06第六章外源基因的表达

第六章第六章 外源基因的表达外源基因的表达u 基因工程的一个主要目的基因工程的一个主要目的基因表达：基因表达： 使目的基因在某一细胞中能得到高效表达，改变生物性状或产生人们所需要的产品（如：蛋白质、多肽类生物药物）。u 基因表达基因表达是指结构基因在调控序列的作用下转是指结构基因在调控序列的作用下转录成录成mRNA，经加工后在核糖体的协助下翻译成蛋白，经加工后在核糖体的协助下翻译成蛋白质，蛋白质经过修饰后，最终表现出相应的功能。质，蛋白质经过修饰后，最终表现出相应的功能。u 基因表达的过程基因表达的过程包括转录、转录后加工、翻包括转录、转录后加工、翻译及翻译后加工。译及翻译后加工。u 它是在一系列酶和调控序列的共同作用下完成的。它是在一系列酶和调控序列的共同作用下完成的。1.1 1.1 基因表达机制概述基因表达机制概述u 基因表达必备的条件：基因表达必备的条件： 基因能够转录：要求基因上游有“启动子”，调控元件、下游有“终止子”。 转录产生的mRNA能够有效加工并保持稳定。 翻译产生的蛋白质能够有效加工并保持稳定。u 避免出现基因沉默避免出现基因沉默1.3 mRNA1.3 mRNA延伸和稳定性延伸和稳定性 转录启始后, RNA聚合酶延伸mRNA,至终止子处终止。 mRNA应在细胞中保持稳定的拷贝数：mRNA有半衰期，必须不停转录，才能保持稳定的拷贝数。 基因上游有启动子，一般应为诱导型； 存在有效的诱导剂； 没有阻遏物。1.2 1.2 外源基因的起始转录外源基因的起始转录1.4 mRNA1.4 mRNA的加工的加工 真核生物mRNA转录后需要剪切和拼接的加工过程。 原核生物原核生物mRNAmRNA有效翻译需考虑的基本原则：有效翻译需考虑的基本原则：uAUG（ATG）为起始密码子uSD 序列应包括AGGAGG中的4个.uSD 序列与起始密码子间距3-9bpu起始区周围序列无二级结构.u外源基因的主密码子与受体细胞的相同或接近. 主密码子:基因组中使用频率高的密码子 罕用密码子:使用频率低的u终止密码: E.coli. 一般用UAA.uRF1识别UAA, UAG. RF2识别UAA, UGA.1.5 mRNA1.5 mRNA的翻译的翻译基因转录、翻译的动画演示基因转录、翻译的动画演示真核生物基因转录、转录后加工及翻译过程真核生物基因转录、转录后加工及翻译过程原核生物基因的原核生物基因的转录起始转录起始、转录转录、翻译翻译过程过程避免表达蛋白降解的方法避免表达蛋白降解的方法: :u采用融合蛋白表达系统u采用分泌蛋白表达系统u构建包涵体表达系统u选择无蛋白水解酶的受体。1.6 1.6 表达蛋白的稳定性表达蛋白的稳定性u基因沉默的形成机制主要有三种：l位置效应的基因沉默：位置效应的基因沉默：整合入甲基化程度高、转录活性低的异染色体上，一般不表达。l转录水平的基因沉默：转录水平的基因沉默：启动子的甲基化或外源基因的异染色质体。l转录后水平的基因沉默：转录后水平的基因沉默：RNA水平上, 基因可转录,但mRNA合成后被降解或被反义RNA或蛋白质封闭.u转基因植物和转基因动物中常见。1.7 1.7 基因沉默基因沉默l序列特异性：几个保守的序列框。l方向性：启动子正反两种方向中只有一种具有启动功能。l位置特性：启动子只能位于所基因的上游或基因内的前端。l种属特异性：不同种属、不同组织的启动子不同。2.1 2.1 启动子启动子u原核生物启动子原核生物启动子l转录起始位点:多为CAT, 从第二个碱基开始。l-10区：TATAAT，一般在起始位点上游6bp处。l-35区：TTGACA，一般在起始位点上游35bp处。其中前个碱基高度保守l间隔区：-10区与-35区存在长度不等的间隔区，序列无保守性，间隔的长度非常重要。一般间隔16-18bp，E.coli.为17bp最好。u真核生物启动子真核生物启动子l能够增强启动子转录活性的DNA顺式作用序列。l结构与启动子类似，由多个元件组成，每个元件与一种或多种转录调控因子结合。转录调控区通常有一至多个增强子。每个均有一种特定的功能：如在特定的发育阶段起作用。2.2 2.2 增强子增强子增强子的特性增强子的特性l双向性：正反方向均可l重复序列：独立行使功能l功能的行使与位置无关：可上游、下游或中间l特异性：功能行使有组织特异性或发育阶段特异性。l可调节同源基因，也可调节异源基因。l转录终止的位置l分为本征终止子和依赖终止信号的终止子两类。2.3 2.3 终止子终止子l调节转录的起始和终止.lTrp操纵子2.4 2.4 衰减子衰减子外源基因表达系统：外源基因表达系统：泛指目的基因与表达载体重组后，导入合适的受体细胞，并能在其中有效表达，产生目的基因产物（目的蛋白）。3.1 3.1 定义定义原核生物基原核生物基因表达系统因表达系统真核生物基真核生物基因表达系统因表达系统基因表达载体基因表达载体受体细胞受体细胞3.2 3.2 种类种类外源基因外源基因表达系统表达系统基因表达载体基因表达载体受体细胞受体细胞原核生物基因表达系统原核生物基因表达系统u 大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统u 芽孢杆菌表达系统芽孢杆菌表达系统u 链霉菌表达系统链霉菌表达系统u 蓝藻表达系统等。