食品中菌落总数和大肠菌群的检测

20112011年食品企业质量检年食品企业质量检验人员培训验人员培训2011.09.15菌落总数与大肠菌群的测定菌落总数与大肠菌群的测定二、二、大肠菌群的检测大肠菌群的检测一、一、菌落总数测定法菌落总数测定法太仓市产品质量监督检验所 主讲人：詹克航主讲人：詹克航 2011.09.15 目前，食品卫生标准中的微生物指标一般分为目前，食品卫生标准中的微生物指标一般分为菌落菌落总数总数、大肠菌群和致病菌大肠菌群和致病菌三项。三项。细菌计数细菌计数 食品中菌落总数通常指食品中菌落总数通常指1g，1ml或或1cm2面积食品上的面积食品上的细菌数目而言的，而不考虑其种类。细菌数目而言的，而不考虑其种类。 由于检测计数方法的不同由于检测计数方法的不同, 一般有两种表示方法（一般有两种表示方法（菌落菌落总数总数和和细菌总数细菌总数）。）。 食品卫生标准中的微生物指标概论食品卫生标准中的微生物指标概论菌落总数: 菌落（Colony）菌落菌落(colony)：生长在固生长在固体培养基上，来源于一个体培养基上，来源于一个细胞，肉眼可见的细胞群细胞，肉眼可见的细胞群体。体。 一种一种是在严格规定条件下（样品处是在严格规定条件下（样品处理，培养基及其理，培养基及其pH培养温度与时间、计培养温度与时间、计数方法等），使适应这些条件的每一个数方法等），使适应这些条件的每一个活菌细胞必须而且只能生成一个肉眼可活菌细胞必须而且只能生成一个肉眼可见的菌落，经过计数所获得的结果称为见的菌落，经过计数所获得的结果称为该该食品的菌落总数食品的菌落总数。 另一种另一种是将食品经过适当处理（溶解和稀是将食品经过适当处理（溶解和稀释）后，在显微镜下对细菌细胞数进行直释）后，在显微镜下对细菌细胞数进行直接计数，这样计数的结果，既包括活菌，接计数，这样计数的结果，既包括活菌，也包括尚未被分解的死菌体，因此称为也包括尚未被分解的死菌体，因此称为细细菌总数菌总数。 目前我国食品卫生标准中规定的细菌总目前我国食品卫生标准中规定的细菌总数实际上是指数实际上是指菌落总数菌落总数。即指的是在平板。即指的是在平板计数培养基上长出的菌落数。计数培养基上长出的菌落数。 那么检测食品中的菌落总数有何卫生学意义呢？那么检测食品中的菌落总数有何卫生学意义呢？ 一方面，它可以作为一方面，它可以作为食品被污染程度的标志食品被污染程度的标志。检测食检测食品中的菌落总数，可以了解食品在生产中，从原料加工品中的菌落总数，可以了解食品在生产中，从原料加工到成品包装受外界污染的情况从而反映食品的卫生质到成品包装受外界污染的情况从而反映食品的卫生质量。一般来说、菌落总数越多，说明食品的卫生质量越量。一般来说、菌落总数越多，说明食品的卫生质量越差，遭受病原菌污染的可能性越大。而菌落总数仅少量差，遭受病原菌污染的可能性越大。而菌落总数仅少量存在时，存在时，病原菌污染的可能性就会降低或者几乎不存在病原菌污染的可能性就会降低或者几乎不存在。 许多实验结果表明，食品中细菌总数能够反映出许多实验结果表明，食品中细菌总数能够反映出食食品的新鲜程度品的新鲜程度、是否变质以及生产过程的一般卫生状况、是否变质以及生产过程的一般卫生状况等。一般来讲，食品中细菌总数越多，则表明该食品污等。一般来讲，食品中细菌总数越多，则表明该食品污染程度越重，腐败变质的可能性越大。染程度越重，腐败变质的可能性越大。 另一方面，它可以用来另一方面，它可以用来预测食品可能存预测食品可能存放的期限程度放的期限程度。如实验表明，菌数为。如实验表明，菌数为105cfu/cm2的鱼，在的鱼，在0下可保持下可保持6d，而，而菌数为菌数为103cfu/cm2时，保存期可达时，保存期可达12d。 但上述规则也有例外，有些食品成品但上述规则也有例外，有些食品成品的的菌落总数并不高菌落总数并不高，但由于已有细菌繁殖，但由于已有细菌繁殖并并已产生了毒素已产生了毒素，且毒素性状稳定，仍存，且毒素性状稳定，仍存留于食品中；再有一些食品如酸泡菜和酸留于食品中；再有一些食品如酸泡菜和酸乳等，本身就是通过微生物的作用而制成乳等，本身就是通过微生物的作用而制成的，且是活菌制品。的，且是活菌制品。 