miRNA地作用效果机制及功能研究进展

wordmiRNA的作用机制与功能研究进展王娟学院生物系， 253023摘要microRNA (miRNA)是源性的大小在20-25nt的一类非编码RNAs，具有调节基因表达活性的功能，广泛存在于真核生物体，并在进化中保守。miRNA的广泛存在与进化上的保守性，暗示它在生命活动中具有必不可少的调节作用，他们参与动植物生长发育、细胞分化、细胞增殖与调亡、激素分泌、肿瘤形成等各种过程。本文总结了近几年来在miRNA的特征、生物发生、作用机制与功能意义上的研究进展。miRNA无论在数量上还是功能上，可能都远远超过目前的发现，对其进展深入的研究，将有助于我们对生物体的各种生理病理机制的理解，并最终为疾病的诊断和治疗提供新的思路和理论根底。关键词siRNA； microRNA； piRNA; 微处理器;核糖核酸切酶; 基因调控; 生长发育； 肿瘤治疗前言2006年，Andrew Fire 和Craig Mello 由于在RNAiRNA interference，RNAi与基因沉默现象研究领域的杰出贡献而获得诺贝尔医学奖，这再次将人们的注意力拉到siRNA这样一种小分子RNA上。小分子RNA包括一个大家族，并在真核生物中具有广泛的调节功能。目前已经有至少两种小分子RNA被描述：来源于发夹状前体的miRNAs (microRNAs)和由长的dsRNAs加工而来的siRNAs (small interfering RNAs)。研究发现，miRNA与siRNA有很多相似之处，但也有很大的不同，二者的区别将在以下文中进展论述。最近又有文章报道了一种新的小分子RNA的发现25piRNAs (piwi-interacting RNAs),他们特异地在小鼠的生精细胞量表达。这些RNAs比以前发现的大多数小RNAs较大，约2631nt(nucleotides)，并与Argonaute蛋白家族的Piwi亚枝(Piwi-subclade)成员相联系。Argonaute 蛋白大约100KD，具有PAZ(Piwi Argonaut and Zwille)和PIWI结构域。一种小RNA分子引导Argonaute蛋白识别靶分子并介导基因沉默。Argonaute家族被分为Ago和Piwi两个亚枝。一般，Ago成员广泛存在并与miRNAs和siRNAs有关，而Piwi成员如此限制在种系细胞和干细胞中表达。克隆的piRNAs 在染色体中表现出极不均匀的分布，大多数piRNAs簇集于染色体中相对较小的基因座位，大小约1 kb到100 kb包含104500个小RNAs。尽管目前对这些RNAs的生物发生和功能还不清楚，但这些发现为小RNA生物学和种系细胞生物学增加了新的容。本文将重点论述miRNA的最新研究进展，miRNA自被发现，迅速成为近几年生命科学领域的研究热点。对它的研究将会对转录后基因调节领域的开展产生深远影响。miRNA是一类长度约为22nt的小分子非编码单链miRNA，由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体pre-miRNA加工而来，能够和互补或局部互补的靶mRNA的3末端非翻译区(3untranslationalregion,3UTR)结合，使mRNA降解或介导其翻译抑制。miRNA家族的成员是在研究秀丽线虫的发育转变过程中作为小分子短暂RNAstRNA被发现的。研究发现，miRNA是stRNA中的一个大家族，并且在线虫、果蝇、植物、哺乳动物、甚至病毒中均有发现。这类小RNA在表达上具有组织和时间的特异性，是调节其他功能基因表达的重要调节分子，在生物体的各种生命活动过程中发挥着重要作用。1 miRNA的发现与命名早在1993年Lee等20利用遗传分析的方法已经在线虫中发现一个22nt的小分子非编码RNA:lin-4。Lee等注意到，lin-4或lin-14突变后造成线虫发育差时表型(heterochronic phenotype)，在线虫发育早期起作用的lin-4基因的突变使线虫中应该在早期出现的发育事件延迟发生，而lin-14基因的缺失突变却造成了完全相反的结果。后来证明，这种lin-4基因编码的约22个核苷酸的单链RNA通过不完全互补的方式结合到靶mRNA(target mRNA)lin-14的3末端非翻译区(3untranslationalregion，3UTR)，短暂下调lin-14蛋白的水平，促使线虫从L1期向L2期的过渡，但并不影响mRNA的水平。2000年Reinhart等22发现了另一个类似的具有转录后调节功能的小分子RNA:let-7。