蓝藻表达系统等。真核生物基因表达系统真核生物基因表达系统u 酵母表达系统酵母表达系统u 植物细胞表达系统植物细胞表达系统u 昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统u 哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统外源基因外源基因表达系统表达系统3.2 3.2 种类种类表达载体表达载体受体细胞受体细胞3.3 3.3 原核生物与真核生物间基因表达的差原核生物与真核生物间基因表达的差别别原原核核生生物物基基因因表表达达真真核核生生物物基基因因表表达达转录转录加工加工翻译翻译加工修饰加工修饰转录转录加工加工翻译翻译加工修饰加工修饰原核生物表达系统原核生物表达系统 基因表达：以操纵子形式进行。 当操纵子的调节基因与RNA聚合酶作用时，结构基因则开始转录成相应的mRNA; 与此同时， mRNA立即与核糖体结合转译出相应的多肽或蛋白质，转录完毕时转译也完成，随之mRNA也被水解掉。真核生物基因表达系统真核生物基因表达系统 转录是在核内进行的，先生成hnRNA，再加工加工去掉内含子，外显子相连接，并修饰修饰5和3末端后才形成成熟的、有功能的mRNA。 mRNA只能在细胞质中的核糖体上转译成多肽或蛋白质，再经过加工、糖化加工、糖化，形成高级结构。3.3 3.3 原核生物与真核生物间基因表达的差原核生物与真核生物间基因表达的差别别 多数为单细胞, 异养，生长快，代谢易于控制，可迅速获得大量产物。 基因组结构简单，便于操作。 含有质粒或噬菌体，便于构建表达载体。 生理代谢途径及基因表达调控比较清楚。 不具备蛋白质加工系统，表达产物无特定的空间构象。 内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造成表达产物的不稳定性。3.4 3.4 原核生物作为基因表达系统的特点原核生物作为基因表达系统的特点 大肠杆菌是一种革兰氏阴性细菌，其遗传背景清楚，目标基因表达的水平高，培养周期短。 应用最广泛的基因表达系统。 大肠杆菌基础生物学、遗传学以及分子生物学等方面的背景清楚，特别是对其基因表达调控的分子机理有了深刻的了解； 大肠杆菌已被发展成为一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体系列； 实验已经证明，许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中实现有效的、高水平的表达； 大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易于进行工业化批量生产。4.1 4.1 大肠杆菌表达系统的优越性大肠杆菌表达系统的优越性 大肠杆菌基因表达载体中包括大肠杆菌基因表达载体中包括3 3个系统个系统：DNADNA复制复制及及重组载体的选择重组载体的选择系统系统（复制子、选择标记）（复制子、选择标记）外源目的基因的外源目的基因的转录转录系统系统蛋白质的蛋白质的翻译翻译系统系统4.2 4.2 大肠杆菌基因表达载体大肠杆菌基因表达载体基因表达载体基因表达载体复制子：复制子：是一段包含复制起始位点（ori）和反式因子作用区在内的DNA片段。大肠杆菌基因表达载体一般是质粒表达载体质粒表达载体，含有可有效复制的复制子。4.2.1 DNA4.2.1 DNA复制及重组载体的选择系统复制及重组载体的选择系统常见的复制子常见的复制子pMB1pMB1、p15Ap15A、ColE1ColE1：松弛复制型松弛复制型，每细胞质粒拷贝数每细胞质粒拷贝数10102020个。个。pSC101pSC101：严谨复制型严谨复制型，每细胞质粒，每细胞质粒拷贝数少于拷贝数少于5 5个。个。在同一大肠杆菌细胞内，在同一大肠杆菌细胞内， 含含同一类型复制子同一类型复制子的不同质粒载体的不同质粒载体不能共存不能共存 含含不同类型复制子不同类型复制子的不同质粒载体的不同质粒载体可以共存可以共存 复制子复制子 选择标记选择标记目的：目的：使转化体产生新的表型，将转化了的细胞从大量的菌群中分离出来。微生物表型选择标记微生物表型选择标记显性标记显性标记营养缺陷型标记营养缺陷型标记抗菌素抗性标记抗菌素抗性标记颜色标记颜色标记u 抗菌素抗性标记：抗菌素抗性标记：在质粒载体中最常用在质粒载体中最常用。原因：原因：许多质粒本身就带有抗菌素抗性基因；再有抗菌素许多质粒本身就带有抗菌素抗性基因；再有抗菌素抗性记号便于操作、易于选择等。抗性记号便于操作、易于选择等。u 主要抗菌素标记主要抗菌素标记l 氨苄青霉素抗性l 四环素抗性l 链霉素抗性l 氯霉素抗性l 卡那霉素抗性u 包括：包括：启动子、抑制物基因和终止子。