离子交换分离纯化蛋白原理总结

离子交换分离纯化蛋白原理及应用离子交换剂基质主要有树脂、纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和硅胶(HPLC等离子交换树脂 一般只适合分离小分子物质如氨基酸等，不适合分离蛋白质等大分子物质，一方面是 因为大分子不易进入树脂紧密交联结构的内部，另一方面因为交联聚苯乙烯骨架疏水性很强，用于 蛋白质分离时，会出现疏水性的不可逆吸附。此外，离子交换树脂的机械强度较差，而且树脂的体 积常随着溶剂离子强度的变化发生溶胀和收缩。根据交换基团的电荷性质进行分类： 阳离子交换树脂：强酸型 含磺酸基团(R-S03H)中等酸型含磷酸基团(-O-PO2H4)弱酸型 含酚基、羧基阴离子交换树脂：强碱含季胺基团-N+(CH3)3弱碱含叔胺、伯胺基团-N(CH3)2阴离子交换树脂对化学试剂及热都不如阳离子交换树脂稳定。弱酸型一只能在碱性 pH范围内使用弱碱型一只能在酸性 pH范围内使用离子交换纤维素 的种类很多，可分为阴离子交换纤维素和阳离子交换纤维素两大类。由于这些材料 是纤维状的，大部分活性基团分布在表面，所以，适合于分离蛋白质等生物大分子。阴离子交换纤维素一DEAE纤维素，具二乙胺乙基，阳离子交换纤维素一CMW千维素，具有羧甲基，分别是应用得 最广泛的阴离子交换纤维素和阳离子交换纤维素。另外，根据纤维素颗粒的物理结构不同，可分为“纤维型”和“微晶型”两大类。“微晶型”因颗粒细、比重大，能制成紧密的柱，交换容量大， 分辨率高。离子交换凝胶：离子交换葡聚糖凝胶 和聚丙烯酰胺凝胶 具有许多优点，分离大分子物质， 不会引起 被分离物质的变性戒失活， 非特异性吸附很低；交换容量大(为离子交换纤维素的 3-4倍)；容易制 成微球型，因此装柱和层析时的流速都较易控制。 它的缺点是随着洗脱液的离子强度和 pH的变化， 床体积变化大，明显影响流速；另外，由于它的凝胶性质，有时会把大分子物质排阻在网络结构之外。如：葡聚糖(Sephadex )、 聚丙烯酰胺(PAG、琼脂糖(Sepharose)平衡缓冲液：它的离子强度和 pH的选择首先要保证各个待分离物质如蛋白质的稳定。其次是要使 各个待分离物质与离子交换剂有适当的结合。增强洗脱液与离子交换剂的结合力，降低分离物与离子交换剂的结合力洗脱缓冲液：在离子交换层析中一般常用 梯度洗脱，通常有改变离子强度和改变pH两种方式。改变离子强度通常是在洗脱过程中逐步增大离子强度，从而使与离子交换剂结合的各个组分被洗脱下来；而改变pH的洗脱，对于阳离子交换剂一般是 pH从低到高洗脱，阴离子交换剂一般是pH从高到低。由于pH可能对蛋白的稳定性有较大的影响，故一般通常采用改变离子强度的梯度洗脱。5-1醸基辅脂（華乙烯聚合物和季胺墓欄脂对各种嵐子的相对选择系数反离子相对选择系数 阳芻子树脂）反离子相对选择系数（阴贏子鞫脂H*1.0 |0H1.0Li*0.85500.0Na*1.5水杨酸擁450.0NH/1.95柠樣酸相220,0K*2.5韵盐110,0Ca +2.11乙醸3.27.6r175.0Mn3*2.35HSO pH时带正电DEAE纤维阴离子交换剂纯化分离酸性蛋白碱性缓冲液CM纤维素阳离子交换剂纯化分离碱性蛋白 酸性缓冲液 碱性越强，就越容易被阳离子交换剂吸附蛋白在pH58稳定时，则应选择阴离子交换剂；蛋白在 pH5以下稳定时，则可选择阳离子交换剂。 阴离子交换剂，pH8.6以下分离中性或酸性物质。阳离子交换剂，一般 pH4条件下使用，DEAE纤维素吸附酶和蛋白质时常用 pH为79,然后提高盐浓度或降低 pH使之洗脱。CW纤维素常选在 pH4.56.0左右吸附蛋白质，然后提高pH或盐浓度进行洗脱。例：用离子交换，那首先就要考虑是要阳离子还是阴离子，还有就是你的目的物的PH值蛋白质是pl=6.27阴离子交换，用 pH8.0-9.0的缓冲液首先利用缓冲液 PH值把目的蛋白给结合到柱子上，然后用合适的盐离子洗脱下来。阴离子交换柱：上样缓冲液20mM Tris-HCI，用00.5M NaCI梯度洗脱，流速约 2ml/min。注意：首先是蛋白的等电点是多少选择pH值，挂柱时pH尽量不要超过pl值的2个点。NacI的浓度可以设梯度，平衡时用O.lmol之后可以选择0.3 0.6 1.2mol的浓度，一般 0.6或1.2就可以洗脱下目的峰。然后蛋白上柱变性了是洗不下来的，只能用1mol NaOH或8 mol脲洗，再生柱子，还有些脂质洗不下来，需要用30%异丙醇洗柱再生。f阳离子交 换树脂r强酸性阳离子交换树脂 (SP-sephadex A-25)父1弱酸性阳离子交换树脂换(CM-A-sephadex-25)树脂，强碱性阴离子交换树脂阴离子交换树脂(QAE-sephadex-25)、弱碱性阴离子交换树脂(DEAE-sephadexA-25)