第二个miRNA let-7的发现掀起了寻找miRNA的热潮，拟南芥、线虫、果蝇、小鼠、以与人类等各种生物与病毒中都相继有miRNA的报道,且主要以模式生物为主。miRNA种类的普遍性与多样性预示着它在生物界中具有更广泛的功能。miRNA的命名，除最早发现的几种miRNA如：lin-4 和let-7等以外，其他发现的都用“miR-#来表示12，“#为阿拉伯数字如miR-1，miR-2，对应的基因也用这三个字母后缀加数字命名，具体根据不同物种的命名习惯采用连字符、斜体或大写如线虫和果蝇中的mir-1，水稻和拟南芥中的MIR-156。2 miRNA的特征与与siRNA的比拟2.1 miRNA的特征 2.1.1 结构特征 长度为22nt是miRNA一个最根本的特征, 且具有能形成分子茎环结构的前体。在动物中,前体的长度一般在7090nt,而在植物中前体的长度可变性很大,可以从几十到数百nt。2.1.2 miRNA的存在形式 miRNA基因常以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种形式存在于基因组中, 在基因组中有固定的基因座位，7090位于蛋白基因的基因间隔区(intergenic region,IGR)，其余在含子，还有个别在编码区的互补链，说明它们的转录独立于其他的基因,具有本身的转录调控机制。最近有研究21发现，25%的人类miRNA位于蛋白质编码基因的基因区域(intronic regions)，其约50%定位于含子(introns)中,这些miRNA都具有独立的转录单元，可以作用于其主基因(host gene)的非翻译区(untranslated region，UTR)下调其蛋白质编码基因的表达水平，并且还可以作为重要的负反应调节子。2.1.3 保守性miRNA不仅在结构上保守而且在物种间具有高度的进化保守。结构上，miRNA 在颈部的保守性较强，而环部可以容纳较多的突变位点的存在。种系上，有些miRNA在一些物种中是高度保守的。约12的miRNA在线虫、果蝇、哺乳动物和植物中呈现保守性，经序列比拟发现，这些保守片断的碱基差异仅为12 nt；miR-1、miR-34、miR-87在非脊椎动物和脊椎动物中高度保守。在线虫中,发现85 %的miRNA 在C. briggsaze 基因组序列中是有同源物的18。最具有miRNA保守性的是let-7 RNA,let-7在C. elegans和人类中完全保守；大约40的C. elegans中的miRNA在人类中也是保守的。线虫C.elegans中的let-7 miRNA可以在果蝇基因组,人的第9、11和22条染色体上各找到一个与之完全一致序列,另外在人的第9条染色体上还有一个仅差1个核苷酸的序列10。2.1.4 时空特异性 目前研究较清楚的lin-4与let-7呈时间特异性表达。在C.elegans中，lin-4只在幼虫的第一期和第二期存在;let-7却存在第三、第四期与成虫期,在第一和第二期并不存在；在拟南芥中，miR157在幼苗中高表达，miR171如此在花中高表达23。同时,miRNAs的表达具有组织特异性。例如，mir-290mir-295只在鼠胚胎干细胞中表达，而在成体组织主要在胸腺和骨髓中表达14。最近一项研究28发现，miRNA靶目标在成熟小鼠和果蝇组织中的表达水平要比在胚胎中低，同时，miRNA更倾向于靶向广泛表达的而不是组织特异性表达的基因，这项结果明确了miRNA广泛地参与胚胎发育与成体组织特性的维持。2.2 miRNA与siRNA的比拟miRNA与siRNA的根本区别是他们来源不同，而二者的作用机制相通。首先，miRNA与siRNA之间有许多一样之处：1.二者的长度都约在22nt左右。2.二者都依赖Dicer酶的加工，是Dicer的产物，所以具有Dicer产物的特点: 5端磷酸，3端均有2个游离核苷酸。3. miRNA和siRNA合是由双链的RNA或RNA前体形成的。4. 二者都是RISC(RNA induced silencing plex)组分，都具有组成RISC复合体的Argonaute蛋白家族，其功能界限已变得不清晰，如二者在介导沉默机制上有重叠。miRNA和siRNA也有区别。1.根本区别是miRNA是源的，在基因组中有固定的基因座位；siRNA可以是人工体外合成的，也可以是基因组的转录片断，降解片断和转座片断，病毒基因组转录片断等，关键在于siRNA没有固定的基因座位，本身不是基因组的功能片断，是随机产生的，即加工位点不是保守的。2.二者结构上没有本质区别，功能分子都是单链RNA，miRNA转录出来时必然是发夹状的，siRNA可以由完全互补的双链切断而来，也可以从发夹来。