启动子、抑制物基因和终止子。u 启动子和终止子：启动子和终止子：因宿主的不同而有差别，往因宿主的不同而有差别，往往在不同的宿主中表达的效率也不一样，特别是往在不同的宿主中表达的效率也不一样，特别是原核生物和真核生物宿主间完全不同，相互间不原核生物和真核生物宿主间完全不同，相互间不能通用。能通用。4.2.2 4.2.2 转录系统转录系统 启动子启动子外源目的基因外源目的基因转录的起始转录的起始是基因表达的关键步是基因表达的关键步骤。骤。选择可调控的选择可调控的强启动子强启动子是构建一个理想的表达是构建一个理想的表达系统首先要考虑的问题。系统首先要考虑的问题。抑制物基因的产物是一种抑制物基因的产物是一种控制启动子功能控制启动子功能的蛋的蛋白质，对启动子的起始转录功能产生白质，对启动子的起始转录功能产生抑制作用抑制作用。在适当的诱导条件下可使抑制物失活，启动子在适当的诱导条件下可使抑制物失活，启动子功能重新恢复。功能重新恢复。 抑制物基因抑制物基因抑制物基因产物的作用：抑制物基因产物的作用：使目的基因在宿主培使目的基因在宿主培养到最佳状态时进行转录，养到最佳状态时进行转录，从而保证转录的有效进从而保证转录的有效进行，特别是表达产物对宿主有害时，行，特别是表达产物对宿主有害时，控制转录的时控制转录的时机机尤其重要。尤其重要。理想的可调控的启动子在细胞生长的初期往往理想的可调控的启动子在细胞生长的初期往往不表达或低水平表达，而当细胞增殖到一定的密度不表达或低水平表达，而当细胞增殖到一定的密度后，在某种特定的诱导因子（如光、温度或化学药后，在某种特定的诱导因子（如光、温度或化学药物等）的诱导下，物等）的诱导下，RNA聚合酶才开始启动转录，合聚合酶才开始启动转录，合成成mRNA。转录终止子转录终止子：一段终止：一段终止RNA聚合酶转录的聚合酶转录的DNA序列。序列。转录终止子的转录终止子的功能功能： 使转录在目的基因之后立即停止。使转录在目的基因之后立即停止。 控制目的基因控制目的基因mRNA的长度，提高的长度，提高mRNA稳定性，稳定性，避免质粒上其它基因的异常表达。避免质粒上其它基因的异常表达。 转录终止子转录终止子目的基因目的基因在在强启动子强启动子的控制下容易发生的控制下容易发生转录过头转录过头的的现象，形成长短不一的现象，形成长短不一的mRNA混合物，影响混合物，影响mRNA的翻译效率，使外源基因的转录速度降低。的翻译效率，使外源基因的转录速度降低。因此，在构建表达载体的时候因此，在构建表达载体的时候一般采用强的启动子一般采用强的启动子和强的终止子，和强的终止子，以达到高效表达的目的。以达到高效表达的目的。原核生物中影响翻译起始的因素：原核生物中影响翻译起始的因素：l 起始密码子起始密码子l 核糖体结合位点（核糖体结合位点（SD序列）序列）l 终止密码子终止密码子l 起始密码子与起始密码子与SD序列之间的距离和碱基组成序列之间的距离和碱基组成l mRNA的二级结构的二级结构l mRNA上游的上游的5端非翻译序列端非翻译序列l 蛋白编码区的蛋白编码区的5端序列等。端序列等。4.2.3 4.2.3 翻译系统翻译系统 例如：例如：l 起始密码子与SD序列之间的距离：68bp，多数为7bp。l SD序列后面的碱基组成：为AAAA或UUUU时，翻译起始效率最高；为CCCC或GGGG是，翻译起始效率分别为最高的50%和15%。翻译系统翻译系统核糖体结合位点核糖体结合位点 翻译起始密码子翻译起始密码子翻译终止密码子翻译终止密码子 核糖体结合位点核糖体结合位点u 核糖体结合位点：核糖体结合位点：原核基因转录起始位点下游原核基因转录起始位点下游的一段的一段DNADNA序列，即序列，即Shine-DalgarnoShine-Dalgarno序列（简称序列（简称SDSD序序列）列）。u SDSD序列与核糖体序列与核糖体16S rRNA16S rRNA特异配对特异配对而使而使mRNAmRNA与与宿主核糖体结合，对宿主核糖体结合，对“翻译翻译”起着决定性的作用。起着决定性的作用。uSDSD序列与核糖体序列与核糖体16S rRNA16S rRNA的互补性高，核糖体与的互补性高，核糖体与mRNAmRNA的结合程度越强，翻译的起始效率越高。的结合程度越强，翻译的起始效率越高。u大肠杆菌大肠杆菌SDSD序列的碱基组成为：序列的碱基组成为：5 AGGAGG 3 5 AGGAGG 3 u其中以其中以GGAGGGAG最为重要，任何一个发生突变都会使最为重要，任何一个发生突变都会使翻译效率的大幅度下降。翻译效率的大幅度下降。 翻译起始密码子翻译起始密码子u起始密码子是翻译的起始位点，起始密码子是翻译的起始位点，通常为通常为AUGAUG（ATGATG），编码甲硫氨酸（），编码甲硫氨酸（METMET），），是首选的起始是首选的起始密码子。密码子。uGUGGUG、UUGUUG：有极少数生物利用。：有极少数生物利用。 翻译终止密码子翻译终止密码子u翻译终止密码子：能使核糖体从翻译终止密码子：能使核糖体从mRNAmRNA模板上脱落模板上脱落下来，终止蛋白质的翻译过程。