大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

大肠杆菌感受态细胞的制备和转化第一节概述在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构 建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的 mob基因,因此不能自行完成从一个细 胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产 生一种短暂的感受态以摄取外源 DNA.转化（Transformation是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状 的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体（R川它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传 给后代。受体细胞经过一些特殊方法（如电击法,CaCI2,RbCI（KCI等化学试剂法的处 理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受 态细胞（Compenent cells进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的 转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant即带有异源DNA分子的受体细胞。目前常用的感受 态细胞制备方法有CaCl2和RbCl（KCl法,RbCl（KCl法制备的感受态细胞转化效率 较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感 受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油于-70C保存（半年，因此 CaCl2法为使用更广泛。为了提高转化效率，实验中要考虑以下几个重要因素：1. 细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于4 C的培养菌，最好从-70 C 或-20C甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以 刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的0D600来控制。DHa菌株的 OD600为0.5时，细胞密度在5X107个/ml左右（不同的菌株情况有所不同，这时比较 合适。密度过高或不足均会影响转化效率。2. 质粒的质量和浓度：用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA （cccDNA。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比 但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50卩I 的感受态细胞达到饱和。一般情况下，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的 5%。3. 试剂的质量：所用的试剂，如CaCI2等均需是最高纯度的（GR或AR.,并用超纯 水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。4. 防止杂菌和杂DNA的污染:整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿, 如离心管，tip头等最好是新的，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止 被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂 DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。本实验以E.coli DH5a菌株为受体细胞，并用CaCI2处理，使其处于感受态，然后 与pBS质粒共保温，实现转化。由于pBS质粒带有氨苄青霉素抗性基因（Amp r,可通 过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pBS,则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子肯定已导入了 pBS。转化子扩 增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。第二节材料、设备及试剂、材料E. coli DH5菌株:R - ,M - ,Amp ;质粒DNA:购买或实验室自制,eppe ndof设备恒温摇床，电热恒温培养箱，台式高速离心机，无菌工作台，低温冰箱，恒温水浴锅, 制冰机，分光光度计，微量移液枪、试剂1丄B固体和液体培养基。2. Amp母液。3. 含Amp的LB固体培养基：将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至 60C 左右加入Amp储存液，使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。4麦康凯培养基（Maconkey Agar:取52g麦康凯琼脂，加蒸馏水1000ml,微火煮沸 至完全溶解，高压灭菌,待冷至60E左右加入Amp储存液使终浓度为50ug/ml，然后 摇匀后涂板。5.0.05mol/L CaCI2溶液:称取0.28g CaCI2（无水，分析纯，溶于50ml重蒸水中，定 容至100ml,高压灭菌。6.含 15%甘油的0.05mol/L CaCl2:称取0.28g CaCI2（无水，分析纯，溶于50ml重 蒸水中，加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。第三节操作步骤一、受体菌的培养从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5单菌落，接种于3-5ml LB液体培养基 中,37C下振荡培养12小时左右，直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比 例接种于100ml LB液体培养基中,37T振荡培养2-3小时至OD600 =0.5左右。二、感受态细胞的制备（CaCl2法1、 将培养液转入离心管中，冰上放置10分钟,然后于4C下3000g离心10分 钟。2、弃去上清，用预冷的0.05mol/L的CaCl2溶液10ml轻轻悬浮细胞，冰上放置15-30分钟后4C下3000g离心10分钟。3、弃去上清 加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCI2溶液，轻轻悬浮细 胞，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液。4、感受态细胞分装成200卩的小份，贮存于-70C可保存半年。三、转化1、从-70E冰箱中取200卩感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰 上。2、加入pBS质粒DNA溶液（含量不超过50ng,体积不超过10卩轻轻摇匀，冰上 放置30分钟后。3、 42 E水浴中热击90秒或37 E水浴5分钟，热击后迅速置于冰上冷却3-5分 钟。4、向管中加入800 pl LB液体培养基（不含Amp,混匀后37C振荡培养1小时， 使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Amp r。离心4000g 1min。弃上清800，留 200 p菌液,混匀。5、将上述菌液摇匀后取200卩涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37C培养16-24小时。注意:在一个事先制备好的含100g/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上加40 p X- gal贮存液（20mg/ml和4 p IPTG（200mg/ml。用无菌玻璃涂棒把溶液涂抹于整个平 板的表面，至37C直至所有的液体消失。同时做两个对照：对照组1:以同体积的无菌双蒸水代替 DNA溶液，其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现对照组2:以同体积的无菌双蒸水代替 DNA溶液,但涂板时只取5卩I菌液涂布于 不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。四、计算转化率次日观察统计每个培养皿中的菌落数。转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子 ，根据此皿中的菌落数可计 算出转化子总数和转化频率，公式如下：转化子总数=菌落数埼稀释倍数疥专化反应原液总体积/涂板菌液体积转化频率（转化子数/每mg质粒DNA=转化子总数/质粒DNA加入量（mg感受 态细胞总数=对照组2菌落数痂释倍数菌液总体积/涂板菌液体积感受态细胞转化 效率二转化子总数/感受态细胞总数注意本实验方法也适用于其它E.coli受体菌株的不同的质粒DNA的转化。 但它们的转化效率并不一定一样。有的转化效率高，需将转化液进行多梯度稀释涂 板才能得到单菌落平板，而有的转化效率低，涂板时必须将菌液浓缩（如离心,才能较 准确的计算转化率。转化的一般步骤：1将感受态细胞加入要转化的东东（一般原则是转化物体积不超过感受态细胞 体积的十分之一。冰上置半小时。2.热休克：42度，时间30秒至120秒都可以。一般书上都是 90秒。3复苏:热休克后加入4倍体积的无抗生素培养基SOC（如果嫌麻烦丄B也可,37 度摇一小时。转速最好低于220转/分钟。4. 涂板:4000转离心2-3分钟,多余上清不要，留约200UL将菌液混匀，推平板，直到菌液基本涂干。37度孵箱放12-16小时