3.本质区别在于作用位点上，miRNA作用于固定的靶基因，有特定的作用位点，一般在靶基因3-UTR区，而siRNA由于是随机产生的或者人工设计的，因此作用位点可以设计或改变，可作用于mRNA的任何部位。4.在作用方式上，没有本质区别，是否降解或翻译抑制取决于互补程度，siRNA也可抑制靶标基因的翻译。5.miRNA的生理功能在于调控发育分化和调亡，适时调节源基因表达，而siRNA是生物抵抗外来核酸片断入侵的一种方式，原始作用是抑制转座子活性和病毒感染。miRNA与siRNA的区别总结于表12。表1 miRNA和siRNA的区别 特性 miRNAsiRNA 来源 源转录本 转基因、病毒RNA大小 约22nt 约22nt前体 茎环状的pre-miRNA 双链结构的dsRNA催化酶 Drosha、Dicer或类似 DicerDicer的酶复合体RISC复合体 含Argonaute蛋白家族 含Argonaute蛋白家族匹配方式 不完全互补动物或 完全互补 完全互补大多数植物作用目标的专一性 相对较低 高 (特异性)续表1特性 miRNAsiRNA作用点 蛋白质合成水平 转录后水平靶基因的命运 抑制转录或者被降解 被降解功能 发育过程中调节 抑制转录活性、病毒 源基因的表达 感染、表型遗传3 miRNA的生物发生 目前，关于miRNA的生物发生的研究已经取得较大进展。动物(尤其是人) miRNA 的生物合成过程已经初步得到了诠释。miRNA的生物发生过程如图14所示。图1 miRNA的生物发生过程大多数miRNA是由基因间DNA序列编码的,转录方向与相邻的基因往往相反,被认为是与基因表达不同的独立单位。基因组DNA在RNA聚合酶的作用下产生原始miRNA转录本(primary transcripts, Pri-miRNA)。Pri-miRNA在5端具有甲基化的鸟嘌呤,而3端具有多聚腺嘌呤碱基。另外一类miRNA是位于基因的含子中,并会随着信使RNA(mRNA)转录,包含在mRNA的前体中。这一类miRNA的转录方向是和对应的mRNA转录方向一致的,因此一般认为此类miRNA的表达和对应的mRNA一样具有组织特异性11。pri-miRNA在一种叫做微处理器的复合体的作用下，剪切为约70个核苷酸长度，一端5磷酸，一端3端两个悬垂，且具有茎环结构的miRNA 前体(precusor of miRNA,pre-miRNA)。细胞核中的微处理器在不同的生物体中，所包含的成分不尽一样。在线虫、果蝇与哺乳动物体，该复合体至少包含有两种蛋白质成分，分别为Drosha和Pasha(Partner of Drosha)。Drosha的主要作用是剪切pri-miRNA形成3端2nt悬垂的pre-miRNA，Pasha为dsRNA结合蛋白，参与Drosha对底物的识别6。在人类，Pasha又称为DiGeorge综合征关键区域基因8(DGCR8)。对DGCR8的研究结果显示, DGCR8是由染色体22q11. 2的一个基因编码,对miRNA在发育过程中有重要调节作用。3.2 pre-miRNA的出核转运在最初的剪切后，pre-miRNA在Ran-GTP 依赖的核质/细胞质转运蛋白Exportin 5 的作用下，从核运输到细胞质中。Exportin 5与Ran-GTP 以与pre-miRNA形成异三聚体，通过核孔到达胞浆，然后，Ran-GTP转变为Ran-GDP，释放pre-miRNA。3.3 细胞质中miRNA的成熟一旦pre-miRNA被运送到细胞质中,第二种RNA切酶,称为Dicer(双链RNA专一性RNA切酶),对茎环前体一端5磷酸，一端3端两个悬垂的结构有特殊亲和力，在Dicer进一步的作用下，miRNA前体被剪切成2125个核苷酸长度的双链miRNA。起初，成熟miRNA 与其互补序列互相结合成所谓miRNA:miRNA* 双螺旋结构(miRNA* 是miRNA 的互补序列); 随后，在解旋酶的作用下，双螺旋解旋，其中一条结合到RNA诱导的基因沉默复合物(RNA-induced silencing plex，RISC)中，形成非对称RISC复合物(asymmetric RISC assembly)。该复合物会结合到目标靶mRNA上，从而引起靶 mRNA 的降解或者翻译抑制。在miRNA miRNA*双螺旋中，只有其中一条单链可以选择性结合到RISC上去而成为成熟miRNA，然后另一条立即被降解。尽管从理论上来说成熟miRNA的产生是随机选择的结果，但由于两条链的稳定性有所不同，导致机会的不等。如图23所示miRNA miRNA*双螺旋结构中两条链的3端均有2个游离核苷酸。