自然界细菌的类很多，各种细菌的生理特性和所要求的生自然界细菌的类很多，各种细菌的生理特性和所要求的生活条件不尽相同，（如活条件不尽相同，（如嗜温菌嗜温菌30-37，4.83hr；嗜冷菌嗜冷菌 20-25 5-7d或或5-10 10-14d；嗜热菌嗜热菌 45-55 2-3天）如果要检天）如果要检验样品中所有种类，必须用不同培养基及不同培养条件去满足验样品中所有种类，必须用不同培养基及不同培养条件去满足其要求，才能把各种细菌都检验出来，这样工作量将会很大。其要求，才能把各种细菌都检验出来，这样工作量将会很大。我们也知道，自然界尽管细菌种类很多，但我们也知道，自然界尽管细菌种类很多，但异养、中温、异养、中温、好气性细菌占绝大多数好气性细菌占绝大多数。因此，严格讲，用这种方法所得到的。因此，严格讲，用这种方法所得到的结果，主要是一些结果，主要是一些能在能在平板计数琼脂培养基平板计数琼脂培养基上生长的，好氧性上生长的，好氧性嗜温细菌的菌落总数嗜温细菌的菌落总数。但是把它们作为细菌总数已得到公认。但是把它们作为细菌总数已得到公认。这不仅在食品的卫生检验中，而且在一切微生物区系分析中，这不仅在食品的卫生检验中，而且在一切微生物区系分析中，都把它们作为了细菌总数的指标。都把它们作为了细菌总数的指标。 注意：是并不是所有食品都规定细菌指标，如酸乳、酸泡注意：是并不是所有食品都规定细菌指标，如酸乳、酸泡菜等。菜等。 因此，菌落总数的测定对评价食品的新鲜因此，菌落总数的测定对评价食品的新鲜度和卫生质量有着一定的卫生指标的作用，度和卫生质量有着一定的卫生指标的作用，但本能单凭此一项指标来判定食品的卫生但本能单凭此一项指标来判定食品的卫生质量，还必须配合大肠菌群和致病菌等检质量，还必须配合大肠菌群和致病菌等检验，才能作出比较全面、准确的评价。验，才能作出比较全面、准确的评价。 一、菌落总数测定法一、菌落总数测定法菌落总数菌落总数（ aerobic plate count） 食品检样经过处理，在一定条件下培养后食品检样经过处理，在一定条件下培养后(如培养如培养基成分、培养温度和时间、基成分、培养温度和时间、pH、需氧性质等、需氧性质等)，所得，所得1mL(或或1g)检样中形成菌落的总数。本标准规定的培检样中形成菌落的总数。本标准规定的培养条件下所得结果，只包括一群在平板计数琼脂上生养条件下所得结果，只包括一群在平板计数琼脂上生长发育的嗜中温需氧菌或兼性厌氧菌的菌落总数。长发育的嗜中温需氧菌或兼性厌氧菌的菌落总数。 本标准与本标准与GB/T 4789.2-2008相比主要修改如下：相比主要修改如下： 修改了标准的中英文名称；修改了标准的中英文名称；(食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定/食品卫生微生物学检验 菌落总数测定) 修改了菌落总数计算公式中的解释；修改了菌落总数计算公式中的解释； 修改了培养基和试剂；修改了培养基和试剂； 删除了第二法删除了第二法 菌落总数菌落总数PetrifilmTM 测试片法。测试片法。(培养基由营养琼脂改为平板计数琼脂；培养基由营养琼脂改为平板计数琼脂；菌落总数计算公式进行了修改；菌落总数计算公式进行了修改；增加了第二法增加了第二法“菌落总数菌落总数PetrifilmTM测试片法测试片法”；)-2008 3.1恒温培养箱：恒温培养箱：361 301。3.2冰箱：冰箱：25。3.3恒温水浴箱：恒温水浴箱：461。3.4天平：感量天平：感量0.1g。3.5 均质器均质器3.6 振荡器振荡器3.7无菌吸管：无菌吸管：1mL（具（具0.01mL刻度）、刻度）、10mL（具（具0.1mL刻度）或微量移液器及其吸头。刻度）或微量移液器及其吸头。3.8无菌锥形瓶：容量为无菌锥形瓶：容量为250mL、500mL。3.9无菌培养皿：直径为无菌培养皿：直径为90mm。3.10pH计或计或pH比色管或精密比色管或精密pH试纸。试纸。3.11放大镜或放大镜或/和菌落计数器或和菌落计数器或PetrifilmTM自自动判读仪。动判读仪。 3.12无菌刀、剪子、镊子等无菌刀、剪子、镊子等。 4.1平板计数琼脂培养基平板计数琼脂培养基 (Plate count agar PCA)，见附录见附录A中中A.1。 pH 7.00.2 4.2磷酸盐缓冲稀释液，见附录磷酸盐缓冲稀释液，见附录A中中A.2。 pH 7.24.3 无菌生理盐水无菌生理盐水,见附录见附录A中中A.3 ：称取：称取8.5g氯化钠溶氯化钠溶于于1000mL蒸馏水中，蒸馏水中，121高压灭菌高压灭菌15min。(4.4 1 mol/L 氢氧化钠（氢氧化钠（NaOH）：称取）：称取40g氢氧化钠溶于氢氧化钠溶于1000mL水中。