率增高的主要机制。率增高的主要机制。 由于精子畸形有可能影响生殖。因此，当由于精子畸形有可能影响生殖。因此，当受检物引起精子畸形率增高，即使不一定是化受检物引起精子畸形率增高，即使不一定是化合物诱发生殖细胞突变的结果，但也表明受试合物诱发生殖细胞突变的结果，但也表明受试物直接或间接损害精子，从而可能影响生殖。物直接或间接损害精子，从而可能影响生殖。 第4页/共16页第五页，共16页。 实验实验(shyn)(shyn)动物：动物：实验实验(shyn)材料材料3.3.体重体重(tzhng)18-(tzhng)18-22g22g小鼠。小鼠。 实验器材：实验器材：灌胃针、注射器灌胃针、注射器5 5套、眼科剪、眼套、眼科剪、眼科镊、显微镜、饲养笼等。科镊、显微镜、饲养笼等。 实验试剂：实验试剂：磷酸盐缓冲液、生理盐水、无水乙醇、磷酸盐缓冲液、生理盐水、无水乙醇、2%2%伊红水溶液、甲基磺酸甲酯或甲基磺伊红水溶液、甲基磺酸甲酯或甲基磺酸乙酸或环磷酰胺。酸乙酸或环磷酰胺。第5页/共16页第六页，共16页。4.4. 实验步骤实验步骤1.1.动物选择动物选择(xunz)(xunz)成熟的大鼠、小鼠均可使用。由于成熟的大鼠、小鼠均可使用。由于小鼠较为经济，且有大量实验证实小鼠在该试验系统中小鼠较为经济，且有大量实验证实小鼠在该试验系统中对化学毒物最为敏感，故一般采用雄性小鼠，年龄宜在对化学毒物最为敏感，故一般采用雄性小鼠，年龄宜在6 68 8周。周。2.2.剂量与分组试验至少应设剂量与分组试验至少应设3 3个以上个以上(yshng)(yshng)剂量组，并同时设立阳性对照组和阴性对照组。剂量组，并同时设立阳性对照组和阴性对照组。接触化学毒物后每组至少应存活接触化学毒物后每组至少应存活5 5只动物。最高只动物。最高剂量组剂量组5d5d总剂量应能使部分动物死亡。总剂量应能使部分动物死亡。 一般可采用一般可采用LD50LD50的的2 24 4倍剂量，或预先给予倍剂量，或预先给予化学毒物的化学毒物的LD50LD50，以求得最高总剂量，然后以，以求得最高总剂量，然后以它的它的1/21/2（或（或1/51/5、1/101/10）作为下一剂量组的接）作为下一剂量组的接触剂量，依此类推。触剂量，依此类推。第6页/共16页第七页，共16页。4.4. 实验步骤实验步骤阳性对照可用环磷酰胺阳性对照可用环磷酰胺20mg/kg20mg/kg或甲基磺酸甲酯或甲基磺酸甲酯75mg/kg75mg/kg或甲基磺酸乙酯或甲基磺酸乙酯60mg/kg60mg/kg，进行腹腔，进行腹腔(fqing)(fqing)注射，每天一次，连续注射，每天一次，连续5d5d。阴性对照选。阴性对照选用给予相同体积的溶剂。用给予相同体积的溶剂。3.3.染毒与采样可采用一次或每天一次连续染毒与采样可采用一次或每天一次连续5d5d的方的方法进行染毒。染毒途径多用腹腔注射，也可采用法进行染毒。染毒途径多用腹腔注射，也可采用与人体实际接触化学毒物相同的途径，如经口、与人体实际接触化学毒物相同的途径，如经口、吸入和皮肤接触等。吸入和皮肤接触等。 一般认为精原细胞后期一般认为精原细胞后期(huq)(huq)或初级精母细胞或初级精母细胞早期对化学诱变剂较为敏感，在接触化学毒物后早期对化学诱变剂较为敏感，在接触化学毒物后4 45 5周精子畸形率最高，故选择在第一次染毒后周精子畸形率最高，故选择在第一次染毒后第第35d35d进行采样。也可在染毒后第进行采样。也可在染毒后第1 1、第、第4 4和第和第1010周周第7页/共16页第八页，共16页。4.4. 实验步骤实验步骤分三次采样，或者在染毒后每周采样一次，连分三次采样，或者在染毒后每周采样一次，连续进行续进行(jnxng)(jnxng)动态观察，直至精子形态恢复动态观察，直至精子形态恢复正常。正常。4.4.制片用颈椎脱臼法处死小鼠，剪开腹腔制片用颈椎脱臼法处死小鼠，剪开腹腔(fqing)(fqing)，分，分离并摘取双侧附睾，将附睾放入盛有约离并摘取双侧附睾，将附睾放入盛有约3ml3ml磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液或生理盐水的小平皿中，以眼科剪将附睾尾剪成小块，或生理盐水的小平皿中，以眼科剪将附睾尾剪成小块，用吸管将悬浮液轻轻吹打用吸管将悬浮液轻轻吹打5 56 6次，静置次，静置3 35min5min，用四层，用四层擦镜纸滤除组织碎片，吸取此精子悬液滴于清洁载玻片擦镜纸滤除组织碎片，吸取此精子悬液滴于清洁载玻片上，均匀推片，待玻片晾干后用甲醇固定上，均匀推片，待玻片晾干后用甲醇固定5min5min，干燥后，干燥后即可镜检观察精子形态。