此外，它的两条链是不完全对称的：miRNA链上靠近5端有一个不与miRNA*链相应位置配对的小突起。这个小突起显著地减弱了miRNA 5端的稳定性。由于成熟的miRNA产生总是趋向于选择更不稳定的5端，因此miRNA链被选中的机会要大大多于miRNA*链(大约100倍)。结果往往是双链解开后miRNA链结合到RISC中以做靶识别,而miRNA*如此被迅速降解。这样极度不对称的选择性的好处是，不会因为miRNA*链结合到RISC中的比例过多而显著降低miRNA对翻译的抑制效率3。图2 miRNA miRNA*双螺旋结构示意图由上可知，miRNA成熟过程中的连续加工，需要至少两种核糖核酸切酶-RNAase：Drosha和Dicer催化，两者都是特定dsRNA的RNA切酶。近年来对核糖核酸切酶-8的研究也有了一定进展。 核糖核酸切酶家族依据其蛋白结构域的组成不同，可以分为3个种类。第一类包括一个保守的核糖核酸切酶结构域(RNasedomain,R。第一类除了参与rRNA前体的加工成熟过程以外,还参与mRNA、tRNA前体的加工成熟过程。体外实验都证明,无论是外源性还是源性的dsRNA,均可以被机体的核糖核酸切酶识别并且进展切割,产生约为1215个核苷酸长度的siRNA。此siRNA的特点是5端有磷酸基团,3端有羟基基团,并且3端突出23个核苷酸长度, 5端凹陷。由核糖核酸切酶产生的siRNA与机体的一些酶等辅助因子形成蛋白质-RNA复合物,即为RNA引导的沉默复合物(RISC)。在RISC的指导下,siRNA中的反义链寻找与其同源的mRNA区域,并且在RISC的核酸切酶的作用下降解同源mRNA,使相应基因封闭。第二类包括2个RD(Ra和Rb)和1个dsRBD，如Drosha与其同源物，仅在动物细胞中有发现。Drosha定位于细胞核,可以识别核的pri-miRNA并将其切割成发夹样结构,约含有70个核苷酸长度的miRNA前体(pre-miRNA),然后通过转运蛋白exportin-5,结合形成exportin-5、Drosha、pre-miRNA的蛋白-RNA复合物,将pre-miRNA 由细胞核转运至细胞质。第三类如Dicer与其同源物，广泛存在于原核、真核与植物当中,由多个结构域组成，除了有2个RD(Ra和Rb)和1个dsRBD外，还有1个长的N末端，此末端中含有1个DExH RNA螺旋酶/ATP酶结构域、DUF283结构域和PAZ结构域, 这种酶可以和含有PP结构域(PAZ Piwi domain,PPD)的蛋白质相互作用。这种核糖核酸切酶-在真核细胞定位于细胞质中,分散地分布于核糖体上,并且参与miRNA的加工成熟过程。它可以识别具有茎-环样结构约含有70个核苷酸长度的pre-miRNA,并且对其进展切割产生成熟miRNA。4 miRNA的作用机制 miRNA在发挥作用之前，需要同细胞一些协同因子结合形成蛋白质- RNA复合物miRNA-containing ribonucleoprotin，miRNP，在miRNP的作用下指导其识别同源mRNA。在Hela细胞裂解液中发现这类核糖核酸蛋白复合物的大小在15S左右，其主要成分为Germin3、Germin4和Argonaute蛋白家族成员eIF2C2因子,后两种蛋白质与运动神经元的存活(survival of motor neurons,SMN)有关10。研究认为，miRNP即为RISC.miRNA与靶mRNA作用的典型方式主要有两种(如图3，图416)：在大多数情况下(例如在动物中)，复合物中的单链miRNA 与靶mRNA的3 UTR不完全互补配对，阻断该基因的翻译过程，从而调节基因表达。这种方式只影响蛋白表达水平，并不影响mRNA的稳定性。目前，该翻译抑制的详细机理尚不清楚。最近有研究对此提出质疑，他们24认为，正常衰退途径引起的mRNA降解速度的升高也会导致蛋白质表达水平的下降，且miRNA不仅能作用于翻译起始后的延长阶段，还能够抑制翻译的起始。被抑制的靶mRNAs和miRNAs共同聚集于胞浆中被称为P-bodies的区域，这个区域还浓缩了许多参与mRNA降解的酶类。然而，P-bodies可能是作为未翻译mRNA进展暂时的可逆储存的容器，并且，减少一些特定P-body组成蛋白的表达能够缓和miRNA介导的基因表达抑制。P bodies13是胞浆中的一定区域(如图3)，它包含参与多种转录后过程的蛋白质，例如：mRNA降解(mRNA degradation)、无义介导mRNA衰退(nonsense-mediated mRNA decay ,NMD)，转录抑制与RNA介导的基因沉默(RNA-mediated gene silencing)。