水中。 4.5 1 mol/L 盐酸（盐酸（HCl）：移取浓盐酸）：移取浓盐酸90mL，用蒸馏水稀释至，用蒸馏水稀释至1000mL 4.6 PetrifilmTM菌落总数测试片（菌落总数测试片（aerobic count plate）和压板。）和压板。) 4.7 75%乙醇。乙醇。 区别：区别：pH值（值（08： pH 7.00.2；03： pH 7.27.4 ）细细 菌菌 学学 检检 验验 程程 序序 -细菌总数细菌总数 5、 第一法第一法 平板菌落计数法平板菌落计数法 6.1.1固体和半固体食品：固体和半固体食品：以无菌操作称取以无菌操作称取25g样品，放入于装有样品，放入于装有225 mL磷酸盐缓冲稀释液或磷酸盐缓冲稀释液或0.85生理盐水的无菌均质杯内，于生理盐水的无菌均质杯内，于8000r/min10000 r/min均质均质1min2min，制成，制成1:10样品匀样品匀液；或放入于液；或放入于225 mL稀释液的无菌均质袋中，用稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打拍击式均质器拍打1min2min制成制成1:10的样品的样品匀液。匀液。6.1.2液体样品：液体样品：以无菌吸管吸取样品以无菌吸管吸取样品25mL放放入装有入装有225mL磷酸盐缓冲稀释液或生理盐水的无磷酸盐缓冲稀释液或生理盐水的无菌锥形瓶菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中，中，充分混匀，制成充分混匀，制成1:10的样品匀液（的样品匀液（表面取样的样表面取样的样品按一定的比例制成品按一定的比例制成1:1样品匀液和样品匀液和/或或1:10样品样品匀液。匀液。）。）。 6.1.3用用1mL无菌吸管或微量移液器吸取无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀样品匀液液1.0 mL，沿管壁缓慢注于装有，沿管壁缓慢注于装有9mL稀释液的无菌试稀释液的无菌试管中（注意吸管尖端不要触及稀释液），振摇试管或换管中（注意吸管尖端不要触及稀释液），振摇试管或换用用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样的样品匀液。品匀液。 6.1.4另取另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头，按上述无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做操作顺序，做10倍递增样品匀液，如此每递增稀释一次，倍递增样品匀液，如此每递增稀释一次，即换用即换用1次次1mL灭菌吸管或吸头。灭菌吸管或吸头。6.1.5根据对样品污染情况的估计，选择根据对样品污染情况的估计，选择23个适宜个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），分别在做稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），分别在做10倍递增稀释的同时，吸取倍递增稀释的同时，吸取1.0 mL样品匀液于无菌平样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时分别取皿内，每个稀释度做两个平皿。同时分别取1mL稀释液稀释液加入加入两个无菌平皿两个无菌平皿作空白对照。作空白对照。6.1.6样品匀液移入平皿后，应及时将凉至样品匀液移入平皿后，应及时将凉至46平板平板计数琼脂培养基计数琼脂培养基(可放置于可放置于461恒温水浴箱中保温恒温水浴箱中保温)注入平皿约注入平皿约15mL20mL，并转动平皿使混合均匀。，并转动平皿使混合均匀。同时将平板计数琼脂培养基倾入同时将平板计数琼脂培养基倾入加有加有1.0 mL空白稀释空白稀释液液的无菌平皿内作对照。的无菌平皿内作对照。 6.2.1 琼脂凝固后，将琼脂凝固后，将平板翻转平板翻转，361培培养箱内培养养箱内培养48h2h。水产品采用水产品采用301培培养养72h3h(08新增新增)。 