离子交换色谱-

. .离子交换色谱- 紫外检测法测定乳制品中三聚氰胺何强1, 孔祥虹1, 李建华1, 乐爱山1, 赵洁2( 1. *出入境检验检疫局, *710068; 2. *理工大学理学院, *710054)摘要:建立离子交换色谱- 紫外检测法测定乳制品中三聚氰胺。样品直接用水和乙腈提取, 分析时用LC - SCX离子交换色谱柱别离, 浓度为0.05 mol/ L磷酸二氢钾溶液( pH值为3.0) - 乙腈( 70 30) 为流动相, 流速1.0 mL/min, 在紫外波长240 nm下检测。三聚氰胺在0.5 100.0 mg/ L的范围内, 质量浓度与色谱峰面积呈良好的线性关系( r=0.9999) , 最低检出限为1.0 mg/ kg, 加标回收率在93.8 % 102.5 %范围内, 相对标准偏差(RSD) 小于3.5 %。该方法简便、快速、准确, 能够满足检测要求。关键词:三聚氰胺; 乳制品; 离子交换色谱Determination of melamine in dairy products with ion exchange chromatographyand UV detectionHE Qiang1, KONG Xiang- hong1, LI Jian- hua1, YUE Ai- shan1, ZHAO Jie2(1. Shaanxi Entry - Exit Inspection and Quarantine Bureau, Xi an 710068, China; 2. College of Science, Xi an Universityof Technology, Xi an 710054, China)Abstract: A method was developed for the determination of melamine in dairy products with ion exchange chromatography. Samples wereextracted with water and acetonitrile. Chromatographic analysis was performed on a LC - SCX column eluted with 0.05 mol/ L KH2PO4(pH=3.0) - acetonitrile (7030) at a flow rate of 1.0 mL/min and UV detection at 240 nm. The present method showed good linear relationship(r = 0.9999) for melamin at the range of 0.5 100.0 mg/ L, the detection limit were 1.0 mg/ kg, the recoveries ranged from 93.8 % to102.5 % with relative tandard deviations (RSD) less than 3.5 %. The ethod is simple, fast, accurate for the melamine analysis.Key words: melamine; dairy products; ion exchange chromatography正文：最近美国FDA调查确认宠物食品受三聚氰胺污染是造成许多宠物非正常死亡的原因, 从而要求出口到美国的含蛋白产品必须检测三聚氰胺,已经对我国的食品出口企业产生了较大的负面影响。三聚氰胺(melamine)简称三胺, 学名三氨三嗪, 别名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺, 分子式为C3N6H6, 是一种重要的氮杂环有机化工原料, 具有一定的肾毒性。因为其分子中含有大量氮元素, 而用全氮法检测蛋白质含量时不能够区分这种“伪蛋白氮, 所以一些不法厂家, 往产品中添加三聚氰胺粉以提高蛋白质含量。乳制品是人类最常用的富含蛋白食品之一, 检测“伪蛋白三聚氰胺, 对保证乳制品的质量平安、维护人们的身体*和促进对外贸易具有重要意义。文献报道的三聚氰胺的检测方法有HPLC 法、HPLC - MS / MS法、GC - MS法2- 7, 但乳制品中的三聚氰胺的检测尚未见有文献报道。本研究建立了测定乳制品中三聚氰胺的离子交换色谱法, 该方法简便、快速, 实用性强, 回收率良好, 检测结果稳定可靠。1. 