铁磁流体联合交变磁场对人肝癌细胞HepG2的影响

铁磁流体联合交变磁场对人肝癌细胞HepG2的影响第17卷第9期2007年5月中国现代医学杂志ChinaJournalofModemMedicineV01.17No.9May20O7文章编号:10058982(2007)09-1041-05铁磁流体联合交变磁场对人肝癌细胞HepG2的影响贺莲香,张阳德,何剪太,李年丰(中南大学卫生部肝胆肠外科研究中心,湖南长沙410008)?论着?摘要:目的探讨一定的交变磁场不同浓度Fe磁流体热疗对人肝癌细胞HepG2的影响.方法在肝细胞的培养液中分别加入不同浓度的Fe磁流体,暴露在交变磁场中30min后,采用MTT法,细胞计数,光镜,荧光显微镜,流式细胞仪等观察经过上述药物处理后,肝癌细胞活细胞数的光密度值,杀伤率,生长曲线,细胞形态变化,细胞周期及凋亡情况.结果随着磁流体中Fe304纳米粒浓度的增加,细胞培养液的温度分别上升到38.947.2C;Fe304浓度4.5mg/mL时,温度>41;细胞增殖抑制增强,肝癌细胞活细胞数的光密度值下降,杀伤率(cytotoxityindex,CI)增加;当Fe304浓度>/4.5mg/mL时,CI/>50%,CI最高达85.91%,呈明显的量效关系(P<0.001);细胞核染色质凝聚,浓缩,有的成半月形或梅花辩状改变,尤以Fe3o4浓度>14.5mg/mL时变化明显;细胞周期停滞于s期,s期细胞增加,凋亡率增加;Fe30浓度从4.5mg/mL增加到6.0mg/mL时,凋亡率分别由27.06%增加到66.05%;Fe304浓度为3.0mg/mL时,温度为39.8<40qC,凋亡率为14.22%(P<0.001).结论交变磁场作用下,随Fe30浓度增加,温度升高,磁流体对人肝癌细胞HepG2毒性增强,细胞凋亡增加;磁流体中Fe3o浓度与其成明显的量效依赖关系.关键词:磁流体;交变磁场;肝癌细胞中图分类号:R.735.7文献标识码:AEffectsofferromagneticfluidhyperthermiainducedbyanalternativemagneticfieldonhepatomacellHepG2invitroHELianxiang,ZHANGYangde,HEJiantai,LINianfeng(NationalHepatobiliaryandEntericSurgeryResearchCenter,XiangyaHospital,CentralSouthUniversity,Changsha,Hunan410008,P.R.China)Abstract:【Objective】Tostudyeffectsofnano-ferroferrieoxidemagneticfluidwitIlvaryingconcentrationhy-perthermiainducedbyanalternatingmagneticfieldonhepatomacellHepG2invitro.【Methods】AhumanhepatomacellHepG2wasculturedwithvirouseoneertrationofferroferricoxide(Fe304,68rim)magneticfluid(1.5-7.5)mCmLandexposedtoanalternativemagneticfield(AMwith100kHzand15kA/mfor30min,meanwhiletell卜peraturesweremeasuredbyopticalfibertransducerthermometer.Theopticdensity(OD)ofviablecell,eytotoxityindex,growthcurveofcells,morphologiechangesofcell,cellcycleandaposptosiswereassayedbyMTrmethod,cellcount,lightandfluorescencemicroscopeandflowcytometry.