下来，终止蛋白质的翻译过程。u在大肠杆菌中，新合成的多肽链的释放由在大肠杆菌中，新合成的多肽链的释放由RF1RF1和和RF2RF2两个释放因子所调控。两个释放因子所调控。l RF1RF1识别终止密码识别终止密码UAAUAA和和UAGUAG， l RF2RF2识别终止密码识别终止密码UAAUAA和和UGAUGAl 由于由于UAAUAA同时为两个释放因子所识别，一般被选同时为两个释放因子所识别，一般被选作翻译的终止密码。作翻译的终止密码。l 通常将通常将几个终止密码串连几个终止密码串连在一起，以保证翻译在一起，以保证翻译的有效终止。的有效终止。DNADNA复制复制及重组及重组载体的载体的选择选择系统系统外源基因的外源基因的转录转录系统系统蛋白质的蛋白质的翻译翻译系系统统基因表基因表达载体达载体复制子复制子选择标记选择标记启动子启动子抑制物基因抑制物基因终止子终止子翻译起始密码子翻译起始密码子核糖体结合位点核糖体结合位点翻译终止密码子翻译终止密码子u 大肠杆菌缺乏复杂的翻译后加工和蛋白质折叠系统大肠杆菌缺乏复杂的翻译后加工和蛋白质折叠系统u 大肠杆菌不具备类似真核细胞的亚细胞结构和表达大肠杆菌不具备类似真核细胞的亚细胞结构和表达产物稳定因子。产物稳定因子。u 大量的异源重组蛋白在大肠杆菌细胞中形成高浓度大量的异源重组蛋白在大肠杆菌细胞中形成高浓度的微环境，导致蛋白质分子之间的作用增强。的微环境，导致蛋白质分子之间的作用增强。4.3 4.3 宿主菌宿主菌4.3.1 4.3.1 重组异源蛋白在大肠杆菌中不稳定的原因重组异源蛋白在大肠杆菌中不稳定的原因菌株 基因型 启动子 BL21 hsd S gal T7 噬菌体 HMS174 recA1 hsdR rif r T7 噬菌体 lacZ trpA rpsL 噬菌体 PL M5219 RB791 W3110 lacIq L8 lac, tac 4.3.2 4.3.2 常见的大肠杆菌基因表达受体菌株常见的大肠杆菌基因表达受体菌株uLacLac和和TacTac表达系统：表达系统：是以是以laclac操纵子调控机制为基操纵子调控机制为基础设计和构建的表达系统。础设计和构建的表达系统。uPLPL和和PRPR表达系统：表达系统：是以是以噬菌体早期转录启动子噬菌体早期转录启动子PLPL和和PRPR构建的。构建的。 uT7T7表达系统：表达系统：是利用大肠杆菌是利用大肠杆菌T7T7噬菌体转录系统元噬菌体转录系统元件构建的表达系统，它具有很高的表达能力。件构建的表达系统，它具有很高的表达能力。4.3.3 4.3.3 常见的大肠杆菌基因表达系统（了解）常见的大肠杆菌基因表达系统（了解）u表达产物的存在部位表达产物的存在部位 细胞质细胞质 细胞周质细胞周质 细胞外培养基细胞外培养基u表达形式表达形式 不溶性蛋白不溶性蛋白 可溶性蛋白可溶性蛋白4.4 4.4 外源基因在大肠杆菌表达的形式外源基因在大肠杆菌表达的形式包涵体：包涵体：在一定条件下，外源基因的表达产物在大在一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密地集中在一起，形成无膜的裸露肠杆菌中积累并致密地集中在一起，形成无膜的裸露结构，称为包涵体。结构，称为包涵体。包涵体存在部位：包涵体存在部位：细胞质、细胞周质细胞质、细胞周质包涵体荧光图包涵体荧光图 4.4.1 4.4.1 包涵体蛋白包涵体蛋白包涵体包涵体的组成的组成蛋白质蛋白质非蛋白质非蛋白质外源基因的表达产物：外源基因的表达产物：占大部分，占大部分，有正确的氨基酸序列，但空间构有正确的氨基酸序列，但空间构象错误，一般象错误，一般没有生物活性没有生物活性。受体细胞的表达产物：受体细胞的表达产物：如如RNA聚聚合酶、核糖核蛋白、外膜蛋白以合酶、核糖核蛋白、外膜蛋白以及表达载体编码的蛋白等。及表达载体编码的蛋白等。：包括：包括DNA、RNA和脂多糖等。和脂多糖等。包涵体形成的本质包涵体形成的本质是细胞内蛋白质的不断集是细胞内蛋白质的不断集聚，主要包括三个方面：聚，主要包括三个方面：折叠状态的蛋白质的集聚作用；折叠状态的蛋白质的集聚作用；非折叠状态的蛋白质的集聚作用；非折叠状态的蛋白质的集聚作用；蛋白质折叠中间体的作用。蛋白质折叠中间体的作用。以包涵体形式表达的外源蛋白最突出的以包涵体形式表达的外源蛋白最突出的优点优点是：是：u 易于分离纯化：易于分离纯化：包涵体的难溶于水，密度远大于包涵体的难溶于水，密度远大于其他蛋白，通过高速离心即可将包涵体蛋白与其他其他蛋白，通过高速离心即可将包涵体蛋白与其他蛋白区分开来；蛋白区分开来；u 稳定性高：稳定性高：对蛋白酶表现出好的抗性。对蛋白酶表现出好的抗性。融合蛋白融合蛋白将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，但不改变两个基因的阅读框，以这因重组在一起，但不改变两个基因的阅读框，以这种方式表达的蛋白称为融合蛋白。种方式表达的蛋白称为融合蛋白。