一拖二恒压供水控制系统中的PLC与变频器

会计学1一拖二恒压供水控制系统中的一拖二恒压供水控制系统中的PLC与变与变频器频器第1页/共174页2022-3-1722022-3-172南京农业大学 生命科学学院 核酸的分离纯化检测核酸的分离纯化检测1 DNA的体外合成的体外合成2 核酸序列测定核酸序列测定3 分分 子子 杂杂 交交4 基因重组与表达基因重组与表达5第2页/共174页2022-3-173第3页/共174页2022-3-174第4页/共174页2022-3-175第5页/共174页2022-3-176第6页/共174页2022-3-177第7页/共174页2022-3-178第8页/共174页2022-3-179核蛋白核蛋白0.14mol/LNaCl1.0mol/LNaClRNP溶解度大溶解度小DNP 溶解度小（仅为水中1%）溶解度大 (比在水中大2倍)第9页/共174页2022-3-1710第10页/共174页2022-3-1711第11页/共174页2022-3-1712第12页/共174页2022-3-1713第13页/共174页2022-3-1714第14页/共174页2022-3-1715n为了获得具有生物活性的天然核酸，在分离制备过程中必须采用温和的条件，避免过酸过碱、剧烈地搅拌，防止热变性，同时还要避免核酸降解酶类的降解。n可加少量Rnase降解RNA。第15页/共174页2022-3-1716第16页/共174页2022-3-1717第17页/共174页2022-3-1718第18页/共174页2022-3-1719第19页/共174页2022-3-1720第20页/共174页2022-3-1721v电泳检测时，可以分离相对分子质量相同但构型不同的质粒分子。n共价闭环超螺旋DNA（cccDNA）直线DNA（LDNA，2条链发生断裂）开环的双链环状DNA（ocDNA，1条链发生断裂）。 第21页/共174页2022-3-1722第22页/共174页2022-3-1723第23页/共174页2022-3-1724第24页/共174页2022-3-1725第25页/共174页2022-3-1726每延伸一个核苷酸需四步化学反应：(1) 脱三苯甲基：末端核苷酸的DMTr用三氯乙酸/二氯甲烷溶液脱去，游离出5-OH 。(2) 缩合：新生成的5-OH 在四唑催化下与下一个核苷3-磷酰亚胺单体缩合使链增长。(3) 盖帽：有少量(小于0.5%)未缩合的5-OH 要在甲基咪唑或二甲氨基吡啶催化下用乙酸苷乙酰化封闭，以防进一步缩合造成错误延伸。(4) 氧化：新增核苷酸链中的磷为三价亚磷，需用碘氧化成五价磷。上述步骤循环一次，核苷酸链向5方向延伸一个核苷酸。第26页/共174页2022-3-1727第27页/共174页2022-3-1728第28页/共174页2022-3-1729第29页/共174页2022-3-1730第30页/共174页2022-3-1731第31页/共174页2022-3-1732第32页/共174页2022-3-1733第33页/共174页2022-3-1734第34页/共174页2022-3-1735第35页/共174页2022-3-1736第36页/共174页2022-3-1737第37页/共174页2022-3-1738第38页/共174页2022-3-1739 先将其反转录为cDNA才能进行PCR扩增，这种PCR技术称为反转录PCR。RT-PCR常用于基因cDNA文库的构建和基因表达水平的分析。v 该技术需要用到反转录酶。第39页/共174页2022-3-1740n实时在线监控。对样品扩增的整个过程进行实时监控，能够实时地观察到产物的增加，直观地看到反应的对数期。n降低反应的非特异性。使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提高PCR特异性。n增加定量的精确性。全程监控，准确定量。n结果分析更加快捷方便，无需跑胶。第40页/共174页2022-3-1741 强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图 。第41页/共174页2022-3-1742第42页/共174页2022-3-1743第43页/共174页2022-3-1744TaqMan荧光探针荧光探针SYBR荧光染料荧光染料第44页/共174页2022-3-1745第45页/共174页2022-3-1746第46页/共174页2022-3-1747第47页/共174页2022-3-1748第48页/共174页2022-3-1749v 在自动测序中将荧光素连在在自动测序中将荧光素连在4种种ddNTP上上第49页/共174页2022-3-1750第50页/共174页2022-3-1751第51页/共174页2022-3-1752毛细管电泳毛细管电泳荧光检测荧光检测第52页/共174页2022-3-1753第53页/共174页2022-3-1754第54页/共174页2022-3-1755第55页/共174页2022-3-1756第56页/共174页2022-3-1757第57页/共174页2022-3-1758第58页/共174页2022-3-1759v鸟枪测序法：大分子DNA被随机地“敲碎”成许多小片段，收集这些随机小片段并将它们全部连接到合适的测序载体；小片段测序完成后，根据重叠区计算机将小片段整合出大分子DNA序列。