6.2.2 琼脂凝固后，如果怀疑样品中含有在琼脂琼脂凝固后，如果怀疑样品中含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在表面覆盖一培养基表面弥漫生长的菌落时，可在表面覆盖一薄层琼脂培养基（约薄层琼脂培养基（约4mL），并在报告上记录该），并在报告上记录该操作，待覆盖层凝固，翻转平板，按操作，待覆盖层凝固，翻转平板，按6.2.1条件条件进行操作进行操作 可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录相应的菌落数量和稀释倍数。菌落计数器，记录相应的菌落数量和稀释倍数。菌落计数以菌落形成单位（以菌落形成单位（colony forming units,CFU）表示。表示。6.3.1平板菌落数的选择平板菌落数的选择 选取菌落数在选取菌落数在30CFU300CFU个之间、无个之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于低于30CFU个菌落的平板记录具体菌落数，大于个菌落的平板记录具体菌落数，大于300的可记录为多不可计的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采。每个稀释度的菌落数应采用用两个两个平板平均数。平板平均数。 6.3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个，即可计算半个平板后乘平板后乘2，代表全平板菌落数。，代表全平板菌落数。 6.3.3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，生长时，即将每条链作为一个菌落计数。如有链即将每条链作为一个菌落计数。如有链状菌落生长时状菌落生长时(菌落之间无明显界线菌落之间无明显界线)，若仅有一，若仅有一条链，可视为一个菌落；如果有不同来源的几条条链，可视为一个菌落；如果有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个菌落计。链，则应将每条链作为一个菌落计。 1、平皿分、平皿分4部分点数（见图）部分点数（见图） 2、求同一、求同一稀释度的平均菌落数稀释度的平均菌落数 如：如： A1数数 + A2数数 26.4、菌落计数方法、菌落计数方法 1.若若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克（毫升）中菌落总数结果。克（毫升）中菌落总数结果。 （见表例（见表例1）。）。 2.若若有两个连续稀释度在适宜计数范围内有两个连续稀释度在适宜计数范围内（30300个菌落）时，个菌落）时，按如下公式计算：按如下公式计算： N= C/(n1 +0.1n2)d 式中：式中： N 样品中菌落数；样品中菌落数； C 平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和； n1 第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；第一稀释度（低稀释倍数）平板个数； n2 适宜范围菌落数的第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；适宜范围菌落数的第二稀释度（高稀释倍数）平板个数； d 稀释因子（第一稀释度）；稀释因子（第一稀释度）；7. 结果的表述结果的表述7.1菌落总数的计算方法：菌落总数的计算方法： 示例：示例： 稀释度稀释度 1:100（第一稀释度）（第一稀释度） 1:1000（第二稀释度）（第二稀释度） 菌落数菌落数 232，244 33，35 N= C/(n1 +0.1n2)d(232+244+33+35)/(2+0.12) 10-2 =544/0.022=24727 上述数据经上述数据经“四舍五入四舍五入”后，表示为后，表示为25000 或或 2.5104。 3. 若所有平均菌落数均大于若所有平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表例均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表例4）。）。 4. 若所有稀释度的平均菌落数若所有稀释度的平均菌落数均小于均小于30，则应，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表例见表例5） 5. 