* *融合蛋白与单独表达的外源蛋白相比具有以下融合蛋白与单独表达的外源蛋白相比具有以下优点：优点： 稳定性好；稳定性好； 表达效率高；表达效率高； 较易于分离纯化。较易于分离纯化。4.4.2 4.4.2 融合蛋白融合蛋白为提高外源蛋白表达量，在构建外源蛋白表达为提高外源蛋白表达量，在构建外源蛋白表达载体时，将多个外源目的蛋白基因串连在一起，克载体时，将多个外源目的蛋白基因串连在一起，克隆在质粒载体上，以这种方式表达的外源蛋白称为隆在质粒载体上，以这种方式表达的外源蛋白称为寡聚型外源蛋白寡聚型外源蛋白。4.4.3 4.4.3 寡聚型外源蛋白寡聚型外源蛋白多表达单元的重组：多表达单元的重组：每个表达单元都含独立的启动子、每个表达单元都含独立的启动子、终止子、终止子、SD序列、起始密码和终止密码，形成序列、起始密码和终止密码，形成独立转录独立转录与串连翻译与串连翻译的表达单元。表达的外源蛋白不需经过裂解处的表达单元。表达的外源蛋白不需经过裂解处理。该方式适合表达理。该方式适合表达相对分子质量较大相对分子质量较大的蛋白。的蛋白。多顺反子重组：多顺反子重组：多拷贝外源基因有各自的多拷贝外源基因有各自的SD序列、翻序列、翻译起始和终止信号，但转录是在译起始和终止信号，但转录是在共同的转录启动子和终止共同的转录启动子和终止子子控制下进行的，表达的外源蛋白分子是相互独立的。该控制下进行的，表达的外源蛋白分子是相互独立的。该方式适合表达方式适合表达中等大小分子量中等大小分子量的外源蛋白。的外源蛋白。多编码序列重组：多编码序列重组：将多个外源基因串连在一起，利用将多个外源基因串连在一起，利用同同一套一套转录调控元件、翻译起始与终止密码子，在各编码序转录调控元件、翻译起始与终止密码子，在各编码序列的接口引入蛋白酶酶切位点或可被化学断裂的位点。该列的接口引入蛋白酶酶切位点或可被化学断裂的位点。该方式特别适合表达外源方式特别适合表达外源小分子小分子蛋白或多肽。蛋白或多肽。外源基因外源基因多分子线性重组多分子线性重组串连串连的方式通常有三种：的方式通常有三种：为防止外源基因随质粒丢失，将要表达的外源基为防止外源基因随质粒丢失，将要表达的外源基因整合到染色体的因整合到染色体的非必需编码区非必需编码区上，使之成为染色体上，使之成为染色体结构的一部分而稳定地遗传，以此种方式表达的外源结构的一部分而稳定地遗传，以此种方式表达的外源蛋白即为蛋白即为整合型外源蛋白整合型外源蛋白。实现外源基因与宿主染色体整合是根据实现外源基因与宿主染色体整合是根据DNA同同源交换的原理源交换的原理，因此在待整合的外源基因两侧必须，因此在待整合的外源基因两侧必须分别组合一段与染色体分别组合一段与染色体DNA完全同源的序列。此外，完全同源的序列。此外，还必须将可控的表达元件和选择标记基因连接在一还必须将可控的表达元件和选择标记基因连接在一起。起。4.4.4 4.4.4 整合型外源蛋白整合型外源蛋白为获得含整合基因的重组体，被选择的载体一为获得含整合基因的重组体，被选择的载体一般是那些在受体细胞内般是那些在受体细胞内不能自主复制不能自主复制或或温度敏感温度敏感型质粒型质粒。当外源基因被交换到染色体上后，由于宿主菌当外源基因被交换到染色体上后，由于宿主菌的不断分裂和增殖，细胞内的质粒逐渐被稀释直的不断分裂和增殖，细胞内的质粒逐渐被稀释直至消失。至消失。外源基因整合到染色体上后虽只含有单拷贝，外源基因整合到染色体上后虽只含有单拷贝，但在合适的条件下仍能高效表达外源蛋白。但在合适的条件下仍能高效表达外源蛋白。外源基因的表达产物，通过运输或分泌的方式穿外源基因的表达产物，通过运输或分泌的方式穿过细胞的外膜进入培养基中，即为过细胞的外膜进入培养基中，即为分泌型外源蛋白分泌型外源蛋白。外源蛋白以分泌型蛋白表达时，须在外源蛋白以分泌型蛋白表达时，须在N N端加入端加入15153030个氨基酸组成的个氨基酸组成的信号肽信号肽序列。序列。信号肽信号肽N N端的最初几个氨基酸为极性氨基酸，中端的最初几个氨基酸为极性氨基酸，中间和后部为疏水氨基酸，它们间和后部为疏水氨基酸，它们对蛋白质分泌到细胞对蛋白质分泌到细胞膜外起决定性作用膜外起决定性作用。当蛋白质分泌到位于大肠杆菌细胞内膜与外膜当蛋白质分泌到位于大肠杆菌细胞内膜与外膜之间的外周质时，信号肽被之间的外周质时，信号肽被信号肽酶信号肽酶所切割。所切割。4.4.5 4.4.5 分泌型外源蛋白分泌型外源蛋白分泌到细胞外周质的蛋白质产物较稳定，不易被分泌到细胞外周质的蛋白质产物较稳定，不易被细胞内蛋白酶所降解。细胞内蛋白酶所降解。简化了发酵后处理的纯化工艺。简化了发酵后处理的纯化工艺。缺点：缺点：外源蛋白分泌型表达通常产量不高，有时信外源蛋白分泌型表达通常产量不高，有时信号肽不被切割或在不适当的位置发生切割。号肽不被切割或在不适当的位置发生切割。分泌型可能使蛋白质按适当的方式折叠，有利于分泌型可能使蛋白质按适当的方式折叠，有利于形成正确的空间构相，获得有较好生物学活性或免形成正确的空间构相，获得有较好生物学活性或免疫原性的蛋白质。甚至有些在细胞内表达时无活性疫原性的蛋白质。