这就是所谓的鸟枪测序法。第59页/共174页2022-3-1760第60页/共174页2022-3-1761第61页/共174页2022-3-1762第62页/共174页2022-3-1763第63页/共174页2022-3-1764第64页/共174页2022-3-1765第65页/共174页2022-3-1766第66页/共174页2022-3-1767第67页/共174页2022-3-1768第68页/共174页2022-3-1769第69页/共174页2022-3-1770第70页/共174页2022-3-1771酶促生物素酶促生物素标记技术标记技术第71页/共174页2022-3-1772第72页/共174页2022-3-1773第73页/共174页2022-3-1774第74页/共174页2022-3-1775第75页/共174页2022-3-1776第76页/共174页2022-3-1777第77页/共174页2022-3-1778滤膜（固相）杂交滤膜（固相）杂交液相杂交液相杂交第78页/共174页2022-3-1779第79页/共174页2022-3-1780第80页/共174页2022-3-1781第81页/共174页2022-3-1782第82页/共174页2022-3-1783第83页/共174页2022-3-1784第84页/共174页2022-3-1785第85页/共174页2022-3-1786第86页/共174页2022-3-1787第87页/共174页2022-3-1788第88页/共174页2022-3-1789第89页/共174页2022-3-1790菌落原位杂交菌落原位杂交斑点杂交斑点杂交第90页/共174页2022-3-1791第91页/共174页2022-3-1792mRNA的互补链，的互补链， 杂交杂交信号集中于信号集中于 纤维细胞中纤维细胞中。负对照，负对照，mRNA的的 同义链同义链, 无杂交无杂交 信号信号正对照，正对照，UBQ10杂交信号遍布杂交信号遍布于于 整个胚珠整个胚珠RNA原位杂交原位杂交第92页/共174页2022-3-1793染色体原位杂交染色体原位杂交第93页/共174页2022-3-1794第94页/共174页2022-3-1795第95页/共174页2022-3-1796第96页/共174页2022-3-1797第97页/共174页2022-3-1798生物芯片的内部生物芯片的内部结构图结构图 像花布一样五彩像花布一样五彩斑斓的生物芯片。斑斓的生物芯片。第98页/共174页2022-3-1799v基因芯片通过应用平面微细加工技术和超分子自组装技术，把大量分子检测单元集成在一个微小的固体基片表面，可同时对大量的核酸和蛋白质等生物分子实现高效、快速、低成本的检测和分析。第99页/共174页2022-3-17100第100页/共174页2022-3-17101第101页/共174页2022-3-17102第102页/共174页2022-3-17103第103页/共174页2022-3-17104第104页/共174页2022-3-17105基因克隆的主要步骤基因克隆的主要步骤第105页/共174页2022-3-17106第106页/共174页2022-3-17107第107页/共174页2022-3-17108第108页/共174页2022-3-17109第109页/共174页2022-3-17110n克隆的质粒载体。允许外源的DNA插入，储存。主要是DNA水平上的操作。n基因表达的质粒载体。允许外源DNA的插入、储存和表达。第110页/共174页2022-3-17111第111页/共174页2022-3-1711220世纪世纪70年代早期主要利用天然质粒，年代早期主要利用天然质粒，1977年年Bolivar等构建成功等构建成功pBR322，1982年年Viera和和 Messsing构建成功构建成功pUC系列质粒，随后有不少穿梭质粒，表达质粒等问世。系列质粒，随后有不少穿梭质粒，表达质粒等问世。第112页/共174页2022-3-17113第113页/共174页2022-3-17114白色菌落：含外源DNA的转化菌落蓝色菌落：转化入空载体的菌落蓝白筛选蓝白筛选第114页/共174页2022-3-17115第115页/共174页2022-3-17116 的噬菌体在培养基上形成清亮型噬菌斑。