尽管P bodies不是介导基因沉默所必需的，但阻断siRNA或miRNA基因沉默途径的任何一步都会阻碍P-body的形成，这明确P-body是基因沉默的结果。因此，尽管P-body成分在mRNA沉默与衰退中起重要作用，但P-body中的这种聚集并不是介导基因沉默机制所必需的，而只能作为他们活动的结果。图3 P bodies的作用机制另一种作用方式是，当miRNA与mRNA完全互补配对时，引起目的mRNA在互补区的特异性断裂，从而导致基因沉默，这种作用方式与 siRNA类似。如大多数植物在可读框(ORF)中与它的靶位点几乎完全配对。这种mi/siRNA介导的基因沉默机制已得到了相关的阐释。以siRNA参与的RNAi为例进展说明，siRNA可与RISC结合,作为模板识别mRNA靶子，通过碱基互补配对原如此，mRNA与siRNA中的反义链结合，置换出正义链。双链mRNA在Dicer酶、ATP和解旋酶共同作用下产生22nt左右的siRNA，siRNA继续同RISC形成复合体，与siRNA互补的mRNA结合，使mRNA被RNA酶裂解。这个过程也称为转录后基因沉默(PTGS)。miRNA以何种方式与目的基因作用和miRNA与目的基因的配对程度有关。MiRNA与目的基因配对不完全时，miRNA就以抑制目的基因的表达方式作用；miRNA与目的基因某段序列配对完全时，就可能引起目的基因在互补区断裂而导致基因沉默。图4 miRNA的两种作用机制这两种作用机制是最早被发现和熟知的，除此之外，近期，PNAS刊载一项最新的发现：快速脱腺苷酸化(accelerated deadenylation)是 miRNA 抑制基因表达的新机制26。Wu 等以miR-125b 和 let-7 两种代表性的miRNA为研究对象，在哺乳动物细胞中发现它们能够促进mRNA 聚腺苷酸尾巴 (polyA tail)的去除。他们认为miRNA去除聚腺苷酸尾巴的能力不是由于降低翻译水平或需要poly(A)为存在的翻译抑制。为证明这点，Wu 等用 3组蛋白茎-环结构取代聚腺苷酸尾巴，结果发现不但可以消除 miR-125b 对 mRNA 含量的影响，还可以降低对蛋白质合成的作用。由此可知，miRNA 通过降低翻译效率和聚腺苷酸化 mRNA 的浓度来抑制基因表达远比阻遏翻译强而全面，而且，不像翻译阻遏那样导致 mRNA 的解体是不可逆转。总之，miRNA 与靶mRNA 不完全互补后有两种转录后作用机制，除了阻遏翻译外还可引起mRNA 快速脱腺苷酸化而被降解以抑制基因表达。对 miRNA作用机制的不断深入研究不仅在理论上丰富了我们对基因调控的认识，miRNA应该具有潜在的多种调节基因表达方式，这还有待于实验技术的进步和人们的进一步发现。5 miRNA 的功能与意义高等真核细胞中，miRNA基因占基因的1%，目前估计哺乳动物细胞中有600多个miRNA，30%的基因要受到miRNA的调节。miRNA的多样性与进化保守性决定了其在生理生化功能上的重要性与普遍性。然而只有少数miRNA的已经明确，许多miRNA的功能还尚待深入研究。表21列出了几种功能的miRNA，现在已经认识到这类小分子miRNA在生物体发育、细胞增值与分化、激素分泌、肿瘤形成等过程中扮演者重要角色。表2 功能的miRNA miRNA名称 物种 生物学功能 靶基因lin-4 线虫 发育时序调节 lin-14,lin-28let-7 线虫 发育时序调节 lin-41,hbl-1lsy-6 线虫 神经细胞化学感受器 cog-1 不对称性调节miR-273 线虫 神经细胞化学感受器 die-1不对称性调节miR-165/166 拟南芥 叶子近轴与离轴细胞的分化 PHV/PHBmiR-172 拟南芥 花朵发育 APETALA2(AP2)Bantam 果蝇 调节细胞增殖和凋亡 hidmiR-14 果蝇 调节细胞凋亡和脂类代 caspase Ice?续表2miR-15a/ 哺乳动物 B细胞慢性淋巴细胞白血病 Bcl-2miR-16-1 BCLLsmiR-196 哺乳动物 脊椎动物发育 Hox-B8miR-143 哺乳动物 脂肪细胞分化erk5miR-375 哺乳动物 胰岛素分泌调节 mtpn miR-1 哺乳动物 心脏细胞的生长和分化 Hand25.1 miRNA与生物体的发育分化在动物中，针对数种模式生物(人、小鼠、果蝇、线虫)的miRNA所做的研究已经非常深入。在线虫中除了最早发现的lin-4、let-7参与线虫的形态转换,还发现两个与神经模式发生有关的miRNA:lsy-6和mir-273, 证据已经明确,lsy-6和mir-273能影响左右神经系统某一特定化学感受器受体的水平,这局部解释了神经系统功能的非对称性7。