甚至有些在细胞内表达时无活性的蛋白质分泌后则有活性。的蛋白质分泌后则有活性。以分泌型蛋白的形式表达外源基因的以分泌型蛋白的形式表达外源基因的优点：优点：v高效表达外源基因须考虑的基本原则：高效表达外源基因须考虑的基本原则：u 优化表达载体的设计。优化表达载体的设计。u 提高稀有密码子提高稀有密码子tRNAtRNA的表达作用。的表达作用。u 提高外源基因提高外源基因mRNAmRNA的稳定性。的稳定性。u 提高外源基因表达产物的稳定性。提高外源基因表达产物的稳定性。u 优化发酵过程。优化发酵过程。4.5 4.5 在大肠杆菌中高效表达目的基因的策略在大肠杆菌中高效表达目的基因的策略 重组蛋白分泌到胞外重组蛋白分泌到胞外u优点优点 E.coli.自身的胞外蛋白质少，利于重组蛋白的分离纯化，而且纯化时不需要经过细胞破碎。 E.coli.细胞外的蛋白酶活性很低，易于重组蛋白的稳定积累。 u缺点：缺点： E.coli. 分泌蛋白的能力有限，产量较低。 纯化蛋白时的起始操作体积很大。4.6 4.6 大肠杆菌中重组蛋白的分离纯化大肠杆菌中重组蛋白的分离纯化4.6.1 4.6.1 大肠杆菌重组蛋白表达的部位及特点大肠杆菌重组蛋白表达的部位及特点重组蛋白表达于细胞周质重组蛋白表达于细胞周质 周质中的蛋白质少，采用特殊的细胞破碎工艺可以减少宿主杂蛋白，利于重组蛋白的分离纯化。 周质中的蛋白酶活性低，利于重组蛋白的稳定。 周质具有一个氧化环境，利于重组蛋白正确折叠。 重组蛋白向周质转运时，信号肽在细胞内被切割，利于形成具有正确N末端的重组蛋白。4.6.1 4.6.1 大肠杆菌重组蛋白表达的部位及特点大肠杆菌重组蛋白表达的部位及特点 胞内胞内 重组蛋白在胞内表达，通常以可溶性形式或不溶的包涵体形式存在。u可溶性形式表达：可溶性形式表达： 缺点：缺点：胞内有较高的蛋白酶活性，重组蛋白不能稳定积累；胞内有大量的宿主杂蛋白，不利纯化。 解决方法：解决方法：采用融合表达的方式生产重组蛋白，然后采用高分辨率的亲和层析进行分离。 4.6.1 4.6.1 大肠杆菌重组蛋白表达的部位及特点大肠杆菌重组蛋白表达的部位及特点u包涵体形式表达：包涵体形式表达：特点：特点： 优点：利于重组蛋白的分离纯化；不易被蛋白酶降解。重组蛋白折叠错误，不具有生物活性，不会对宿主细胞造成毒害。可直接作为为抗原制备抗体。 缺点：要想得到具有生物活性的重组蛋白需要经过繁琐的变性、复性过程且得率不高。 通常采用低温诱导、与分子伴侣共表达等方式避免包涵体的形成，以提高有活性的重组蛋白的得率。 机械破碎法 包括研磨法、匀浆法、捣碎法等。 物理破碎法 包括反复冻融法、溶胀法、压榨法、超声波破碎法等。 化学破碎法 使用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性有机溶剂或SDS等表面活性剂处理细胞。 也可与研磨法联合使用将细胞膜溶解从而使细胞破裂。 酶促破碎法 包括自溶法和酶溶法。4.6.2 4.6.2 大肠杆菌细胞的破碎大肠杆菌细胞的破碎4.6.3 4.6.3 细胞破碎后的固液分离细胞破碎后的固液分离 高速离心：实现固液分离，将细胞碎片和其它固形物沉淀下来。 对于可溶性表达的重组蛋白：可溶于上清液中，直接进行后续纯化。 包涵体：与细胞碎片等一起沉淀。通常使用0.5TritonX-100或2M尿素溶液洗涤沉淀物，除去细胞碎片中的杂蛋白，加入DNA酶和RNA酶进行消化取出DNA、RNA。之后使用高浓度的尿素68M溶解包涵体，用于后续分离纯化。4.6.4 4.6.4 重组蛋白的分离纯化重组蛋白的分离纯化 固液分离分离后的可采用层析技术（离子交换层析、亲和层析等）、电泳技术等进行重组蛋白的分离纯化。 （生化的内容）芽孢杆菌芽孢杆菌属属革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌，细胞壁不含，细胞壁不含内毒素，能将表达蛋白分泌到细胞外。内毒素，能将表达蛋白分泌到细胞外。目前常用作基因表达系统的有目前常用作基因表达系统的有枯草杆菌、短枯草杆菌、短小芽孢杆菌小芽孢杆菌等。等。v利用芽孢杆菌作为表达外源基因的受体菌的利用芽孢杆菌作为表达外源基因的受体菌的优点：优点：u 无致病性，培养条件简单，生长迅速；无致病性，培养条件简单，生长迅速；u表达产物能分泌到细胞外的培养基中，且多数表达表达产物能分泌到细胞外的培养基中，且多数表达产物具有天然构相和生物学活性；产物具有天然构相和生物学活性；u某些芽孢杆菌的遗传背景比较清楚，便于进行遗传某些芽孢杆菌的遗传背景比较清楚，便于进行遗传操作；操作；u利用芽孢杆菌进行发酵的技术相当成熟。利用芽孢杆菌进行发酵的技术相当成熟。金色葡萄球菌的复制子金色葡萄球菌的复制子：如如pUB110、pC194和和pE194等等短小芽孢杆菌的复制子短小芽孢杆菌的复制子：如如pHY481和和pWT481等等含金色葡萄球菌复制子的质粒表达载体在宿主细胞中含金色葡萄球菌复制子的质粒表达载体在宿主细胞中拷贝数高，但不稳定，原因是质粒载体与宿主染色体拷贝数高，但不稳定，原因是质粒载体与宿主染色体DNA之间发生遗传重组。