根据这个形态学特征可筛选重组体分子。v许多载体，含有编码半乳糖苷酶基因lacZ（其中引入多克隆位点）。由这种载体感染的大肠杆菌lac-菌，涂布在含有IPTG和Xgal的培养基平板上，会形成蓝色噬菌斑。当外源DNA片段插入到这些克隆位点时，寄主细胞就会在Xgal-IPTG培养基上形成无色噬菌斑。第116页/共174页2022-3-17117第117页/共174页2022-3-17118第118页/共174页2022-3-17119第119页/共174页2022-3-17120第120页/共174页2022-3-17121第121页/共174页2022-3-17122第122页/共174页2022-3-17123第123页/共174页2022-3-17124第124页/共174页2022-3-17125第125页/共174页2022-3-17126第126页/共174页2022-3-17127第127页/共174页2022-3-17128第128页/共174页2022-3-17129第129页/共174页2022-3-17130第130页/共174页2022-3-17131第131页/共174页2022-3-17132第132页/共174页2022-3-17133第133页/共174页2022-3-17134第134页/共174页2022-3-17135第135页/共174页2022-3-17136第136页/共174页2022-3-17137v若DNA插入片段与适当的载体存在同源黏性末端，则连接十分方便。但存在的问题是载体容易自身环化降低重组率，插入片段可双向插入或多拷贝插入，目的基因需表达时，需采用定向克隆技术。第137页/共174页2022-3-17138第138页/共174页2022-3-17139第139页/共174页2022-3-17140第140页/共174页2022-3-17南京农业大学 生命科学学院141第141页/共174页2022-3-17南京农业大学 生命科学学院142v将连接子连接于外源DNA片段两侧一平末端上 ；v用相应的内切酶切割连接子；v含新黏性末端的外源DNA片段与相应的线性载体DNA分子连接。 第142页/共174页2022-3-17南京农业大学 生命科学学院143第143页/共174页2022-3-17南京农业大学 生命科学学院144第144页/共174页2022-3-17南京农业大学 生命科学学院145第145页/共174页2022-3-17146第146页/共174页2022-3-17南京农业大学 生命科学学院147第147页/共174页2022-3-17南京农业大学 生命科学学院148第148页/共174页2022-3-17南京农业大学 生命科学学院149第149页/共174页2022-3-17南京农业大学 生命科学学院150第150页/共174页2022-3-17151第151页/共174页2022-3-17南京农业大学 生命科学学院152第152页/共174页2022-3-17153第153页/共174页2022-3-17南京农业大学 生命科学学院154第154页/共174页2022-3-17南京农业大学 生命科学学院155第155页/共174页2022-3-17南京农业大学 生命科学学院156第156页/共174页2022-3-17南京农业大学 生命科学学院157第157页/共174页2022-3-17南京农业大学 生命科学学院158第158页/共174页2022-3-17南京农业大学 生命科学学院159第159页/共174页2022-3-17南京农业大学 生命科学学院160第160页/共174页2022-3-17南京农业大学 生命科学学院161第161页/共174页2022-3-17南京农业大学 生命科学学院162第162页/共174页2022-3-17南京农业大学 生命科学学院163典型的穿梭质粒,分别含有酵母和细菌的起始位点第163页/共174页2022-3-17南京农业大学 生命科学学院164第164页/共174页2022-3-17南京农业大学 生命科学学院165第165页/共174页第166页/共174页2022-3-17167第167页/共174页2022-3-17168第168页/共174页2022-3-17169第169页/共174页2022-3-17170第170页/共174页2022-3-17171第171页/共174页2022-3-17172第172页/共174页2022-3-17173白色菌落：含外源DNA的转化菌落蓝色菌落：转化入空载体的菌落蓝白筛选蓝白筛选第173页/共174页2022-3-17174第174页/共174页