另外，研究发现另一种重要的发育相关基因miR-196和靶基因Hox-B8匹配的非常完美，并导致靶mRNA的降解。在植物中，大多数的miRNA 介导其靶mRNA的降解。植物中的miRNA与相应的靶mRNA近似完全配对，并且互补区域散布在靶mRNA的转录区域而非仅仅局限在3 UTR，使得miRNA会结合到包括编码区域在的多个位点上去，从而直接降解mRNA而非抑制其翻译。例如mir-1723，它在拟南芥的花朵发育中介导翻译抑制。与动物miRNA不同的是，mir-172的互补位点与其靶基因APETALA2(AP2)的互补位点落在编码区域而非3 UTR。因此，植物中的miRNA功能与siRNA 的功能非常相似。5.2 miRNA与细胞分化在鼠骨髓、胸腺的B淋巴细胞中miR-181特异表达,参与增强哺乳动物B淋巴细胞分化， miR-181过表达引起B淋巴细胞减少,T淋巴细胞增加,但目前miR-181作用的靶mRNA还未发现。此外,有人鉴定了干细胞和已分化细胞的miRNA,发现有些miRNA是干细胞特有的,例如,小鼠干细胞特异表达miR290295,人干细胞特异表达miR371373,推测是维持细胞全能性所必需的并参与细胞分化过程。一些miRNA呈组织特异性表达,似乎明确它们与维持分化细胞的功能有关7。近期有研究明确:miRNAs在心脏细胞的生长和分化过程中,也扮演着极为重要的平衡角色。miR-1家族包括miR-1-1和miR-1-2,在心肌、骨骼肌中特异表达, miR-1能够靶向Hand2基因的mRNA,而Hand2基因是心脏形成的一种关键调节因子, miR-1能适时关闭Hand2蛋白制造,以促使心脏正常发育27。因为Hand2蛋白是一种重要的调节因子，所以发现这种miR-1对控制Hand2与其他蛋白具有重要意义。5.3 miRNA与细胞增殖和调亡果蝇中的bantam与细胞凋亡和生长控制有关, 这是第一个被鉴定的与增殖相关的miRNA基因。bantam的靶基因hid，hid已被证实是一种调亡诱导基因，bantam与hid mRNA的3 UTR互补结合，阻止hid mRNA的翻译，抑制蛋白的表达，最终表现为促进细胞增殖的作用。相反，如果敲除bantam，hid的表达水平将上调，诱导调亡的发生，抑制细胞增殖。似乎，bantam扮演了一种癌基因的角色1。Xu等在果蝇体发现了另一种调亡抑制miRNA：miR-14，它通过调节调亡效应因子半胱天冬酶Drice而参与细胞调亡和脂肪代。目前还不清楚miR-14的靶基因，但发现miR-14的突变，会导致调亡效应因子caspase Ice水平的增高，这可能是miR-14的作用靶点1，7。2002 年,Calin 等首先发现，miR15a 和 miR-16-1在约65%的B细胞慢性淋巴细胞白血病BCLLs病人中表达下调。随后不久，Cimmino等15又发现，在BCLLs 细胞中 miR15a和miR-16-1直接与BCL2的3UTR序列相互作用调控BCL2蛋白的表达，并与之成负相关，而BCL2是作为抗凋亡基因参与细胞凋亡过程的,这里miR15a和miR-16-1发挥了类似抑癌基因的作用，而且miR15a和miR-16-1还可能激活外源性APAF1胱天蛋白酶9(caspase-9)-PARP凋亡途径，参与凋亡过程。5.4 miRNA与激素分泌美国洛克菲洛大学的研究人员从糖诱导的鼠胰岛与细胞系的RNA中克隆出大量长度为2123个核苷酸长度的RNA，其中，miR-375含量最多，研究发现，miR-375能够抑制细胞系分泌胰岛素，进一步研究结果明确，miR-375通过与靶基因mtpn 的mRNA3 UTR不完全互补配对，转录后水平抑制了靶蛋白的表达，从而抑制了胰岛素分泌的出胞过程1。这一研究发现为机体如何调节胰岛素分泌过程开辟了新路，同时也为一些疾病如糖尿病的治疗奠定了根底。组织特异性miRNAs，如miR-375，将可能成为一些疾病治疗药物新的作用靶点。5.5 miRNA与肿瘤发生与治疗近几年，miRNAs与人类肿瘤的关系逐渐引起了人们的广泛注意，并不断有肿瘤发生与miRNAs的表达有关的例子的报道。研究明确,miRNA的表达水平在许多肿瘤中发生改变,它们可能起到原癌基因和抑癌基因的作用。Calin 等5发现 miR- 15a 和 miR- 16- 1 定位于染色体 13q14, 而这一区域在一半以上的 B- CLLs 病人中缺失。而且这一缺失在约 50%的外套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma, MCL), 16%40%的多发性骨髓瘤和 60%的前列腺癌中出现。