不同灸法对实验性 RA 大鼠血清 IL1、TNF

精品论文不同灸法对实验性 RA 大鼠血清 IL-1、TNF-含量影响的比较研究马腾1，刘旭光2，杨慎峭2，杨馨25（1. 四川省八一康复中心脊柱脊髓损伤康复科，成都 610075；2. 成都中医药大学针灸推拿学院，成都 611137） 摘要：目的：比较观察瘢痕灸、温和灸对实验性 RA 大鼠血清 IL-1、TNF- 表达的影响，探 讨不同灸法治疗实验性 RA 的抗炎机制。方法：选用健康 SD 大鼠 40 只，随机分为空白对 照组（以下简称“空白组”）、RA 模型组（以下简称“模型组”）、瘢痕灸组、温和灸组，每10组 10 只。以福氏完全佐剂（FCA）造模，艾灸“肾俞”治疗，采用 ELISA 法测定血清 IL-1、 TNF- 含量。结果：（1）血清 IL-1 含量，模型组显著高于空白组(P0.01)，温和灸组、瘢 痕灸组均明显低于模型组(P0.05)；（2）血清 TNF- 含量，模型组显著高于空白组(P0.01)，瘢痕灸组、温和灸组均明显低于模型组(P0.05，P0.05)。结论：瘢痕灸、温和灸15均能明显降低实验性 RA 大鼠血清 IL-1、TNF- 含量，抑制 IL-1、TNF- 等炎性细胞因子产 生可能是瘢痕灸与温和灸的共同抗炎机制之一。关键词：不同灸法；类风湿性关节炎；IL-1、TNF-中图分类号：R 245.8120The comparative study of IL-1、TNF- content influence in experimental RA rat serum by different moxibustionmethodsMA Teng1, LIU Xuguang2, YANG Shenqiao2, YA Xin2(1. Rehabilitation department of spinal cord injury in Si Chuan Ba Yi Rehabilitation Centre,25ChengDu 610075;2. Institute of acupuncture and massage in Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, ChengDu 611137)Abstract:Comparative observation the influence of IL-1、TNF- expression in experimentalrheumatoid arthritis (RA )rat, serum by scarring moxibustion and moderate moxibustion，to30discusses the mechanism of anti-inflammatory which treat rheumatoid arthritis by different moxibustion methods。Methods: Fourty health SD rats (Sprague-Dawley rats) were randomlydivided into control group (hereinafter referred to as blank), the RA model group (hereinafter referred to as model), moderate moxibustion treatment group (hereinafter referred to as moderate moxibustion) and scarring moxibustion treatment group (hereinafter referred to as 35scarring moxibustion)，each group of 10。To produce RA animal models by Freunds CompleteAdjuvant (FCA),to moxibustin “Shenshu(BL23)” acupoints。to detect IL-1、TNF- content in the serum by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)。 