【ResultWiththeincreaseofconcentrationofF白o4,tIlefollowingoutcomesoccurred,including:thetemperatureoftIleculturemediumWas38.97.2C;above41ccWasgotwiththeeoneenationofFe3044.5mgCmL;theproliferationofHepG2cellwasincreasinglyinhitibit-ed,theODvalueofviablecelldecreasedandeytotoxityindex(CI)increased;CIexceeded50%withtheconcentra-tionof45mgCmlFe304;theeffectWaseoneenationdependentfP<0.oo1).tlleapoptotieHepG2cellwereob-servedtohavecellshrinkage,ehromatincondensation,margination,unclearfragmentation,apoptotiebodies,andintactcellmembrane.Thetypicalcytomorpho-logicalfeaturesofapoptosisWasmoreobviouswhentheconcentrationofFe304exceeded4.5mggm1.thecycleofHepG2cellWasinhibitededinthestageS,thepercentageofcellsinthe收稿日期:2007-0123?1041?中国现代医学杂志第l7卷stageSincrease;theratioofapeptosisofHepG2cellincreasedanditwasupto27.0666.o5%withtheconcentratonofFe304rangingfrom4.5mCmLto6.0mg/mI;theapeptosisrate14.2%withthe3.0ms/lFe304(P<0.oo1).【Conclusion】FerromagneticfluidhyperthermiainducedbyAMFcouldinhibittheproliferationandpromoteapoptosisofhumanhepatomaHepG2cellsinaconcentration-dependentmanner.Keywords:ferromagneticfluid;ahemativemagneticfield;hepatomacell研究证明肿瘤细胞对热高度敏感,4146的温度可以有效杀伤肿瘤细胞,使肿瘤细胞内许多结构和酶蛋白发生改变,影响肿瘤细胞的生长和分化,导致细胞凋亡或直接死亡【.纳米磁性微球不仅能作为药物载体,而且在交变磁场作用下通过磁滞或驰豫等原理,吸收电磁波能量转换为热能发热升温,可实现肿瘤细胞水平的热疗.因此,肿瘤磁靶向热疗成为继肿瘤化疗,放疗之后,被称之为最有发展前景的肿瘤绿色治疗.JORDAN等采用纳米技术和热疗相结合的新疗法一磁流体热疗(MFH)治疗肿瘤取得了重要进展,既具有固体磁性材料的磁性和液体流动特征的磁流体被广泛用于肿瘤靶向热疗的研究回.本研究将探讨不同浓度的Fe30磁流体在交变磁场作用下,在体外对肝癌细胞的影响,为磁流体热化疗选择合适浓度的铁磁微粒载体提供依据.1材料与方法1.1主要材料1.1.1主要试剂.MTr(四唑氮盐),DMSO(二甲亚砜),胰蛋白酶,细胞培养基粉(RPMI1640)由Gibco公司提供.1.1.2细胞株人肝癌细胞株HepG2,由中南大学湘雅医学院肿瘤研究所惠赠.用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液,分别加入最终浓度为100u/mL的青霉素和链霉素,37.O,5%的CO的培养箱内常规传代培养.1.1.3主要仪器设备交变磁场装置由南京启亚微波有限公司惠赠.