之间发生遗传重组。短小芽孢杆菌型复制子的质粒表达载体在宿主细胞中短小芽孢杆菌型复制子的质粒表达载体在宿主细胞中的的拷贝数较低，但能稳定拷贝数较低，但能稳定存在于宿主细胞中，甚至在没有存在于宿主细胞中，甚至在没有抗生素选择压力下也不易造成质粒的丢失。抗生素选择压力下也不易造成质粒的丢失。5.1 5.1 芽孢杆菌表达载体芽孢杆菌表达载体5.1.1 5.1.1 复制子复制子自主复制质粒：自主复制质粒：是一类是一类穿梭质粒穿梭质粒，能在，能在大肠杆菌大肠杆菌中复制，中复制，同时含有能在芽孢杆菌中复制的起始序列，因而也能在同时含有能在芽孢杆菌中复制的起始序列，因而也能在芽孢芽孢杆菌杆菌中进行自主复制。中进行自主复制。整合质粒：整合质粒：在大肠杆菌质粒基础上构建而成，不含在芽孢在大肠杆菌质粒基础上构建而成，不含在芽孢杆菌进行复制的起始序列，因而不能在芽孢杆菌中自主复制，杆菌进行复制的起始序列，因而不能在芽孢杆菌中自主复制，但它能但它能插入到宿主染色体插入到宿主染色体并将外源基因和标记基因整合到染并将外源基因和标记基因整合到染色体上，随细胞染色体复制而复制，该方式表达外源基因解色体上，随细胞染色体复制而复制，该方式表达外源基因解决了芽孢杆菌中质粒不能稳定遗传的问题。决了芽孢杆菌中质粒不能稳定遗传的问题。噬菌体：噬菌体：以芽孢杆菌温和型噬菌体构建的表达载体能将外以芽孢杆菌温和型噬菌体构建的表达载体能将外源基因源基因定位整合到染色体定位整合到染色体上，并且在合适条件下（温度）诱上，并且在合适条件下（温度）诱导外源基因表达。导外源基因表达。5.1.2 5.1.2 表达载体类型表达载体类型常用的宿主菌常用的宿主菌枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌短小芽孢杆菌短小芽孢杆菌地衣芽孢杆菌地衣芽孢杆菌5.2 5.2 宿主菌宿主菌芽孢杆菌的细胞膜不同与大肠杆菌，通常只有芽孢杆菌的细胞膜不同与大肠杆菌，通常只有一层细胞膜一层细胞膜，当分泌型蛋白质跨膜后就进入到培养，当分泌型蛋白质跨膜后就进入到培养基中，因此，外源蛋白的表达量可以达到很高的水基中，因此，外源蛋白的表达量可以达到很高的水平，其表达量可达平，其表达量可达30g/L。5.3 5.3 外源基因在芽孢杆菌中的分泌表达外源基因在芽孢杆菌中的分泌表达提高表达质粒在细胞中的稳定性提高表达质粒在细胞中的稳定性灭活芽孢杆菌胞外蛋白酶灭活芽孢杆菌胞外蛋白酶5.4 5.4 在芽孢杆菌中高效表达外源基因的策略在芽孢杆菌中高效表达外源基因的策略 酵母（酵母（yeastyeast）是一类以芽殖或裂殖进行无性繁殖的单细胞）是一类以芽殖或裂殖进行无性繁殖的单细胞真核生物，是最理想的真核生物基因表达系统。真核生物，是最理想的真核生物基因表达系统。 基因表达调控的机制比较清楚，遗传操作相对简基因表达调控的机制比较清楚，遗传操作相对简便。便。 具有原核生物所不具备的蛋白质翻译后的加工和具有原核生物所不具备的蛋白质翻译后的加工和修饰系统。修饰系统。 可将外源基因表达产物分泌到培养基中。可将外源基因表达产物分泌到培养基中。 对人体和环境安全，不含毒素和特异性病毒。对人体和环境安全，不含毒素和特异性病毒。 可进行大规模的发酵，工艺简单而成熟，成本低可进行大规模的发酵，工艺简单而成熟，成本低廉。廉。6.1 6.1 酵母表达系统的优点酵母表达系统的优点 酵母基因表达系统的载体一般是一种酵母基因表达系统的载体一般是一种穿梭质粒穿梭质粒，它既能够在，它既能够在原核细胞（大肠杆菌）中复制，又能在真核细胞（酵母）中复原核细胞（大肠杆菌）中复制，又能在真核细胞（酵母）中复制。制。uDNADNA复制起始区复制起始区a a：大肠杆菌源质粒的复制起始序列：使其能在大肠杆菌中复：大肠杆菌源质粒的复制起始序列：使其能在大肠杆菌中复制。制。b b：酵母菌的天然：酵母菌的天然22质粒的复制起始序列或酵母基因组中的自质粒的复制起始序列或酵母基因组中的自主复制序列，使其能在酵母菌中复制。主复制序列，使其能在酵母菌中复制。6.2 6.2 酵母表达载体酵母表达载体6.2.1 6.2.1 酵母表达载体概述酵母表达载体概述u选择标记基因选择标记基因a a：营养缺陷型选择标记，宿主菌为相应的营养缺陷型。：营养缺陷型选择标记，宿主菌为相应的营养缺陷型。b b：显性选择标记（：显性选择标记（G418G418等），可采用各种类型酵母细胞作为等），可采用各种类型酵母细胞作为宿主细胞。宿主细胞。u有丝分裂稳定区有丝分裂稳定区 来源于酵母染色体着丝粒（来源于酵母染色体着丝粒（centromerecentromere）片断，能保证表达）片断，能保证表达载体在酵母细胞分裂时，能平均地分配到子代细胞中去。载体在酵母细胞分裂时，能平均地分配到子代细胞中去。u表达盒表达盒 表达盒是酵母表达载体的重要元件，包括启动子、分泌信号表达盒是酵母表达载体的重要元件，包括启动子、分泌信号肽序列、多克隆位点及终止子序列。