细菌基因组DNA的提取

精选优质文档-倾情为你奉上（一）细菌基因组DNA的提取1.试剂 1）CTAB/NaCl溶液：4.1g NaCl溶解于80mL H2 O,缓慢加入10g CTAB,加水至100mL。 2）其它试剂：氯仿:异戊醇(24:1)，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶 K (20mg/mL或粉剂)，5mol/L NaCl。 2.操作步骤：1）100mL 细菌过夜培养液, 5000rpm离心10分钟, 去上清液。 2） 加9.5mL TE悬浮沉淀, 并加0.5 mL 10% SDS, 50 L 20mg/mL(或1mg干粉)蛋白酶 K, 混匀, 37保温1小时。 3）加1.5mL 5mol/L NaCl, 混匀。 4）加1.5mL CTAB/NaCl溶液, 混匀, 65保温20分钟。 5） 用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm离心10分钟, 将上清液移至干净离心管。 6）用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干净管中。7）加1倍体积异丙醇, 颠倒混合, 室温下静止10分钟，沉淀DNA。 8）用玻棒捞出DNA沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于1mL TE, -20保存。如DNA沉淀无法捞出,可5000rpm离心, 使DNA沉淀。 （二）细胞基因组DNA的提取Each sample + TNES buffer 500 L +proteinase K 25 L 55 C, 750 rpm, 2hr +150 L 6M NaCl, vortex spin 5 min, Max, romm temperature (RT) isolate supernatant + 600 L cold ethanol (95%), vortex spin 5 min, Max, RT precipitation + 75% ethanol, RT, Vortex spin 5 min, Max, RT precipitation+50 L TE buffer (10 stock solution), keep in 4 C.（三）Chelex法抽提DNA1. 用无菌棉签取双侧颊粘膜拭子，室温下自然干燥过夜，在无菌容器中保存。2. 取1.5mL试管，加双蒸去离子水1mL，将对应的颊粘膜棉签拭子插入试管内，浸泡20分钟,其间用力搅动棉签，再将棉签用眼科镊挤干取出3. 12000rpm离心5分钟，弃上清4. 加5% chelex-100 200L、蛋白酶K 5L，置50水浴中30分钟，再置沸水浴中10分钟，灭活蛋白酶K，冰浴3分钟，使DNA复性5. 取出后12000rpm离心5分钟，取上清液移至另一管中，-20保存备用（四）新鲜血DNA提取1. 将约3mL的血块导入匀浆管中，加入8mL的裂解液进行研磨，直至血块磨匀。转入50mL的离心管中，再加入30mL的裂解液，6000转离心10min，弃上清液。2. 在沉淀中加入20mL的裂解液，充分震荡后6000转离心10min，弃上清。3. 在沉淀中加入了1mL的抽提液和15L的蛋白酶K，混匀后转入5mL离心管中，37的水浴过夜或者50水浴3小时。4. 过夜的水浴液体中加入1mL的Tris饱和酚（注意的是Tris饱和酚分为液相在上层，油相在下层，加入液体必须是下层的油相物），混匀后（手摇15min），4000转离心10min，取上清液体。5. 在上清液体中加入等体积的的氯仿和异戊醇的混合液体（氯仿：异戊醇=24：1），充分混匀后（手摇15min）4000转离心10min，取上清液（分入两个1.5mL的离心管中，各约600L800L）6. 在上清液体中加入3M的醋酸钠80L，再加入与上清液体等体积的冰无水乙醇（-40保存），上下轻摇。可以见到白色絮状沉淀物，再以10000转/10min离心。7. 在沉淀中加入冰无水乙醇约1mL，12000转/6.5min离心，弃上清后真空抽干。8. 干燥后产物加入TE缓冲溶液10L溶解，4放置五天，期间可以在摇床上晃动，然后测量浓度和OD值，然后稀释到0.1ug/L，分装后放入-20保存。9. 使用分光光度仪器测量DNA的OD 值的时候，首先是使用酒精清洗那个放入的内盒内外，然后使用TE缓冲液冲洗数遍，然后加入TE缓冲液，放入插孔，调零，然后倒掉TE缓冲液调零，加入1L的DNA母液+49LTE缓冲液（或2L的DNA母液+98LTE缓冲液），放入后测量OD值和浓度，即为母液的浓度。专心-专注-专业