药品微生物限度检查用培养基的配制、灭菌和贮存效期验证的

药品微生物限度检查用培养基的配制、灭菌和贮存效期验证的研究张颖 安秀华 王建平 曹凤兰（天士力制药集团股份有限公司，天津 300410） 摘要 目的：本试验通过对药品微生物限度检查用5种培养基的配制方法、灭菌程序以及配制后贮存条件和贮存效期进行验证，确保每次配制的培养基质量均满足2010年版中国药典要求。方法：3次独立试验中确定了培养基的配制方法、灭菌参数（液体程序，121,15min）、贮存条件（洁净度为C级的环境）及贮存时间（45天），并对贮存0天、15天、30天和45天的培养基进行适用性检查(包括促生长能力、抑制能力、指示能力和无菌性)。结果：培养基在贮存0天、15天、30天和45天后的适用性检查结果均满足2010年版中国药典对培养基质量控制的要求。结论：通过该验证试验，确立了培养基的配制方法、灭菌参数、贮存条件及30天的贮存效期。关键词：微生物限度检查，培养基适用性检查，配制方法，灭菌参数，贮存效期Study on verification of the preparation, sterilization and thestorage life of the media used in drug microbial enumeration Tests ZHANG Ying, AN Xiu-hua, WANG jian-ping, CAO feng-lan(Tasly Pharmaceutical group CO., LTD, Tianjin 300410，China)Abstract Objective: In order to ensure the quality of every batch of prepared media which meet Chinese Pharmacopoeia requirement, the media preparation methods, sterilization procedures and the shelf life of prepared media are validated. Methods: The preparation procedure, sterilization parameters(Liquid procedure, 121,15min), storagecondition(cleanliness environment for class C) and storagetime(45 days)of the culture media for each test is determined, the performance of the media after sterilization stored 0 days, 15 days, 30 days and 45 days were checked(included sterilization, growth promotion indicative and inhibitory properties of the media.)Results: All media prepared in three tests which stored 0 days, 15 days, 30 days and 45 days in the cleanliness environment for class C met Chinese Pharmacopoeia requirement. Conclution: The preparation methods, sterilization procedures and the storage life of the 30 days of prepared media is confirmed through the verification test.Key Words: microbiological examination，applicability inspection of the culture medium, media preparation methods, sterilization parameters , storage life of prepared media培养基是否合格，对微生物的生长、分离、鉴定及检验结果的正确与否起着至关重要的作用，因此，对培养基的质量控制十分必要。适宜的培养基制备方法，合理存放，以及质量控制试验，是提供优质培养基的保证1 2。2005年版中国药典还没有规定对培养基进行适用性检查，经过修订，2010年版中国药典不但规定了培养基需进行适用性检查，而且在2010年版中国药典（一部 附录）中规定：“若采用已验证的配制和灭菌程序制备培养基且过程受控，那么同一批脱水培养基的适用性检查实验可只进行一次，如果培养基的制备过程未经验证，那么每一批培养基均要进行适用性检查试验” 2。本次验证试验的目的就是通过验证规范培养基的配制和灭菌过程，使培养基的整个配制和灭菌过程受控，同时确定培养基的贮存条件和贮存效期。关于该验证试验如何进行，并没有相关文献报道，本验证试验通过风险评估，选取接近效期的培养基（质量状况最差）进行验证试验，确保验证试验结果的可信度。