PCR引物设计原则教学文案

精品文档PCR引物设计原则引物 (Primer) 是人工合成的两段寡核苷酸序列。1、引物的长度一般为15-30bp ，常用的是 18-27bp，但不应大于 38，因为过长会导致其延伸温度大于74，不适于 Taq DNA聚合酶进行反应。2、G十 C含量：应在 40%-60%之间， PCR扩增中的复性温度一般是较低 Tm值引物的 Tm值减去 5-10 度。引物长度小于 20 时，其 Tm恒等于 4(G 十 C)十 2(A 十T) 。3、碱基分布的随机性：应避免连续出现4 个以上的单一碱基。尤其是不应在其3端出现超过 3 个的连续 G或 C，否则会使引物在G十 C 富集序列区错误引发 .4、引物自身：不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构.5、引物之间：两个引物之间不应有多于 4 个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免 3端的互补重叠。引物 3端最好选 T，错配的几率与 A 相比大大的降低了。 G、C之间错配的概率小于 A、T.6、引物的 5端可以修饰，而 3端不能进行修饰。 5端的修饰包括：加酶切位点，标记生物素，荧光，地高辛、 Eu3+等，引入蛋白质结合的 DNA序列，引入点突变，插入突变、缺失突变序列、引入启动子序列。因为引物的延伸是从3端开始的，因而3端不能进行任何修饰，另外3端也不能有形成任何二级结构的可能。如何设计引物不同的核苷酸序列表达的氨基酸氨基酸序列是相同的， 所以氨基酸序列才是真正保守的。引物最好在模板cDNA的保守区域内设计（ DNA的保守区是通过物种间相似序列精品文档精品文档的比较确定的，在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件比对（ Alignment ）, 各基因相同的序列就是该基因的保守区） 。PCR引物设计PCR反应中有两条引物，即5端引物和3引物。设计引物时以一条 DNA单链为基准（常以信息链为基准） ，5端引物与位于待扩增片段5端上的一小段DNA序列相同； 3端引物与位于待扩增片段3端的一小段DNA序列互补。引物设计软件Primer Premier5.0（自动搜索） *vOligo6（引物评价）vVector NTI SuitvDNAsisvOmigavDNAstarvPrimer3（在线服务）精品文档精品文档PCR常见问题PCR产物的电泳检测时间一般为48h 以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚至消失。假阴性，不出现扩增条带。PCR反应的关键环节有模板核酸的制备，引物的质量与特异性，酶的质量及溴乙锭的使用， PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。精品文档