仪器由高频感应加热设备改装而成,频率为100kHz,功率25kW,磁感应强度15kA/m,感应线圈,由15匝直径为4ITI1TI的铜管平行绕成内径为11cm,长为12cm的线圈,铜管内通循环水.1.2试验方法1.2.1细胞计数法观察各组人肝癌细胞的生长曲线将1105/mL的细胞悬液0.9mL接种于T_25培养瓶中,按分组A,B,C,D,E和F顺序加入含有不同浓度的Fe0纳米粒(粒径为6O70nm)的培养液,使终浓度分别为O,1.5,3.O,4.5,6.0和7.5mg/mL,每瓶3mL,每个时间点设置3各复瓶,交变磁场中作用30min后0,6,12,24,48和72h取细胞,胰酶消化制成单细胞悬液于倒置显微镜下用红血球计数台采用盲法计数,重复3次,取均值.以横坐标为时间,纵坐标为细胞计数,绘制时间生长曲线,见附图.1.2.2MTT法观察肝癌活细胞的光密度值及杀伤率取对数生长的人肝癌细胞HepG2,将细胞凋成1105/mL的浓度,设置对照组(A组)和药物处理组,药物处理组按B,C,D,E和F顺序加入含Fe30磁性纳米粒的RPMI1640培养液,每瓶3mL,使各组终浓度分别为1.5,3.0,4.5,6.0和7.5mg/mL,以没有加药的RPMI1640培养液作为对照组,没有细胞的培养液作为空白组,磁场中作用30min.已处理过的人肝癌细胞HepG2,接种于96孔培养板中,每孔100L(1104个细胞/孔),设5个复孔,常规培养72h后,加入含5mg/mL新配制的Mr=盯的PBS溶液2OL,培养6h后去上清,加二甲基亚砜(DMSO)150L,室温下微孔板震荡器上震荡5min,立即用酶标仪于490nm处测量吸光密度(OD值),取均值,计算细胞生长抑制率(杀伤率)=(1一OD处理,OD对照)100%.1.2.3Hoechst荧光染色观察细胞形态取洁净盖玻片于70%乙醇中浸泡30min,洗净后置于6孔培养板内,接种细胞24h后,使为50.0%一60.0%满.按分组顺序加入含Fe30磁性纳米粒的培养液,每孔3mL,使终浓度分别为O,1.5,3.O,4.5,6.0和,7.5mg/mL,磁场作用30min;培养24h后,吸净培养液,每孔加入O.5mL4%的多聚甲醛4固定12h以上.去固定液,用生理盐水洗涤2遍,每次3min,吸净液体.每孔加入O.5mLHoechst33258染色液,手动晃动数次后,避光染色10min.滴1滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上,盖上贴有细胞的盖玻片,荧光显微镜下观察到蓝色的细胞核,见图2.1.2.4流式细胞仪检测各组肝癌细胞的细胞周期及凋亡率将细胞接种于T一25培养瓶内过夜后,用DHankS溶液洗涤3次,换不含血清的培养液,24h后,绝大多数细胞处于GJG.期,达到同步周期化.然?1042?第9期贺莲香,等:铁磁流体联合交变磁场对人肝癌细胞HepG2的影响后加入含Fe30.磁性纳米粒的培养液,终浓度分别为0,1.5,3.0,4.5,6.0和7.5mg/mL,每瓶3mL,每组均为3瓶,磁场作用30min后,培养24h后,用DHankS溶液洗涤2遍,0.25%胰酶脱壁,加入RPMI16401mL制成单细胞悬液,移入1.5mL离心管,离心(900r/min)5min,弃上清,加入4.0C的75%乙醇后置4.0冰箱中过夜,固定至少18h以上.调整细胞浓度为10细胞/毫升,取1毫升细胞悬液,用PBS洗3次,用RNaseA(终浓度为20IJ-g/mL)消化RNA,细胞重悬于1mLPI染液(终浓度为5Olu,g/mL)中,37.0孵育30min,上流式细胞仪测试,测定数据用MCYCLE分析软件计算各细胞周期百分率及凋亡率.2结果2.1各组温度的变化随着磁流体中Fe30.浓度的增加,升温的速度增快,峰值温度提高,达到温度峰值的时间明显缩短,见表1.2.2人肝癌细胞HepG2的生长曲线随着时间的延长,磁流体中Fe30.浓度的增加,肝癌细胞均有不同程度的增加,但抑制增强,细胞数增加的幅度变小.不同浓度,相同时间,细胞培养6h后,各浓度组无差异,12h,有差异(P<0.01)24h及以后,有显着差异(P<0.001);组间比较,24h,与对照组,有差异(P<0.05),48h,有差异显着.