1 材料与仪器设备1.1 培养基 营养琼脂培养基（批号110324）、玫瑰红钠琼脂培养基（批号100921）、胆盐乳糖琼脂培养基（批号1011302）、曙红亚甲蓝琼脂（批号100125）均由北京三药科技开发公司生产；营养琼脂对照培养基（批号135003-201002）和玫瑰红钠琼脂对照培养基（批号135005-201002）培养基由中国药品生物制品检定所提供；MUG培养基（批号200907）由北京牛牛基因有限公司生产； 1.2 菌种 大肠埃希菌（Escherichia coli）CMCC（B） 44 102；金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC（B） 26 003；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CMCC（B） 63 501；白色念珠菌（Candida albicans）CMCC（F） 98 001；黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC（F） 98 003均购自中国药品生物制品检定所。1.3 仪器设备 Thermo KS12型生物安全柜 （美国赛默飞世尔科技公司）；KB400型和BD240型生化培养箱（德国宾得）；JJ200型电子天平（ 常熟双杰测试仪器厂）；XG1.D型脉动真空灭菌柜（山东新华医疗器械股份有限公司）；2 方法和结果2.1 试验环境 试验在洁净度为A级的单向流空气的生物安全柜内进行，其环境洁净度为C级。检验过程严格遵守无菌操作。2.2 培养基的配制方法和灭菌参数2.2.1培养基的选择：分别随机抽取接近效期的5种脱水培养基各3瓶，按照2010年版中国药典培养基适用性检查中规定的方法，试验分别进行3次独立试验，每次从5种培养基中各选取1瓶进行试验。2.2.2 配制方法：按照培养基包装上的配制说明，固体培养基称取一定量的培养基置于容量为500ml的旋盖试剂瓶中，将纯化水加热煮沸后，量取定量纯化水注入装有培养基的试剂瓶中，将培养基溶解，每个试剂瓶配制量300ml，盖上但不拧紧瓶盖；液体培养基称取一定量的培养基，加入对应量的纯化水，加热溶解后分装于1000ml的旋盖试剂瓶中，BL分装量为900ml/瓶，盖上但不拧紧瓶盖；MUG分装于试管中，5ml/管，包扎；2.2.3 灭菌参数：配制、包扎好的培养基，装入脉动真空灭菌器中，以液体程序（灭菌参数为121，15min）进行灭菌，灭菌后测pH值。2.3灭菌后培养基的贮存和贮存后使用方法2.3.1 贮存条件：灭菌后的培养基旋紧密封旋盖，置于C级洁净区中密闭贮存45天，每天记录洁净区温湿度。45天的温湿度结果，温度在（1826，），湿度在（4060%）。2.3.2 贮存后的使用方法：灭菌贮存后的已经凝固的固体培养基，使用前，先于微波炉中融化（只能融化一次3），待培养基完全融化后，置于45左右的恒温水浴锅中，待培养基温度达到45后使用；灭菌后的液体培养基可直接分装使用。2.3.3 贮存时间、适用性检查项目和试验菌种：分别选取灭菌后贮存0天（即刚灭菌后未凝固的培养基）、15天、30天、45天后的5种培养基进行适用性检查，检查项目和试验菌种见表1。表1 各类培养基的适用性检查项目和试验菌种Table 1 Examination items and test strains of properties of the kinds of media培养基名称 (英文缩写)检查项目试验菌株拉丁缩写无菌性促生长 能力抑制 能力指示 能力营养琼脂培养基(NA)EColiS. aureusB. subtilis玫瑰红钠琼脂培养基 ( RBA)CalbicansA.niger曙红亚甲蓝琼脂培养基 (EMB)EColiMUG培养 ( MUG)EColi乳糖胆盐培养基(BL)EColiS. aureus注：为考察项；为不考察项；Note: check Items；not check list 2.4菌悬液的制备参照2010年版中国药典附录4中的方法制备EColi、S. aureus、B. subtilis、Calbicans和A.niger的菌悬液，用无菌的0.9%氯化钠溶液制成1ml含菌数为50100cfu的菌悬液。并用NA对照培养基测定各试验组中加入EColi、S. aureus和B. subtilis的数量。用RBA对照培养基测定各试验组中加入Calbicans和A.niger的数量。2.5 培养基适用性检查的试验方法及结果2.5.1 NA和RBA计数培养基促生长能力检查：按照表1中的检查项目，取上述制备的5种试验菌菌悬液各1ml（含菌数50100cfu），分别注入无菌平皿中，立即倾注对应的被检培养基和和对照培养基，每株试验菌平行制备4个平皿（2个被检培养基和2个对照培养基），混匀，凝固后，NA置3035培养48h；RBA置2328培养72h；培养结束后各平板平均菌落数。从表2可以看出，3次试验中3种试验菌在被检NA上的平均菌落数和2种试验菌在被检RBA的平均菌落数均不小于相应对照培养基上菌落平均数的70%，且菌落形态大小与对照培养基上的菌落一致。2.5.2 EMB固体选择性培养基促生长能力和指示能力检查：取EColi菌悬液 0.1mL（含菌数10-100cfu，测定结果见表3）涂布于被检EMB平板上，在3035培养18h。从表4可以看出，3次试验中试验菌在被检培养基上生长良好，长出紫黑色、菌落中心呈深紫色、稍凸起、边缘整齐、表面光滑湿润、有金属光泽的圆形菌落，其菌落大小、形态特征、指示反应情况均符合EColi的典型特征，与中国药典上描述的一致4。