若所有稀释度的平均菌落数若所有稀释度的平均菌落数均不在均不在30-300之间之间，其中一，其中一 部分大于部分大于300或小于或小于30时，则以最接时，则以最接近近30或或300的平均菌的平均菌 落数乘以稀释倍数报告之落数乘以稀释倍数报告之 （见表例见表例6）。）。 6. 若所有稀释度的菌落数均不可计数，则以若所有稀释度的菌落数均不可计数，则以最高稀释倍数无法计数最高稀释倍数无法计数 报告之（报告之（见表例见表例7）。）。菌落计数的报告菌落计数的报告: 菌落数菌落数 报告结果报告结果1、 30300 之间之间 平均菌落数平均菌落数 X 稀释倍数稀释倍数 2、在在30300之间之间(若有两个稀释度若有两个稀释度) 按新公式计算按新公式计算 （旧标旧标准：求比值准：求比值 2 取较小稀释倍数取较小稀释倍数 ； 300 最高稀释度平均菌落数最高稀释度平均菌落数 X 最高稀释倍数最高稀释倍数 4、 300 或或 30 取最接近的取最接近的 X 稀释倍数稀释倍数 6、 无法计数无法计数 报告无法计数报告无法计数 稀释度选择及细菌总数报告方法（表稀释度选择及细菌总数报告方法（表7） 稀释液及菌落数稀释液及菌落数 10-1 10-2 10-3 1 1,365 164 20 16，400 16，000或或1.6104 2 2,760 295 46 37，750 3.1000或或3.1103 2,890 271 60 27，100 3 不可计不可计 4，650 513 513，000 510，000或或5.1 105 4 27 11 5 270 270或或2.7 102 5 无菌落无菌落 无菌落无菌落 无菌落无菌落 1 10 10 6 不可计不可计 305 12 30，500 31，000或或3.1 10-3 稀释稀释 倍数倍数 平均平均 菌落菌落数数例例 次次细菌总数细菌总数(个个/g或个或个/ml) 报告方式报告方式(个个/g或个或个/ml) 7.2.1菌落数在菌落数在100以内时，按以内时，按“四舍五入四舍五入”方方式修约，采用两位有效数字报告。式修约，采用两位有效数字报告。7.2.2大于或等于大于或等于100时，前第时，前第3位数字采用位数字采用“四四舍五入舍五入”方式修约后，取前方式修约后，取前2位数字，后面用位数字，后面用0代代替位数来表示结果；也可用替位数来表示结果；也可用10的指数形式来表示，的指数形式来表示，此时也按此时也按“四舍五入四舍五入”方式修约，采用两位有效方式修约，采用两位有效数字。数字。7.2.3若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。报告菌落蔓延。7.2.4若空白对照上有菌落生长，则此次检测结若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效果无效。7.2.5称重取样以称重取样以CFU/g为单位报告，按体积取为单位报告，按体积取样的以样的以CFU/mL为单位报告为单位报告(表面取样以表面取样以CFU/cm2报告报告)。7.2、菌落计数的报告：、菌落计数的报告：二、食品微生物学检验二、食品微生物学检验 大肠菌群计数大肠菌群计数 在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。革兰氏阴性无芽胞杆菌。GB 4789.3-2003GB 4789.3-2010 其中包括大肠杆菌、产气杆菌和一些中间其中包括大肠杆菌、产气杆菌和一些中间类型的细菌，这群细菌能在含有胆盐的培类型的细菌，这群细菌能在含有胆盐的培养基上生长。实际上包括埃希氏菌属、柠养基上生长。实际上包括埃希氏菌属、柠檬酸细菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属等檬酸细菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属等，其中以埃希氏菌属为主，称为典型大肠，其中以埃希氏菌属为主，称为典型大肠杆菌，其它三属称为非典型大肠杆菌。杆菌，其它三属称为非典型大肠杆菌。 由于大肠菌群都是直接或间接来自人或温血动物的粪由于大肠菌群都是直接或间接来自人或温血动物的粪便，来自粪便以外的极为罕见，便，来自粪便以外的极为罕见，所以大肠菌群作为食品卫所以大肠菌群作为食品卫生标准有以下两方面的意义。