Results: (1) The content of serumIL 1, model were significantly increased than blank (P0.01). moderate moxibustion andscarring moxibustion were significantly lower than that of model (P0.05). (2) Thecontent of serum TNF-, model were significantly increased than blank (P0.01). scarring moxibustion and moderate moxibustion were significantly lower than that of model (P0.05, P0.05).Conclusions:scarringmoxibustionandmoderatemoxibustionhave45significantly decreased cytokines IL-1, TNF- content in the experimental RA model rats serum .Inhibition of inflammatory cytokines produced as IL - 1、TNF- may be one of the commonanti-inflammatory mechanism of scarring moxibustion and moderate moxibustion.Keywords: Different moxibustion methods; Rheumatoid Arthritis(RA); IL-1、TNF-500引言类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis, RA）是一种以慢性对称性多关节炎表现为主的全 身性自身免疫疾病，常见症状为关节肿胀疼痛、僵硬、畸形和功能严重受损等。RA 病理过 程难以控制，致残率高，严重损害患者身心健康，降低生存质量，已成为医学界关注的难治 性疾病1。RA 的基本病理改变是滑膜炎，RA 患者的血清及关节液中可检出高水平的 IL-1、55TNF-。相关实验研究表明，艾灸治疗可明显降低炎症局部组织中 5-HT、HA、PGE2 等炎症 介质含量,减轻局部炎症反应，具有明确的抗炎效应2，3，然而有关不同灸法治疗实验性 RA的抗炎机制研究还鲜有报道。本研究比较观察瘢痕灸、温和灸对实验性 RA 大鼠血清 IL-1、 TNF-含量的影响，旨在探讨不同灸法治疗实验性 RA 的抗炎机制。1实验材料601.1 实验动物选用健康成年 SD 大鼠 40 只，雌雄各半，体重 20020g，动物及饲料均由成都中医药 大学实验动物中心提供。动物在实验前适应性驯养一周。1.2 药品试剂福氏完全佐剂(Freunds Complete Adjuvant，FCA)，美国 Sigma 公司生产，批号：65Lot085K8912，内含 0.1%灭活结核杆菌,购于华美公司成都分公司。生理盐水，四川大康佳 氏药业有限公司生产。艾绒，南阳汉医艾绒有限责任公司生产。艾灸条（4120mm），南 阳汉医艾绒有限责任公司生产。大鼠白细胞间介素 1（IL-1）ELISA 试剂盒，Lot:10-5005， 购于美国 ADL 公司；大鼠肿瘤坏死因子（TNF-）ELISA 试剂盒，Lot:RT110371，购于 美国 ADL 公司。701.3 仪器设备酶联免疫检测仪（DG 3022 中国人名解放军第四军医大学国营华东电子管厂）； 孵育 箱（SN600147-205，USA）； 洗板机（4MK2，Japan）；自动平衡离心机（LD25-2 北京 医用离心机厂）；普通医用冰箱（-20 Haier）；微量移液器（200ul 100ul）；眼科剪和镊 子；离心管（ml）；子弹头试管。752实验方法2.1 动物分组实验开始时，将动物分雌雄按照 SPSS12.0 程序生成的随机数据表随机分为空白对照组（以下简称“空白组”）、RA 模型组（以下简称“模型组”）、温和灸治疗组（以下简称 “温和灸组”）、瘢痕灸治疗组（以下简称“瘢痕灸组”）,每组 10 只动物。808590951001051101152.2 RA 造模除空白组外, 于实验开始第一天，参照文献4，分别对模型组、温和灸组、瘢痕灸组每 只大鼠右后足常规消毒后，从右后足垫部皮内注入福氏完全佐剂(FCA)0.1ml，造成大鼠佐剂 性关节炎（实验性 RA）模型。空白组各动物采用相同方法注射等容积无菌生理盐水作为对 照。