2.5.3 MUG液体培养基促生长能力和指示能力检查：取EColi菌悬液 1mL（含菌数不大于100cfu，测定结果见表3）接种到5ml被检MUG中，MUG在3035培养5h后观察现象，结果3次试验中试验菌在两种被检液体培养基中生长良好，培养基变浑浊，于365nm紫外光下呈现荧光反应，见表4。2.5.4 BL液体培养基促生长能力和抑制能力检查：取EColi菌悬液1mL（含菌数不大于100cfu，测定结果见表3）接种到1瓶100ml被检 BL中，置3035培养18h后观察现象；接种S. aureus菌悬液2ml（不少于100cfu，测定结果见表3）接种另1瓶100ml被检BL中，置3035培养24h后观察现象，结果（见表4）3次试验中EColi在被检培养基中生长良好，培养基变浑浊；S. aureus在被检培养基中被抑制，不生长，培养基澄清。2.5.4 无菌检查试验：培养基灭菌后，不接种任何样品，在对应的培养条件下培养。从表3和表4中各培养基的无菌性可以得出，固体培养基（NA、RBA和EMB）无菌落生长；液体培养基（MUG和BL）澄清，与空白对照一致，均满足无菌要求。表2 NA和RBA培养基适用性检查结果Table 2 The results of growth promoting and Sterility property of the NA and RBA media组次贮存时间 NA NARBA RBA促生长能力检查无菌性检查促生长能力检查无菌性检查被检培养基平均菌落数(cfu)/对照培养基平均菌落数(cfu)/菌液回收率被检培养基平均菌落数(cfu)/对照培养基平均菌落数(cfu) /菌液回收率EColiS. aureusB. subtilisC.albicansA.niger10天81/84/96%70/73/96%83/84/99%（-）63/67/94% 51/54/94%（-）15天64/71/90%78/84/93%70/72/97%（-）62/73/85%59/64/92%（-）30天70/73/96%81/86/94%74/75/99%（-）55/56/98%53/59/90%（-）45天83/92/90%74/81/91%81/86/94%（-）69/73/95%62/63/98%（-）20天70/77/91%79/83/95%73/75/97%（-）74/82/90%56/63/89%（-）15天62/69/90%71/75/95%72/78/92%（-）65/66/98%67/70/96%（-）30天76/80/95%68/72/94%62/72/86%（-）57/61/93%58/62/94%（-）45天75/79/95%59/67/88%58/66/88%（-）57/62/92%59/66/89%（-）30天80/81/99%74/77/96%80/82/98%（-）57/62/92%52/55/95%（-）15天77/82/94%79/83/95%67/72/93%（-）67/73/92%60/62/97%（-）30天66/67/99%77/80/96%68/71/96%（-）66/70/94%57/59/97%（-）45天63/67/94%78/82/95%72/75/96%（-）55/58/95%55/59/93%（-）注：（+）表明无菌性检查平板上有菌落生长； （-）表示无菌落生长； Note: (+) Growth of colonies; (-) no colonies表3 BL、MUG和EMB各试验组加入的试验菌测定结果Table 3 The results of test strains content in each group 组次贮存时间BL稀释度 平均菌落数(cfu)MUG稀释度平均菌落数(cfu)EColiEMB稀释度平均菌落数(cfu)EColiS .aureusEColi10天10-7 8410-7 13710-7 8410-6 7315天10-7 7110-7 15610-7 7110-6 8230天10-7 7310-7 16210-7 7310-6 7045天10-7 9210-7 15910-7 9210-6 8720天10-7 7710-7 16210-7 7710-6 6915天10-7 6910-7 14610-7 6910-6 7030天10-7 8010-7 14510-7 8010-6 7545天10-7 7910-7 13710-7 7910-6 7430天10-7 8110-7 14910-7 8110-6 8215天10-7 8210-7 16310-7 8210-6 7830天10-7 6710-7 14610-7 6710-6 7445天10-7 6710-7 15910-7 6710-6 69表4 BL、MUG和EMB培养基适用性检查结果Table 4 The results of growth promoting, Inhibitory, Indicative and Sterility propertyof the BL、MUG and EMB