生标准有以下两方面的意义。 一方面，它可以作为粪便污染食品的指标菌。如果食一方面，它可以作为粪便污染食品的指标菌。如果食品中检出大肠菌群，表明该食品曾受到人或温血动物粪便品中检出大肠菌群，表明该食品曾受到人或温血动物粪便污染。如有典型大肠杆菌存在，说明该食品受到粪便近期污染。如有典型大肠杆菌存在，说明该食品受到粪便近期污染。如有非典型大肠杆菌存在，说明该食品受到粪便陈污染。如有非典型大肠杆菌存在，说明该食品受到粪便陈旧污染。旧污染。 另一方面，它可以作为肠道致病菌污染食品的指标菌另一方面，它可以作为肠道致病菌污染食品的指标菌。威胁食品安全性的主要是肠道致病菌。威胁食品安全性的主要是肠道致病菌。 我国和许多国家的大肠菌群检验结果均采用我国和许多国家的大肠菌群检验结果均采用大肠菌群大肠菌群MPN来表示，来表示，2003标准采用标准采用每每100ml（ g ） 样 品） 样 品 中 大 肠 菌 群 最 近 似 数 来 表 示 ，中 大 肠 菌 群 最 近 似 数 来 表 示 ，20082010标准标准采用每采用每1mL(g)样品中大肠菌群最样品中大肠菌群最近似数表示。近似数表示。MPN值是按一定方案检验结果的统计数值，值是按一定方案检验结果的统计数值，这种检验方案，在我国这种检验方案，在我国GB/T4789.3-2010 中将过中将过去的去的“采用样品三个稀释度各三管的乳糖发酵三采用样品三个稀释度各三管的乳糖发酵三步法步法”修改修改“两步法两步法”。食品安全国家标准食品微食品安全国家标准食品微 生物学检验生物学检验 大肠菌群计数大肠菌群计数修改了标准的中英文名称；修改了标准的中英文名称；“第二法大肠菌群平板计数法第二法大肠菌群平板计数法”的平板菌落数的选择范围的平板菌落数的选择范围修改为修改为“15 CFU150 CFU”；删除了删除了“第三法大肠菌群第三法大肠菌群PetrifilmTM 测试片法测试片法”。细细 菌菌 学学 检检 验验 程序程序-大肠菌群大肠菌群3.1 恒温培养箱：恒温培养箱：36 1 。3.2 冰箱：冰箱：2 5 。3.3 恒温水浴箱：恒温水浴箱：46 1 。3.4 天平：感量天平：感量0.1 g。3.5 均质器。均质器。3.6 振荡器。振荡器。3.7 无菌吸管：无菌吸管：1 mL（具（具0.01 mL 刻度）、刻度）、10 mL（具（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。刻度）或微量移液器及吸头。3.8 无菌锥形瓶：容量无菌锥形瓶：容量500 mL。3.9 无菌培养皿：直径无菌培养皿：直径90 mm。3.10 pH 计或计或pH 比色管或精密比色管或精密pH 试纸。试纸。3.11 菌落计数器。菌落计数器。4.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤：）肉汤： 见附录见附录A 中中A.1。4.2 煌绿乳糖胆盐（煌绿乳糖胆盐（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉汤：）肉汤： 见附录见附录A 中中A.2。4.3 结晶紫中性红胆盐琼脂（结晶紫中性红胆盐琼脂（Violet Red Bile Agar，VRBA）：）： 见附录见附录A 中中A.3。4.4 磷酸盐缓冲液：见附录磷酸盐缓冲液：见附录A 中中A.4。4.5 无菌生理盐水：见附录无菌生理盐水：见附录A 中中A.5。4.6 无菌无菌1 mol/L NaOH：见附录：见附录A 中中A.6。4.7 无菌无菌1 mol/L HCl：见附录：见附录A 中中A.7。 6.1 样品的稀释样品的稀释6.1.1 固体和半固体样品：固体和半固体样品：称取称取25 g 样品样品,放入盛有放入盛有225 mL 磷酸盐缓磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000 r/min10000 r/min 均质均质1 min2 min,或放入盛有或放入盛有225 mL 磷酸磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打中，用拍击式均质器拍打1 min2 min，制成，制成1:10 的样品匀液。的样品匀液。