2.3 艾灸治疗在造模后的第 7 天，将瘢痕灸组、温和灸组、大鼠固定于鼠台上，暴露背部（治疗穴 位部位剃毛 11cm），瘢痕灸组用艾绒(5mg/壮)灸“肾俞”（以往相关研究已确证其抗炎 效应）5 壮，每壮直至燃尽，灸后擦净艾炷灰烬。每日一次，两侧交替进行。6 天为一疗程， 共治疗 3 个疗程，疗程之间休息一天。温和灸组，用小艾条（直径 4mm,南阳汉医艾绒有限 责任公司生产）距穴 1 cm 处悬灸，用数字温度计(苏州泰式电子公司生产)测量穴位表面皮 温达 45时维持 5 min。每日一次，两侧交替进行。6 天为一疗程，共治疗 3 个疗程，疗程 之间休息一天。空白对照组和 RA 模型组大鼠同法固定，但不艾灸治疗。穴位选取依据有 关文献 5，以比较解剖和骨度分寸法模拟定位。每日治疗均在上午 8:00-12:00 之间进行。2.4 标本取样于治疗第 21 天上午，从股动脉抽取 5ml 血液放入离心管内，静置 1 小时，经离心后取 上清液放入子弹头试管，用记号笔标号，-20低温冰箱保存待测。2.5 指标检测IL-1、TNF-含量测定均采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测。IL-1 含量检测：取出酶标板，依照次序对应分别加入 100ul 的标准品于空白微孔中；分 别标记样品编号，加入 100ul 样品于空白微孔中；在标准品孔和样品孔中加入 50ul 的酶标记 溶液；362孵育反应 60 分钟；洗板机清洗 5 次，每次静置 10-20 秒；每孔加入底物 A、 B 液各 50ul；362下避光孵育反应 15 分钟；每孔加入 50ul 终止液，终止反应；于波长450nm 的酶标仪上读取各孔的 OD 值；B=标准品 OD 值、B0=标准品 0 点 OD 值，以 B/B0% 值为纵坐标，以标准品的浓度为横坐标，在对数坐标纸上绘制标准曲线；在标准曲线上查找 对应的浓度范围。敏感度：1.0pg/ml。TNF-含量检测：取出酶标板，依照次序对应分别加入 50ul 的标准品于空白微孔 中；分别标记样品编号，加入 50ul 样品于空白微孔中；在样品孔中加入 10ul 的生物素标记 溶液；在标准品孔和样品孔中加入 50ul 的酶标记溶液；362孵育反应 60 分钟；洗板机 清洗 5 次，每次静置 10-20 秒；每孔加入底物 A、B 液各 50ul；362下避光孵育反应 15 分钟；每孔加入 50ul 终止液，终止反应；于波长 450nm 的酶标仪上读取各孔的 OD 值；以OD 值为纵坐标，以标准品的浓度为横坐标，绘制曲线图；根据样品的 OD 值查找对应的浓度 范围。敏感度：1.0pg/ml。2.6 统计处理方法实验数据结果以 x s 表示，采用 spss17.0for windows 进行统计学处理。各组数据经 过正态检验和方差齐性检验后，组间比较用单因素方差分析。方差相齐时选用 LSD（Least Significant Difference 最小显著差异法），方差不齐时选用 Tamhanes T2 检验，P 0.05 认为 差异有显著性。3实验结果表 1 不同灸法对实验性 RA 大鼠血清 IL-1 含量的影响(x s)组别例数IL-1 含量（pg/ml)空白组10127.7826.73模型组10218.6745.78*温和灸组10131.8626.50瘢痕灸组10143.7318.98120注：与空白组比较* P 0.01；与模型组比较P 0.01125表 1 结果表明，与空白组比较，模型组血清 IL-1 含量显著增高(P0.01)；与模型组比较，温和灸组、瘢痕灸组血清 IL-1 含量显著降低(P0.01)；但温和灸组与瘢痕灸组比较无显著性 差异(P0.05)。表 2 不同灸法对实验性 RA 大鼠清 TNF-含量的影响(x s)组别例数TNF- 含量（pg/ml)空白组101854.10424.73模型组103030.70437.96*温和灸组102217.70261.33瘢痕灸组102422.60239.17注：与空白组比较* P 0.01；与模型组比较P 0.01，与模型组比较P 0.05130135140145150表 2 结果表明，与空白组比较，模型组血清 TNF-含量显著增高(P0.01)；与模型组比较，温和灸组、瘢痕灸组血清 TNF-含量显著降低(P0.01，P0.05)；但温和灸组与瘢痕灸 组比较无显著性差异(P0.05)。4讨论细胞因子（cytokine,CK）是由不同细胞，特别是免疫相关细胞在受刺激时产生的小分 子(8-80KD)可溶性蛋白质（或多肽）。