也可用即可镜检观察精子形态。也可用2%2%的伊红水溶液染色的伊红水溶液染色1 12h2h后再作镜检。后再作镜检。第8页/共16页第九页，共16页。4.4. 实验步骤实验步骤5.5.阅片在高倍镜下检查精子形态，可加上蓝色或绿阅片在高倍镜下检查精子形态，可加上蓝色或绿色滤光片。每只小鼠检查完整的精子色滤光片。每只小鼠检查完整的精子200200500500个，个，每个剂量组至少检查每个剂量组至少检查10001000个精子。精子畸形个精子。精子畸形(jxng)(jxng)主要表现在精子的头部，可分为：无钩、主要表现在精子的头部，可分为：无钩、香蕉形、无定形、双头、双尾、尾折叠及胖头等形香蕉形、无定形、双头、双尾、尾折叠及胖头等形态。态。头部重叠或全部重叠的精子、无尾精子不进行计头部重叠或全部重叠的精子、无尾精子不进行计数。数。第9页/共16页第十页，共16页。5.5. 结果分析结果分析分别计算各剂量组的精子畸形发生率。各剂分别计算各剂量组的精子畸形发生率。各剂量组的精子畸形率与阴性对照组之间的差异量组的精子畸形率与阴性对照组之间的差异(chy)(chy)分析采用秩和检验。分析采用秩和检验。 由于不同品系小鼠的精子畸形率本底值差异由于不同品系小鼠的精子畸形率本底值差异(chy)(chy)较大，且影响的因素也较多，故在结果较大，且影响的因素也较多，故在结果分析时，应首先观察阳性和阴性对照组的试验分析时，应首先观察阳性和阴性对照组的试验结果。阳性对照组精子畸形率的增高应在本实结果。阳性对照组精子畸形率的增高应在本实验室的历史记录范围之内，并与阴性对照组有验室的历史记录范围之内，并与阴性对照组有显著性差异显著性差异(chy)(chy)（P0.01P0.01），阴性对照组的），阴性对照组的畸形精子率也应与自己实验室的历史记录接近，畸形精子率也应与自己实验室的历史记录接近，否则所得结果不可靠，试验应重做。否则所得结果不可靠，试验应重做。第10页/共16页第十一页，共16页。5.5. 结果分析结果分析出现可重复的剂量反应关系时，可判断试验结果出现可重复的剂量反应关系时，可判断试验结果为阳性。但要判定某一化学毒物为阳性。但要判定某一化学毒物(dw)(dw)为精子畸形为精子畸形诱变剂，至少应该有两个相邻剂量组的精子畸形率诱变剂，至少应该有两个相邻剂量组的精子畸形率比阴性对照组显著增高（比阴性对照组显著增高（P0.01P0.01）；或达到阴性对）；或达到阴性对照组的照组的2 2倍或倍或2 2倍以上，并且试验结果能够重复。如倍以上，并且试验结果能够重复。如果试验组的染毒剂量已使动物发生死亡，而精子畸果试验组的染毒剂量已使动物发生死亡，而精子畸形仍未见增加，则可判定试验结果为阴性。在受试形仍未见增加，则可判定试验结果为阴性。在受试化学毒物化学毒物(dw)(dw)的毒性作用较低而不至于引起动物的毒性作用较低而不至于引起动物死亡时，应当记录最大的染毒剂量。死亡时，应当记录最大的染毒剂量。第11页/共16页第十二页，共16页。5.5. 结果分析结果分析精子畸形试验还可进行畸变类型分析，不同部位的畸精子畸形试验还可进行畸变类型分析，不同部位的畸形对精子的活动能力和使卵子受孕的能力有不同的影响。形对精子的活动能力和使卵子受孕的能力有不同的影响。可以结合可以结合(jih)(jih)精子计数、精子运动能力试验等对化学精子计数、精子运动能力试验等对化学毒物对雄性生殖系统的毒性作用做进一步的检测。毒物对雄性生殖系统的毒性作用做进一步的检测。第12页/共16页第十三页，共16页。6.6. 注意事项注意事项1 1在该试验过程中，虽然将精子悬液采用离心等在该试验过程中，虽然将精子悬液采用离心等方法方法(fngf)(fngf)除去组织残渣后再制片效果会更佳，除去组织残渣后再制片效果会更佳，但这使制片过程变得复杂化且更易造成人为误差。但这使制片过程变得复杂化且更易造成人为误差。2 2在镜检时要注意鉴别制片过程中人为造成的精在镜检时要注意鉴别制片过程中人为造成的精子损伤。特别要注意由于精子重叠和交叉所造成的子损伤。特别要注意由于精子重叠和交叉所造成的如多头、双头、双尾及多尾畸形等假象。如多头、双头、双尾及多尾畸形等假象。3 3在结果判定时，要注意排除机体某些如缺血、在结果判定时，要注意排除机体某些如缺血、变态反应、感染和体温增高等可能导致精子畸形率变态反应、感染和体温增高等可能导致精子畸形率增高的因素，以免造成假阳性结果。增高的因素，以免造成假阳性结果。第13页/共16页第十四页，共16页。双尾精子双尾精子(jngz)第14页/共16页第十五页，共16页。胖头精子胖头精子(jngz)第15页/共16页第十六页，共16页。