media组次贮存时间BLMUGEMB促生长能力抑制能力无菌性检查促生长能力指示能力无菌性检查促生长能力抑制能力无菌性检查EColiS. aureusEColiEColiEColiS. aureus10天（+）（-）（-）（+）（+）（-）（+）（-）（-）15天（+）（-）（-）（+）（+）（-）（+）（-）（-）30天（+）（-）（-）（+）（+）（-）（+）（-）（-）45天（+）（-）（-）（+）（+）（-）（+）（-）（-）20天（+）（-）（-）（+）（+）（-）（+）（-）（-）15天（+）（-）（-）（+）（+）（-）（+）（-）（-）30天（+）（-）（-）（+）（+）（-）（+）（-）（-）45天（+）（-）（-）（+）（+）（-）（+）（-）（-）30天（+）（-）（-）（+）（+）（-）（+）（-）（-）15天（+）（-）（-）（+）（+）（-）（+）（-）（-）30天（+）（-）（-）（+）（+）（-）（+）（-）（-）45天（+）（-）（-）（+）（+）（-）（+）（-）（-）注：BL：（+）试验菌生长良好,培养基浑浊；（-）试验菌被抑制，不生长，培养基澄清; MUG(促生长能力): (+)试验菌生长良好，培养基变浑浊（-）试验菌被抑制，不生长，培养基澄清；MUG(指示能力):（+）有荧光反应；（-）无荧光反应；EMB：（+）试验菌生长良好，且菌落形态符合大肠埃希菌典型菌落形态；（-）无典型菌落或者无菌落生长Note: BL（+）the test strains grew well, the medium become turbid ; (-) the test strains did not grow, the medium become clarifying; MUG (Growth promoting): (+)the test strains grew well, the medium become turbid ; (-) the test strains did not grow, the medium become clarifying ; (Indicative)：（+）has fluorescence reaction；（-）has no fluorescence reaction； EMB: （+）the test strains grew well; The possible presence of EColi is indicated by the growth of well-developed, red colonies, with or without red centers.3 结论按照2.2.2项下方法配制NA、RBA、BL、MUG、EMB培养基，以液体程序和121、15min的灭菌参数进行灭菌后，贮存于洁净度为C级环境中，分别在贮存0天、15天、30天和45天时对培养基的适用性进行考察，试验结果表明3次独立试验中，贮存45天内的培养基，无菌性、促生长能力、指示能力和抑制能力均符合2010年版中国药典规定，为了更有把握地确保培养基的质量，确定5种培养基的贮存有效期为30天。4 讨论.4.1 人员对培养基贮存效期验证的影响不同实验人员的操作，特别是配制过程和贮存过程的操作，会对每批培养基质量的一致性产生影响。验证之后将配制、灭菌、贮存和使用的操作方法详细规定在培养基配制、灭菌、贮存和使用的标准操作规程文件中，指导操作；验证中的3次独立操作由不同的实验人员来进行；为确保验证方法操作的一致性，对相关人员进行培训。4.2环境对培养基贮存效期验证的影响培养基配制和贮存的环境可能会造成培养基的质量差异。验证试验中培养基配制在室温条件，一般操作间环境下进行；灭菌后培养基在C级洁净区（湿度在40%60%，温度在1826）内贮存；验证过程中试验环境均满足洁净区的温湿度环境。 4.3脱水培养基对培养基贮存效期验证的影响原料脱水培养基的不同厂家和不同批号，会对配制培养基的质量产生显著影响；原料在使用前的贮存条件和贮存时间也会对配制培养基的质量产生影响。故本验证试验固定供应商：药品检验用培养基均为北京三药科技开发公司生产，如更换脱水培养基生产商，则需重新进行本验证；本次验证选用了一个批次的脱水培养基，因此规定，如生产商不变，更换脱水培养基的批号，也应重新对该批脱水培养基进行适用性检查。本次验证选取最差条件，即抽取3瓶近效期的脱水培养基进行考察。4.4灭菌程序对培养基贮存效期验证的影响 灭菌设备和灭菌参数的选择，会对培养基的质量产生显著影响。本验证中使用的灭菌柜通过了性能确认，并定期开展再确认；灭菌程序在培养基配制、灭菌和贮存标准操作规程文件中明确规定，灭菌参数严格参照各类培养基的使用说明执行。4.5 培养基的配制方法、灭菌程序和贮存期验证工作的意义口服中药制剂微生物限度检查中，主要检查项目有细菌、霉菌和酵母菌的计数检查以及大肠埃希菌的定性检查，使用的培养基主要有NA、RBA、BL、MUG和EMB培养基。故本实验选取使用频率较高的5种培养基进行配制方法、灭菌参数和贮存期验证的试验。通过这次验证试验，一方面由原来配制一批培养基进行一次适用性检查，变为现在每一个批号的脱水培养基只需进行一次适用性检查，该项每月节约6天工时；更重要的是通过这次验证改变了灭菌后培养基贮存效期没有数据支持的现状，确认了贮存效期为30天，不但减少了培养基的配制频次，而且使培养基的整个配制、灭菌和贮存过程受控，确保每次配制的培养基满足微生物限度检查的要求。参考文献1苏德模, 胡昌勤,马越.美英欧药典微生物限度标准的浅析J.中国药品标准, 2005, 6(3):20-292国家药典委员会编.中华人民共和国药典（一部）S.2010年版.北京：中国医药科技出版社，附录X:139-1403吕红.药品微生物学检查中培养基加热熔化次数对菌检率影响的研究J.中国药房，2006，17(12):937-9384国家药典委员会编.中华人民共和国药典（一部）S.2010年版.北京：中国医药科技出版社，附录X:80-83