6.1.2 液体样品：液体样品：以无菌吸管吸取以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有样品置盛有225 mL 磷酸盐缓磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成充分混匀，制成1:10 的样品匀液。的样品匀液。6 操作步骤操作步骤 6.1.3 样品匀液的样品匀液的pH 值应在值应在6.57.5 之间之间，必要，必要时分别用时分别用1 mol/L NaOH 或或1 mol/L HCl 调节。调节。 6.1.4 用用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样样品匀液品匀液1 mL，沿管壁缓缓注入，沿管壁缓缓注入9 mL 磷酸盐缓冲磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面端不要触及稀释液面），振摇试管或换用），振摇试管或换用1 支支1 mL 无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。的样品匀液。 6.1.5 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释释1 次，换用次，换用1 支支1 mL 无菌吸管或吸头。从制备无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过全过程不得超过15 min。 每个样品，选择每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（胰蛋白胨（LST）肉汤）肉汤/乳糖胆盐发酵管乳糖胆盐发酵管，每管接种，每管接种1mL（如接种量超过如接种量超过1 mL，则用双料，则用双料LST肉汤肉汤），），361 培养培养24 h2 h，观察倒管内是否有气泡产生，观察倒管内是否有气泡产生，24 h2 h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48 h2 h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。 2003版增加版增加-分离培养分离培养:伊红美蓝琼脂平板伊红美蓝琼脂平板(361 , 24 h2 h)操作示意图操作示意图1mL1mL1mL10-110-210-310-410mL10mL10mL1mL1mL1mL1mL1mL1mL空白空白S1S21mL1mL1mL灭菌灭菌生理生理盐水盐水双料双料 复发酵复发酵(BGLB/乳糖发酵管乳糖发酵管)阳性管进行阳性管进行伊红美蓝琼脂伊红美蓝琼脂 用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管/乳糖发酵管中，36 1培养48 h2 h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。 按按6.3确证的大肠菌群确证的大肠菌群LST阳性管数，阳性管数，检索检索MPN表（见附录表（见附录B），报告每），报告每g（mL）样品中大肠菌群的样品中大肠菌群的MPN值。值。8.1 样品的稀释样品的稀释 按按6.1进行。进行。8.2 平板计数平板计数 8.2.1 选取选取2个个3个适宜的连续稀释度个适宜的连续稀释度, 每个稀释每个稀释度接种度接种2个无菌平皿，每皿个无菌平皿，每皿1 mL。同时取。同时取1 mL生生理盐水加入无菌平皿作空白对照。理盐水加入无菌平皿作空白对照。 8.2.2 及时将及时将15 mL20 mL冷至冷至46 的结晶紫的结晶紫中性红胆盐琼脂（中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加脂凝固后，再加3 mL4 mLVRBA覆盖平板表层。覆盖平板表层。翻转平板，置于翻转平板，置于36 1 培养培养18 h24 h。 选取菌落数在选取菌落数在15 CFU150 CFU 之间的平板，之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。 典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为环，菌落直径为0.5 mm 或更大。或更大。 