实验1.1 仪器和试剂Agilent 1200型高效液相色谱系统: 配四元泵、DAD检测器、自动进样器及色谱数据处理工作站( 美国Agilent公司) ; 乙腈( 色谱纯) ; 磷酸、磷酸二氢钾( 分析纯) ; 水为超纯水( PURELAB PULS超纯水器制备) ;SUPELCOSILTM LC - SCX离子交换色谱柱( 25 cm4.6 mm, 5 m) 。三聚氰胺标准品( 纯度99.5 %) 。标准储藏液及工作液的配制: 将三聚氰胺标准品用乙腈配制成100 mg/mL的储藏液, 于4 条件下保存。使用时用水稀释, 配制成不同浓度的混合标准工作溶液。1.2 色谱条件流动相: 浓度为0.05 mol / L磷酸二氢钾溶液( 磷酸调pH值至3.0) - 乙腈( 7030) ; 流速: 1.0 mL/min;色谱柱温度为30 ; 检测器: 二极管阵列检测器; 检测波长为240 nm; 进样量为10 L。应用上述条件, 取1.0 mg/ L的三聚氰胺标准品溶液进样, 色谱图如图1所示。1.3 样品前处理1.3.1样品制备纯牛奶、酸牛奶等液体样品: 直接称取混合均匀的样品5.0 g( 准确至0.01 g) 。酸乳、果乳等较稠的样品: 称取混合均匀的样品5.0 g( 准确至0.01 g) , 参加5 mL水, 涡旋混匀。奶粉等固体样品: 称取充分混匀的样品5.0 g( 准确至0.01 g) , 参加10 mL水, 涡旋混匀。1.3.2提取向1.3.1制备好的样品中参加35 mL乙腈, 振摇提取5 min , 用水定容至50.00 mL, 4000 r / min 离心5 min, 上清液过0.45 m的滤膜, 进样检测。纯牛奶、酸牛奶、酸乳、果乳、奶粉等5种乳制品的HPLC 色谱图如图2( a) 所示, 添加三聚氰胺均为10.0 mg/ kg时的HPLC色谱图如图2(b)所示。2 结果与讨论2.1 线性范围、检出限及回收率配制三聚氰胺质量浓度为0.5, 1.0, 2.0, 5.0, 10.0,20.0, 50.0, 100.0 mg/ L 的系列标准品溶液, 按照1.2中的色谱条件进样检测, 并以标准品质量浓度(X) 为横坐标, 峰面积(Y) 为纵坐标作图, 同时用最小二乘法进展线性回归, 得标准曲线回归方程为Y = 40.152 X -5.2576( r = 0.9999) , 在0.5 100.0 mg/ L范围内, 标准品质量浓度与峰面积值具有良好的线性关系。将标准品溶液稀释进样, 以信噪比为10( S / N =10) 计算, 三聚氰胺的最低检出质量浓度为0.1 mg/ L,按1.3中样品处理方法,乳制品中三聚氰胺最低检出限为1.0 mg/ kg。对15份纯牛奶样品进展加标回收试验, 分2.0, 10.0, 50.0 mg/ kg三个加标水平, 结果如表1所示。由表1可以看出, 回收率均在93.8 % 102.5 %之间,RSD小于3.5 %, 重现性良好。表1 方法回收率及精细度测定结果( n=5)加标量/ (mg/ kg)2.010.050.0回收率/%94.1100.493.8102.196.9102.5平均回收率/%97.398.699.8RSD/%3.253.491.892.2 样品检测利用本文建立的方法对购自乳制品零售市场的5类共10种乳制品进展了检测, 该方法对这些样品均具有良好的适用性, 色谱无干扰, 回收率均大于96.3 %, 检测结果如表2所示, 在所检样品中三聚氰胺均未检出。2.3 讨论2.3.1色谱条件的选择利用常用的C18色谱柱检测三聚氰胺时, 所需流动相组成复杂, 而且别离效果不佳, 色谱峰形不理想,基线不平稳, 本实验选用强阳离子交换树脂柱进展别离, 别离效果良好, 基线平稳, 色谱峰形锋利( 图2) 。表2 样品检测结果样品样品 纯牛奶 酸牛奶 酸乳 草莓味果乳 纯羊奶粉样品数量 23212检测结果/ (mg/ kg)未检出 未检出 未检出 未检出 未检出回收率/%97.896.398.497.296.3在流动相选择时, 考察了离子浓度、pH值及乙腈比例对色谱别离的影响。三聚氰胺对流动相中磷酸二氢钾溶液浓度变化比拟敏感, 其他条件不变, 磷酸二氢钾溶液浓度由0.05 mol/ L变为0.02 mol/ L时, 那么三聚氰胺在色谱上不能出峰, 磷酸二氢钾溶液浓度为0.1 mol/ L时, 三聚氰胺保存时间为6 min左右, 出峰时间过早, 与乳制品中干扰峰不能有效别离。流动相的pH值对三聚氰胺的出峰时间和别离效果影响明显,pH值为3.0时, 色谱保存时间和别离度均较为理想( 图2) , pH值升高至6.0, 那么三聚氰胺在色谱柱上根本无保存, 出峰时间在3.5 min左右, 与干扰峰重叠。