推测他们可能起着肿瘤抑制基因的角色。随后，Calin等又惊奇地发现，超过一半的miRNA位于和肿瘤发生相关的区域和脆性位点、杂合型丢失区(minimal regions of loss of heterozygosity)、扩增区minimal regions of amplication (minimal amplicons)或断裂点区(mon breakpoint region)。； 此外，Iorio和Michael等发现，miR-143，miR-145 在结、直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌和淋巴瘤中的表达下调，这两个基因位于 5q32-33。 He等研究发现，miR-221,-222,-146在乳头状甲状腺癌中显著上调。CiafreSA和Chan 等发现，miR-21 可作为一种抗凋亡因子，在恶性胶质瘤和乳腺癌中的表达是上调的。Metzler等在儿童的Burkitt淋巴瘤中发现 miR-155/BIC 的前体高表达。JohnsonSM 等发现肺癌let-7的表达常是降低的，let-7的靶点是Ras癌基因，RAS 信号通路在哺乳动物中调控细胞的正常生长和恶性增殖, RAS 蛋白过表达会引起细胞的恶性增殖，let-7表达的降低可致其靶点癌基因Ras表达的增加和促进肿瘤生长5，9。可见, miRNA 表达水平的变化, 导致了肿瘤基因或抑癌基因转录后的异常调控, 从而导致肿瘤的发生。假如miRNA的靶基因是癌基因,此miRNA的表达低于正常水平,也意味着它对癌基因的抑制作用减小,引起癌基因编码的蛋白增加,导致肿瘤发生;反之,假如miRNA的靶基因是抑癌基因,此miRNA的表达高于正常水平,也意味着它对抑癌基因的抑制作用增加,引起抑癌基因编码的蛋白减少,也会导致肿瘤发生11。从这种意义上理解,一些miRNA可能是潜在的癌基因或者抑癌基因,通过寻找具有癌基因和抑癌基因性质的miRNA,可以为肿瘤的诊断和生物治疗提供新的靶标。许多miRNA的异常表达都与癌症或其他一些疾病有关, 最新有研究17发现，miRNA 成熟过程的总体抑制促进了细胞转化和肿瘤形成，但目前对调节miRNA表达的因子却知之甚少。Lee J等19在miRNA基因上游鉴定了大量调节元件，这些元件可能在miRNA的转录与转录后水平的调节上起重要作用。研究中他们提出了一种可能，认为一些与疾病有关的蛋白质编码基因的转录因子(transcription factors ，TFs)导致了疾病如肿瘤中miRNA的异常表达。经进一步研究分析并提出假设，包括c-Myb、 NF-Y、Sp-1、MTF-1和AP-2alpha在的转录因子(TFs)是miRNA表达的主调节子(master-regulators)。因此，对调节miRNA的转录因子的研究将为miRNA关联疾病的治疗提供有效帮助。关于miRNA功能的研究也正在进展中，寻找下游靶基因是发现miRNA功能的一个直接手段。植物miRNA与靶基因几乎完全配对结合，而且像小的干扰RNA一样可以结合于mRNA的任何区域，所以植物miRNA靶标基因的鉴定相对直接而容易。研究明确，植物miRNA大局部作用于与发育过程相关的转录因子，尤其与模式建立和细胞分化有关。与植物相比，由于miRNA与靶基因的不完全配对，在动物基因组中直接寻找就显得有些困难，但也有研究尝试依据其他特征用生物信息学查找，但总的来说仍需要实验检验。从仅有的例子来看，一个miRNA可调控细胞中与某一种物质代或信号转导途径相关的几种mRNA，这样更能有效地发挥作用。寻找miRNA的靶基因是目前功能研究的热点之一，因为这为揭示每一个miRNA的功能提供了必不可少的线索，从而为全面了解miRNA在细胞中的功能打下根底。6 小结由于miRNA这类小分子在生命活动中具有广泛的调节功能, 自被发现以来,miRNA即成为生命科学的研究热点。无论在理论上和应用上，miRNA为非编码RNA参与基因调控提供了一个例，miRNA是对中心法如此中RNA作为中介角色的重要补充,促使生物学家重新思考细胞遗传调控等方面的问题。miRNA作为新的研究切入点，为功能基因组学，基因治疗，转录调控机制提供了一条有效途径。近年来对miRNA的研究已经取得了突破性进展,并且有大量的miRNA被鉴定,但是总体来说对miRNA的研究还处在理论水平上,关于miRNA的应用的例子还较少。miRNA作为体正常表达的基因,与人类疾病特别是肿瘤和植物培育的关系还有待进一步研究。