肽序列、多克隆位点及终止子序列。u自主复制型质粒载体自主复制型质粒载体 该质粒该质粒含有酵母基因组的含有酵母基因组的DNADNA复制起始区、选择标复制起始区、选择标记、基因克隆位点等关键元件。能够在酵母细胞中自记、基因克隆位点等关键元件。能够在酵母细胞中自主复制。主复制。 优点：优点：在酵母细胞中的转化率高，拷贝数可达在酵母细胞中的转化率高，拷贝数可达200200个个/ /细胞细胞 缺点：缺点：缺乏酵母染色体着丝粒片断，在细胞分裂过缺乏酵母染色体着丝粒片断，在细胞分裂过程中不能均匀的分配到子细胞中去，因而经过多代培程中不能均匀的分配到子细胞中去，因而经过多代培养后，拷贝数迅速减少。养后，拷贝数迅速减少。6.2.2 6.2.2 酵母表达载体的种类酵母表达载体的种类u整合型质粒载体整合型质粒载体 该质粒该质粒载体不含有酵母载体不含有酵母DNADNA复制起始区，不能在酵复制起始区，不能在酵母中进行自主复制，但该质粒含有整合介导区，可以母中进行自主复制，但该质粒含有整合介导区，可以通过通过DNADNA的同源重组将外源基因整合到酵母染色体上，的同源重组将外源基因整合到酵母染色体上，随染色体一起进行复制。随染色体一起进行复制。u着丝粒型质粒载体着丝粒型质粒载体 该质粒该质粒载体是在自主复制型质粒载体的基础上构建载体是在自主复制型质粒载体的基础上构建而成的，增加了酵母染色体有丝分裂稳定序列元件而成的，增加了酵母染色体有丝分裂稳定序列元件（着丝粒），因而能保证质粒载体在细胞分裂时平均（着丝粒），因而能保证质粒载体在细胞分裂时平均地分配到子细胞中去，同时提高了质粒在宿主细胞中地分配到子细胞中去，同时提高了质粒在宿主细胞中的稳定性。的稳定性。u酵母人工染色体酵母人工染色体u酿酒酵母酿酒酵母u巴斯德毕赤酵母巴斯德毕赤酵母u乳酸克努维酵母乳酸克努维酵母u多形汉森酵母。多形汉森酵母。6.3 6.3 宿主菌宿主菌提高表达载体在细胞中的拷贝数提高表达载体在细胞中的拷贝数 以多拷贝酵母内源性质粒为基础构建的多拷贝表达载体，是提高表达载体在酵母中拷贝数的一个途径。 但在没有选择压力的情况下，拷贝数会降低。 将外源基因整合到染色体上可维持外源基因在细胞中的稳定性，然而在多数情况下会因为在细胞中的拷贝数较低而影响其表达。6.4 6.4 在酵母中高效表达外源基因的策略在酵母中高效表达外源基因的策略u 提高外源基因的转录水平提高外源基因的转录水平 在构建表达载体时在构建表达载体时组入强启动子组入强启动子，如：酵母磷酸甘，如：酵母磷酸甘油酯激酶基因启动子、甘油醛磷酸脱氢酶基因启动子，油酯激酶基因启动子、甘油醛磷酸脱氢酶基因启动子，可提高外源基因的转录水平。可提高外源基因的转录水平。但外源基因表达的产物但外源基因表达的产物量过高也会对细胞形成伤害量过高也会对细胞形成伤害。u 选择合适的受体细胞系统选择合适的受体细胞系统 根据表达载体特性，选择合适的酵母受体系统。根据表达载体特性，选择合适的酵母受体系统。第一节第一节 基因表达机制基因表达机制1.1 基因表达机制概述；基因表达机制概述； 1.2 外源基因的起始转录外源基因的起始转录1.3 mRNA延伸和稳定性；延伸和稳定性；1.4 mRNA的加工的加工1.5 mRNA的翻译；的翻译； 1.6 表达蛋白的稳定性表达蛋白的稳定性1.7 基因沉默基因沉默第二节第二节 基因表达的调控元件基因表达的调控元件2.1 2.1 启动子启动子2.2 2.2 增强子增强子2.3 2.3 终止子终止子2.4 2.4 衰减子衰减子第三节第三节 外源基因表达系统外源基因表达系统3.1 3.1 定义定义3.2 3.2 种类种类3.3 3.3 原核生物与真核生物间基因表达的差别原核生物与真核生物间基因表达的差别3.4 3.4 原核生物作为基因表达系统的特点原核生物作为基因表达系统的特点第四节第四节 大肠杆菌基因表达系统大肠杆菌基因表达系统4.1 4.1 大肠杆菌表达系统优越性大肠杆菌表达系统优越性 4.2 4.2 大肠杆菌基因表达载体大肠杆菌基因表达载体4.3 4.3 宿主菌宿主菌4.4 4.4 外源基因在大肠杆菌表达的形式外源基因在大肠杆菌表达的形式4.5 4.5 在大肠杆菌中高效表达目的基因的策略在大肠杆菌中高效表达目的基因的策略4.6 4.6 大肠杆菌中重组蛋白的分离纯化大肠杆菌中重组蛋白的分离纯化第五节第五节 芽孢杆菌表达系统芽孢杆菌表达系统5.1 5.1 芽孢杆菌表达载体芽孢杆菌表达载体5.2 5.2 宿主菌宿主菌5.3 5.3 外源基因在芽孢杆菌中的分泌表达外源基因在芽孢杆菌中的分泌表达5.4 5.4 在芽孢杆菌中高效表达外源基因的策略在芽孢杆菌中高效表达外源基因的策略第六节第六节 酵母表达系统酵母表达系统 6.1 6.1 酵母表达系统的优点酵母表达系统的优点6.2 6.2 酵母表达载体酵母表达载体6.3 6.3 宿主菌宿主菌6.4 6.4 在酵母中高效表达外源基因的策略在酵母中高效表达外源基因的策略课程全部结束！课程全部结束！很高兴我们能一起学习进步！很高兴我们能一起学习进步！