三聚氰胺对流动相中乙腈比例变化不敏感, 乙腈比例由15 %变化至40 %, 三聚氰胺保存时间均保持在10 min左右, 但干扰峰对乙腈比例变化较敏感, 利用这一特点, 可使三聚氰胺与干扰峰有效别离, 在乙腈为30 %时别离良好。2.3.2提取条件的选择提取时考察了三氯乙酸水溶液、乙酸铅水溶液、乙腈的沉淀蛋白效果, 发现三氯乙酸水溶液、乙酸铅水溶液均需在浓度较大的条件下才能够有效的沉淀乳制品中蛋白质, 但三氯乙酸、乙酸铅的浓度过大会影响色谱柱的使用寿命, 甚至会造成色谱系统的堵塞, 而乙腈的沉淀蛋白的效果良好, 三聚氰胺的回收率在93 %以上, 提取液与流动相的组成根本一样, 有利于保护色谱系统, 所以选用乙腈作为提取溶剂。提取时, 样品先用水充分分散、混匀, 然后再沉淀蛋白, 可以提高三聚氰胺的回收率, 但在蛋白质沉淀前样品中的水最好不要超过15 mL, 否那么沉淀蛋白的效果不佳。3 结论本研究首次建立了乳制品中三聚氰胺的检测方法, 该方法简便、快捷、稳定、可靠, 对乳制品中的三聚氰胺检测具有广泛的适用性, 对于鉴别乳制品中的“伪蛋白, 监控“以次充优现象, 控制乳制品的质量平安, 保障人们的饮食平安具有积极的社会意义。参考文献1 U.S. Food and Drug Administration: Interim melamine and analoguessafety / risk assessment EB/OL. ( 2007- 05- 25) . :/ /.cfsan.fda.gov.2 WENDY C A, SHERRI B T, CHRISTINE M K, et al. Determinationof Melamine Residues in Catfish Tissue by Triple QuadrupoleLC- MS- MS with HILIC ChromatographyJ. Laboratory InformationBulletin, 2007, 23 : 4396.3 YOKLEY R A, MAYER L C, REZAAIYAN R. Analytical Methodfor the Determination of Cyromazine and Melamine Residues in SoilUsing LC- UV and GC- MSDJ. J Agric Food Chem, 2000, 48: 3352- 3358.4 SANDHO J V, IBANEZ M, GRIMALT S, et al. Residue Determinationof Cyromazine and Its Metabolite Melamine in Chard Samples byIon - pair Liquid Chromatography Coupled to Electrospray TandemMass Spectrometry J. Analytica Chimica Acta, 2005, 530 (2): 237 -243.5 ONO S, FUNATO T, INOUE Y, et al. Determination of MelamineDerivatives, Melame, Meleme, Ammeline and Ammelide by High -performance Cation- exchange Chromatography J. Journal of ChromatographyA, 1998, 815 (2): 197 - 204.6 ISHIWATA H, INOUE T, YAMAZAKI T, et al. Liquid ChromatographicDetermination of Melamine in Beverages J. J Assoc Off AnalChem, 1987, 70 (3): 457 - 460.7 TAKIKO S, HAJIMU I, KUNITOSHI Y, et al. Determination ofMelamine and Three Hydrolytic Products by Liquid ChromatographyJ. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 1990,44 (4): 567 - 571.- 优选