高效液相色谱法同时测定丹参药材水溶性和脂溶性成分的含量_翟学佳

药品质量控制高效液相色谱法同时测定丹参药材水溶性和脂溶性成分的含量*翟学佳1，徐锦凤2（1.华中科技大学同济医学院附属协和医院药剂科，武汉430022;2武汉市中心医院心电图室,430014摘要目的建立丹参药材水溶性成分中丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B和脂溶性成分中二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA的含量测定方法。方法采用高效液相色谱法测定，色谱柱为汉邦C18色谱柱（4.6mm250mm,5仙m；动相A为0.1%甲酸-水（VN,流动相B为乙月青，线性洗脱梯度为010min,B相10%20%,1027min,B相20%33%,2730min,B相33%70%,3050min,B相70%85%;柱温:20C;流速:1mLmin-1;进样量:10仙L检测波长:280nm。结果丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B、二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA在0.0372118.0000,0.01748.9000,0.141450.000,0.018856.8000,0.0497158.0000,0.021578.5000,0.0962308.0000mgL-1浓度范围内均呈良好线性关系（R20.99咯成分的平均加样回收率均在98.5%101.5%,RSD均0.9992,respectively.Theaveragerecoveryratesofthefourinvestigatedcompoundswereintherangeof98.5%-101.5%forallwithRSDbelow1.98%(n=6.Theintra-dayandinter-dayprecisionoftheassaywerenomorethan2.16%(n=6.ConclusionThemethodisaccurateandreliablewithgoodreproducibility,andcanbeusedasadeterminationstandardforRadixSalviaeMiltiorrKEYWORDSRadixSalviaeMiltiorrhizae;Danshensu;SalvianolicacidB;Dihydro-tanshinoneI;HPLC丹参系唇形科植物丹参（SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根及根茎，味苦,性微寒，具有祛瘀镇痛、活血通经、清心除烦的作用，广泛用于冠心病、肝炎、月经紊收稿日期2008-11-26基金项目*国家重点基础研究发展计划（973计划项目（基金编号:2005CB523402作者简介翟学佳（1983-,女，湖北武汉人，药师，硕士，从事药物质量标准研究。电话：027-*,email:zhaixuejia。舌L、骨质疏松、慢性肾衰竭、血液循环以及其他心血管疾病的治疗13O丹参主要含有两类成分，水溶性的酚酸类化合物，如丹参素、原儿茶醛以及丹酚酸B等，脂溶性的二菇酶类化合物如二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I以及丹参酮IIA等47。现代药理学研究表明，丹参中酚酸类和二菇酶类成分均具有显著的生物活性810因此，可以通过测定这些化合物的含量来评价丹参的质量。笔者采用高效液相色谱（HPLC法建立一种同时测定丹参中7种活性成分（丹参素、1345医药导报2009年10月第28卷第10期原儿茶醛、丹酚酸B、二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA的分析方法,并用于15个产地丹参药材中该成分的含量测定。1仪器与试药1.1仪器Agilent1100型高效液相色谱仪，包括四元梯度泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱和紫外检测器;METTLERAE240电子天平（梅特勒-托利多上海有限公司；TGL-16C台式离心机（上海安亭科学仪器厂。1.2试药丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B、二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA均购于中国药品生物制品检定所；乙月青、甲醇（色谱纯，德国MERCK公司;甲酸、冰醋酸（色谱纯，美国TEDIA公司;磷酸（分析纯;Milli-Q超纯水（Millipore公司，美国。丹参药材均由浙江大学药学院贺庆副教授鉴定。2方法与结果2.1色谱条件色谱柱:汉邦C18色谱柱（4.6mmx250mm,5仙流动相A为0.1%甲酸-水（V/V，流动相B为乙月青，线性洗脱梯度为010min,B相10%20%,1027min,B相20%33%,2730min,B相33%70%,3050min,B相70%85%;柱温:20C;流速:1mLmin-1;进样量:10pL测波长:280nm。2.2对照品溶液制备分别精密称取丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B对照品适量，以1%醋酸-甲醇（V/V溶解制得酚酸类对照品储备液;分别精密称取二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA对照品适量，以甲醇溶解制得二菇酶类对照品储备液。