尽管目前miRNA应用于基因治疗的尝试才刚刚开始,但已经在药物设计与疾病治疗等实际应用中显现了巨大的应用潜力, 相信随着对这种特殊分子研究的不断深入,以miRNA为靶点或者以miRNA为治疗手段的设想,以后可能会成为焦点，并且将为肿瘤和其它疾病的治疗带来新的希望。相信这些研究成果必将促进整个生物界研究领域的进步与开展。参考文献：1 边春景,铁刚,霞,邵荣光. microRNA在动物体的功能J.医学分子生物学杂志,2005，25：359362.2 何晨,谭军,薇,microRNA的研究进展J.生物技术通讯,2005,16: 674676.3 华友佳,肖华胜.microRNA的研究进展J.生命科学,2005,17(3):278281.4 一种新的调控基因表达的小分子RNA J.中国癌症杂志,2006, 16(8):675678.5 马卓娅,汤华.microRNA与肿瘤J.生命的化学,2006，261：25.6 王芳,汤华.动物细胞核miRNA的加工过程J.细胞生物学杂志,2006，28：141144.7 王晶,汤华.MicroRNAs与其对生长发育调控的研究进展J.医学综述,2006，1212：723724.8 王玉兰,王华梁,允硕. 核糖核酸切酶-的研究进展与应用J. 国际检验医学杂志,2006,278：704706.9 夏洪平，马跃东. microRNA前景光明的药物开发新靶点J.食品与药品,2006，809A：1921.10 叶 茂,跃磊,明镇寰.miRNA(microRNA)家族的研究进展J.生物化学与生物物理进展, 2003,30(3):370374.11 亮.miRNA在肿瘤诊断与生物治疗中的潜在应用J.中国肿瘤生物治疗杂志,2006 l33：159161.12Ambros V . 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This paper reviews theadvances in the research of the characteristics, biogenesis, molecular mechanisms and functional significance of miRNAs action to provide important insight into the roles of microRNAs in the physiological and pathological process in eukaryotes. Key words:small interfering RNA; microRNA; Piwi-interacting RNA; microprocessor; RNase; gene expression regulation; development time; cancer biotherapy 辞经过大学四年紧而充实的学习生活，我觉得自己在各方面都收获了很多。毕业论文是大学期间的最后一个作业，也是检验自己学习成果的总结，所以我特别用心地对待。经过两个多月的努力，我终于顺利完成了毕业论文，这与许多教师的悉心教诲是分不开的，在这里向在学习中给予我大力支持和指导的教师表示深深地感！感我的论文指导教师振林教师，教师治学严谨，学识渊博，在论文的选题、资料查询、开题、撰写与修改的每一个环节都给予了悉心的指导和帮助。在此向教师表示衷心的感！ 感在大学期间教我课程的所有任课教师与班主任红梅教师，感教师们在学习和生活中给我的关心和帮助，感学院，学校严谨的教学环境为我的学习提供了一种良好的精神气氛，使我在学习与生活方面都受益匪浅，在学院的这四年将会对我的一生都产生深远影响。感我的家人，他们含辛茹苦供我上学，让我有机会获得良好的教育，在生活上与学习上给予了极大的支持和鼓励。时光如水，日月穿梭，四年的学习一晃而过。今后，我愿意更加努力的学习来报答曾经关心我的教师、同学与朋友。附 录:英文译文：原文：Shivdasani RA. MicroRNAs:regulators of gene expression and cell differentiation. Blood, 2006,108(12):36463653.译文： MicroRNA：基因表达和细胞分化的调节子近来，一类具有调节作用的RNA分子的存在和作用成为一大热点。MicroRNAs(microRNAs)是一类小的(大约22nt的非编码RNAs，它通过识别同源mRNAs上与其不完全配对的靶序列，使这些mRNAs不稳定或抑制蛋白质翻译。尽管miRNAs生物发生的机制已经被详细阐述，但对他们的生物学功能还所知有限。已报道的例子都典型的聚焦于miRNA调节的单一组织限制性转录物，通常，每一转录物编码一个转录因子，该转录因