它们通过细胞表面受体与配体相互传递信息、促进细 胞之间的联系，是机体重要的信息分子。其主要功能是在细胞之间传递信息、诱导细胞的生 长、分化和活化，增强趋化作用、调节免疫和参与炎症反应等。细胞因子及细胞因子网络调 节异常在 RA 的发病机制、慢性炎症病理过程中起着十分重要的作用。IL-1 是破坏关节软骨的最重要的细胞因子之一，它能促进滑膜细胞和淋巴细胞的增殖 和分化, 促进滑膜细胞和软骨细胞合成并释放前列腺素 E2(PGE2)和胶原酶。 PGE2 和胶原 酶引发滑膜炎症反应、软骨基质的崩解, 而局部免疫复合物、 游离的胶原等分解产物刺激 IL-1 的合成, 这样形成一个恶性循环6。肿瘤坏死因子-（TNF-）是一个多效性细胞因子，在 RA 的滑膜液和血清中发现，TNF 家族中 TNF-在 RA 滑液中不存在，TNF- 水平与血沉和滑膜液白细胞计数有关。在体外， TNF- 刺激人滑膜细胞和皮肤成纤维细胞合成胶原酶和 PGE2，诱导骨吸收和抑制骨合成。 TNF-增加滑膜及内皮细胞成纤维细胞生长因子的释放而促进血管翳的形成；TNF-还可 促使滑膜细胞、巨噬细胞、纤维母细胞和软骨细胞产生 IL-1、IL-8 及 TNF-本身而加重组 织损伤7。TNF- 本身能引起关节炎，抗 TNF- 抗体或可融 TNF-受体 Fc 融合蛋白能阻断 TNF 的此种作用，在 RA 治疗中表现出抗炎活性。滑膜细胞功能异常的致炎、类肿瘤样生长 及组织破坏作用与炎症细胞因子 IL-1、TNF-及相关生长因子如血小板衍生生长因子（PDGF）、表皮生长因子（EGF）和成纤维细胞生长因子（FGF）有密切关系：IL-1 和 TNF-这对“姐妹细胞因子”在 RA 发病中起着“中心罪犯”作用 8-10 。 本研究结果表明，RA 模型大鼠血清 IL-1、TNF- 含量显著升高，说明在 RA 模型中 Th1155160165170175细胞因子占优势，致炎细胞因子 IL-1、TNF- 参与了炎症病理过程并发挥重要作用；经温和灸、瘢痕灸治疗后，RA 模型大鼠血清 IL-1、TNF- 含量显著降低，说明温和灸、瘢痕灸均 可明显抑制 RA 模型 Th1 细胞因子优势，并通过下调 IL-1、TNF- 水平，进而调节 RA 中多 种细胞因子、细胞黏附分子、免疫分子的表达，从而发挥抗炎作用。本研究提示，抑制 IL-1、 TNF-等炎性细胞因子产生可能是瘢痕灸与温和灸的共同抗炎机制之一。参考文献 (References)1 孟济明.结缔组织病新进展.人民卫生出版社.第一版.p3802 黄迪君, 余曙光, 韩哲林, 罗 荣, 郝 亮麦粒灸对实验性 RA 大鼠局部组织炎症介质的影响上海针灸 杂志， 2002， 4（21）：43-443 黄迪君,韩哲林,罗荣麦粒灸对实验性 RA 大鼠足跖肿胀度及滑膜组织 Caspase-3 表达的影响成都中 医药大学学报2003 年 6 月第 26 卷第 2 期 P29-304 陈奇主编,中药药理研究方法学第一版,北京:人民卫生出版社,1993;357 5 李忠仁.实验针灸学.北京:中国中医药出版社,2003.314-3166 Strand V,Kavanaugh AF.The role of interleukin-1 in bone resor-ption inrheumatoid arthritisJ.Rheumatology,2004,43(3):10-167 Dayer J M.Interleukin 1 or tumor necrosis factor-alpha:which is the real target in rheumatoid arthritisJ,b J Rheumatol Suppl,2002,65:10-158 杨怡坤，胡荫奇.类风湿性关节炎的发病机理探讨.中国骨伤.2000；13（5）： 459 ChinJE，Lin Y.Effects of recombinant human interleukin- on rabbit articular chondrocytes stimulation of prostanoid release and inhibition of cell growth.Arthritis and Rheum，1988，31（10）：1290.10 Di giovine FS ，Nuki G ， Duff GW ， et al.Tumor necrosis factor in synovial exudates.Ann Rheum Dis，1988，47（9）：768.