分别将以上各对照品储备液稀释配成0.037118.000,0.0178.900,0.14450.00,0.01856.000,0.049158.000,0.02178.500,0.096308.000gmL的7个不同浓度的对照品溶液2.3供试品溶液制备将丹参药材粉碎成粗粉,精密称取约0.5g加入70%甲醇-水（V/V40mL,（203：控温超声60min，再以70%甲醇-水（V/V定容至50mL,摇匀，取上清液，10000rm-in-1离心10min僭心机半径57.84mm备用。2.4专属性考察取混合对照品溶液、丹参供试品溶液，按“2.1项色谱条件进样分析，采用DAD检测器检测，波长扫描范围：190400nm。7种丹参成分均通过与对照品的保留时间及光谱图对比进行确认，并经峰纯度检测。7种丹参成分峰纯度值均在阈值内方法专属性良好。丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B、二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA的保留时间分别为6.0,10.7,24.9,37.5,40.7,41.7口46.0min。图1丹参药材的HPLC色谱图1 .丹参素；2 .原儿茶醛;3 .丹酚酸B;4 .二氢丹参酮；5 .隐丹参酮；6 .丹参酮I;7 .丹参酮nA8 .5线性关系考察分别将不同浓度的对照品溶液进样分析，以各成分的峰面积为纵坐标（Y,浓度（X为横坐标，分别计算各成分的线性回归方程及相关系数。检测限和定量限分别以信噪比为3和10计算，其结果见表1。9 .6精密度实验2.6.1仪器精密度将丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B、二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA混和对照品溶液连续进样6次，计算各成分峰面积的RSD值,结果表明所有成分峰面积的RSD值均1.32%。2.6.2日内、日间精密度分别取同一批次的丹参药材粗粉6份，按供试品制备方法制备供试品溶液，进样分析，以外标法计算药材含量，计算日内精密度。连续6d分别取同一批次的丹参药材粗粉，按供试品制备方法制备供试品溶液，按“2.1色谱条件进行分析，以外标法计算药材含量，计算日间精密度。结果日内精密度RSD1.79%,日间精密度RSD2.16%。2.7稳定性实验取丹参供试品溶液，分别于0,3,6,9,12,18和24h进样分析，结果各成分的峰面积RSD均2.84%,表明供试品溶液在24h内保持稳定。2.8加样回收率实验取已知含量的丹参药材粗粉0.25g精密称定,加入一定量的7种对照品溶液，按供试品制备方法制备供试品溶液，按“2.1色谱条件进行分析，以外标法计算含量，并计算加样回收率，结果见表2,各成分回收率均在98.5%101.5%,RSD1.98%2.9含量测定将上述HPLC分析方法用于全国15个产地丹参药材7种成分的含量测定，结果见表3,不同产地的丹参药材中活性成分的含量存在明显的差异，而GAP种植基地的丹参药材中活性成分的含量均一、稳定。因此推广药材规范化种植方法，有利于提高药材质量稳定性。3讨论3.1色谱柱的选择考察3个厂家相同规格的色谱1346HeraldofMedicineVol.28No.10October2009表1各种活性成分线性方程、检测限和定量限活性成分回归方程R2线性范围/(pg-1-1L检测限/(ngm-L-1定量限/(ngm-L-1丹参素Y=(6.3610.134X-(1.2540妁670.99960.0372118.000014.30.137.20.2原儿茶醛Y=(47.0170.694X+(0.8910.1130.99990.01748.90006.90.117.40.1丹酚酸BY=(10.6230t195X-(6.6076.5100.99940.1410450.000048.70.4141.0使二氢丹参酮IY=(39.2340.503X+(11.4100.7990.99970.018856.80007.00.118.802隐丹参酮Y=(21.5000.216X+(21.0463.3900.99960.0497158.000017.60.149.705丹参酮IY=(12.146比191X+(4.875止2900.99980.021578.50008.10.121.502丹参酮HAY=(37.2280t142X-(46.2178.9000.99920.0962308.000033.40.296.20.9表2丹参药材中7种中化合物的提取回收率实验结果编号活性成分已有量/mg加入量/mg平均测得量/平均回收率/%RSD/%1丹参素0.1350.1370.274101.51.712原儿茶醛4.700X0-35.67010-31.04010-2100.51.513丹酚酸B15.50015.20030.50098.71.134二氢丹参酮I0.1640.1370.29998.51.935隐丹参酮0.5600.3990.961100.51.526B参酮I0.9020.6561.560100.31.677丹参酮na0.6830.4991.18099.61.98表3不同产地丹参药材7种活性成分的含量-1编号产地丹参素原儿茶醛丹酚酸B二氢丹参酮隐丹参酮丹参酮丹参酮IA1山东三山沟4.771022.334.431046.941022.761032.711032.951032山东岳庄2.2410215.705.95便41.071025.261021.211031.381033山东大张庄2.5710219.603.021048.951022.491031.481031.491034山东平色8.1210240.103.371041.901023.801029.211028.791035山东蒙阴2.1710211.005.321046