从从VRBA 平板上挑取平板上挑取10 个不同类型的典型个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于和可疑菌落，分别移种于BGLB 肉汤管内，肉汤管内，36 1 培养培养24 h48 h，观察产气情，观察产气情况。凡况。凡BGLB 肉汤管产气，即可报告为大肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。肠菌群阳性。 经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以8.3中计数中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中）样品中大肠菌群数。例：大肠菌群数。例：10-4 样品稀释液样品稀释液1 mL，在，在VRBA平板上平板上有有100个典型和可疑菌落，挑取其中个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种个接种BGLB肉汤肉汤管，证实有管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：1006/10104/g（mL）=6.0105CFU/g（mL）。）。 A.1.1 成分成分 胰蛋白胨或胰酪胨胰蛋白胨或胰酪胨 20.0 g 氯化钠氯化钠 5.0 g 乳糖乳糖 5.0 g 磷酸氢二钾（磷酸氢二钾（K2HPO4） 2.75 g 磷酸二氢钾（磷酸二氢钾（KH2PO4） 2.75 g 月桂基硫酸钠月桂基硫酸钠 0.1 g 蒸馏水蒸馏水 1 000 mL pH 6.80.2 A.1.2 制法制法 将上述成分溶解于蒸馏水中，调节将上述成分溶解于蒸馏水中，调节 pH。分装到有玻璃小。分装到有玻璃小倒管的试管中，每管倒管的试管中，每管10 mL。121 高压高压 灭菌灭菌15 min。A.2.1 成分成分蛋白胨蛋白胨 10.0 g乳糖乳糖 10.0 g牛胆粉（牛胆粉（oxgall或或oxbile）溶液）溶液 200 mL0.1%煌绿水溶液煌绿水溶液 13.3 mL蒸馏水蒸馏水 800 mLpH 7.20.1A.2.2 制法制法将蛋白胨、乳糖溶于约将蛋白胨、乳糖溶于约500 mL蒸馏水中，加入牛胆粉溶液蒸馏水中，加入牛胆粉溶液200 mL（将（将20.0 g脱水牛胆粉溶于脱水牛胆粉溶于200 mL蒸馏水中，调节蒸馏水中，调节pH至至7.07.5），用蒸馏水稀释到），用蒸馏水稀释到975 mL，调节，调节pH，再加，再加入入0.1%煌绿水溶液煌绿水溶液13.3 mL，用蒸馏水补足到用蒸馏水补足到1 000 mL，用棉花过滤后，分装到有玻璃小倒管的试管中，用棉花过滤后，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管每管10 mL。121 高压灭高压灭菌菌15 min。A.3.1 成分成分蛋白胨蛋白胨 7.0 g酵母膏酵母膏 3.0 g乳糖乳糖 10.0 g氯化钠氯化钠 5.0 g胆盐或胆盐或3号胆盐号胆盐 1.5 g中性红中性红 0.03 g结晶紫结晶紫 0.002 g琼脂琼脂 15 g18 g蒸馏水蒸馏水 1 000 mLpH 7.40.1A.3.2 制法制法将上述成分溶于蒸馏水中，静置几分钟，充分搅拌，调节将上述成分溶于蒸馏水中，静置几分钟，充分搅拌，调节pH。煮沸。煮沸2 min，将培养基冷却至，将培养基冷却至45 50 倾注平板。使用前临时制备，不倾注平板。使用前临时制备，不得超过得超过3 h。 A.5 无菌生理盐水无菌生理盐水A.5.1 成分成分氯化钠氯化钠 8.5 g蒸馏水蒸馏水 1 000 mLA.5.2 制法制法称取称取8.5氯化钠溶于氯化钠溶于1 000 mL蒸馏水中，蒸馏水中，121 高压灭菌高压灭菌15 min。 A.6 1 mol/L NaOHA.6.1 成分成分NaOH 40.0 g蒸馏水蒸馏水 1000 mLA.6.2 制法制法称取称取40 g氢氧化钠溶于氢氧化钠溶于1 000 mL蒸馏水中，蒸馏水中，121 高压灭菌高压灭菌15 min。 A.7 1 mol/L HClA.7.1 成分成分HCl 90 mL蒸馏水蒸馏水 1 000 mLA.7.2 制法制法移取浓盐酸移取浓盐酸90 mL，用蒸馏水稀释至，用蒸馏水稀释至1 000 mL，121 高压灭菌高压灭菌15 min。