.501022.691032.891032.811036四川中江石泉二村1.191031.515.821847.111.841024.211021.371037四川中江石泉四村7.161023.892.80便43.98102.001023.881021.081038四川荷花池8.321023.895.561841.211023.011023.521021.041039河南平顶山1.8510329.305.901043.621029.181021.611031.7410310河南卢氏1.231031.732.441043.91109.34103.901024.9810211河南鲁山4.4210233.904.091044.201021.011031.381031.2710312广东清平5.491022.591.651041.111021.501023.411023.0710213云南菊花苑4.9510239.202.1310415.503.353.561024.0110214河北安国5.161021.085.071045.511023.131032.841033.7810315生产基地(0202085.11便222.905.701046.201021.981032.991032.3010316生产基地(0202095.17便221.806.101045.941021.951033.001032.3010317生产基地(0202105.09便220.306.111045.891021.931033.011032.2910318生产基地(0202114.97便218.905.88便45.861022.041033.241032.6010319生产基地(0202125.12便220.305.88便45.841022.051033.301032.6010320生产基地(0202135.20便222.406.291047.051022.351033.591032.7810321生产基地(0202145.32便220.006.351047.161022.441033.611032.8410322生产基地(0202155.36便220.706.161046.641022.291033.531032.8510323生产基地(0202165.08便222.606.161046.831022.261033.671032.8210324生产基地(0202175.44便220.505.961046.401022.131033.311032.6810325生产基地(0202195.35便219.606.141046.461022.211033.451032.6110326生产基地(0202205.57便220.506.151046.461022.201033.371032.6310327生产基地(0202215.48便220.006.091046.571022.261033.491032.7310328生产基地(0202225.5910219.806.101046.581022.251033.481032.731031347医药导报2009年10月第28卷第10期柱:YMC-PACK-ODS,ZORBAX-SB-C18和汉邦C18色谱柱，规格均为（4.6mmx250mm,5仙i验结果表明汉邦色谱柱最适合分离丹参中各类成分，峰形较对称，于是选择该色谱柱进行分析。3.2 流动相体系的选择分别考察甲醇-水和乙月青-水体系，结果表明乙月青-水体系洗脱能力较强，分离效率较高，分离速度较快，故选择乙月青-水体系进行分离。3.3酸种类的选择由于丹参药材中水溶性成分主要为酚酸类，酸化的流动相可以抑制酚酸类成分解离，减少色谱峰拖尾。分别在水相中加入0.5%甲酸,0.5%醋酸以及0.02%磷酸进样分析。结果表明：醋酸酸性较弱，无法完全抑制酸性物质的解离，峰拖尾。而加入磷酸与加入甲酸的实验结果较为接近，选择甲酸进行分离。3.4酸浓度的选择分别考察0.5%甲酸（V/V-乙月青、0.3%甲酸（V/V-乙月青、0.1%甲酸（V/V-乙月青、0.05%甲酸（V/V-乙月青，结果表明，当甲酸浓度达到0.1%后，峰形均较为对称，色谱峰分离良好，因此甲酸浓度确定为0.1%。3.5 流动相梯度的选择由于丹参药材中所含二类成分极性差异大，必须采用梯度洗脱的方法进行分离分析，考察不同洗脱梯度，最后确定丹参药材的梯度洗脱条件为010min,B相10%20%,1027min,B相20%33%,2730min,B相33%70%,3050min,B相70%85%。3.6柱温的选择确定流动相组成和梯度条件后，分别考察柱温对色谱分离的影响。实验结果表明，柱温对隐丹参酮和丹参酮I的分离影响较大，柱温越低，分离效果越好，且柱温在20c时，隐丹参酮和丹参酮I实现基线分离确定柱温为20Co本研究建立同时测定丹参药材中水溶性和脂溶性成分的HPLC分析方法，可更全面有效地对丹参药材及丹参相关制剂进行质量评价。DOI10.3870/yydb.2009.10.045参考文献1 LAMFY,NGSCW,CHEUNGJHY,etal.Mechanismsofthevasorelaxanteffectofdanshen(SalviamiltiorrhizainratkneejointsJ.JEthnopharmaco1,2006,104(1:336-344.2 FISHJM,WELCHONSDR,KIMYS,etal.Dimethy1Li-thospermateB,anextractofdanshen,suppressesarrhythmogenesisassociatedwiththebrugadasyndromeJ.Circulation,2006,113:1393-1400.3 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