附图可见,Fe30浓度I>6mg/mL,细胞生长曲线变得低平.表1各组平均峰值温度的比较温度Fe30,VlF的浓度(mg/mL)O1.53.04.56.07.5T2638.50.439.8O.741.44-0.742.3O.845.64-0.6注:各组间比较,采用方差分析,F值:456.422,P=0.000;两两比较,P<0.0012.3各组人肝癌细胞HepG2的光密度值及杀伤率随着Fe30.磁性纳米粒浓度的增加,OD值变小,CI值增大,即活细胞数下降,杀伤率增加,呈明显的量效关系,见表2.表2各组人肝癌细胞HepG2的光密度值(OD.s)和杀伤率(CI.%)对照组1.53.04.56.07.50D0.924-O.O10.804-0.020.724-0.020.474-0.030384-0.010134-0.03CI13n52I421.754-4734931223694-1.0185191296注:不同浓度的Fe304磁性纳米粒杀伤率方差分析,各组问比较,F值为458.371,P<0.001;两两比较,P<0.0018量X一<_硇翟再0h6h12h24h48h72h时间附图人肝癌细胞HepG2生长曲线比较2.4Hoechst荧光染色后人肝癌细胞HepG2荧光显微镜下的形态改变随着Fe30.浓度的增加,HepG2细胞形态改变更明显,细胞变圆,细胞稀疏,细胞核呈梅花瓣改变,有的浓缩边集,或聚集成半月形,可见凋亡小体.2.5流式细胞仪检测人肝癌细胞HepG2的细胞周期及凋亡率随着Fe30.浓度的增加,人肝癌细胞HepG2细胞周期呈现出G期细胞明显减少,G2期和S期细胞逐渐增加的趋势,凋亡率明显增加;浓度为0,1.5,3.0,4.5,6.0,7.5mg/mL时,S期细胞分别为25.10,27.00,29.25,32.72,35.63和39.17%(F值:79.203,P<0.001,凋亡率分别为2.41,6.30,14.22,27.06和66.05(F值:477.644,P<0.001)差异有显着性.3讨论体外培养的细胞或离体的组织加入或注入磁粒,在交变磁场作用下,温度升高到41.0C以上,可明显抑制肿瘤细胞的生长,诱导细胞凋亡【一,使细胞裂解问;1999年JORDANt2J等将人结肠腺癌细胞与磁粒混合培养,磁场下,温度超过43.0C,可抑制肿瘤细胞生长;43.045.0时,细胞的生存曲线显示磁热疗效果比水浴热疗强3倍.本试验发现在频率为100kHz,磁场强度为15kMm的交变磁场作用下,磁性纳米粒Fe30浓度从1.57.5mg/mL时,细胞培养液的温度分别从26上升到38.545.6C;细胞增殖抑制与磁性微粒Fe30.浓度,温度存在明显量效关系.Fe30浓度4.5mg/mL,温度为41.4时,HepG2细胞的杀伤率约I>50.0o%,最高杀伤率达85.91%.此结果与以前的研究一致.INGRID田认为温度的增加与铁的含量呈正比;SHINKAL昀等体外试验结果表明,同1种磁粒在一定的浓度范围内,升温速度与磁粒的浓度有关,磁粒的浓度越高,温度升高得越快,峰值温度越?1043?哪潍l=一中国现代医学杂志第17卷高;YANASEr究证明,用不同浓度的磁性阳离子纳米脂质体(MCL)与脑胶质细胞瘤细胞一起培养,在交变磁场作用下,随着MCL浓度的增加(2.5lO.O)m咖L,温度随之升高(4O.O44.8cI=),活细胞随之减少,单独用磁场不加MCL,作用60min后,活细胞无改变.因此,在磁靶向肿瘤热疗中,可以根据治疗的需要,通过调节靶区的磁材用量,来调节温度,使肿瘤组织温度控制在癌细胞敏感的41.O46.OcI=,有效地消灭肿瘤细胞.细胞凋亡(apoptosis)是1种由基因控制的细胞自主死亡方式,与细胞死亡的区别在于,凋亡是1个主动的耗能的细胞死亡机制81.细胞在受到外界不利因素影响时,细胞的生理代谢与调节过程发生变化,结果有可能出现形态改变和DNA断裂.细胞凋亡的形态学特征表现为细胞变园,皱缩,核染色质凝聚浓染,核仁消失,核裂解,胞浆浓缩,胞膜出泡,凋亡小体形成191.通常采用普通光镜,透射电镜,荧光显微镜对细胞凋亡进行形态学观察.加入荧光染料Hoechst33258以后,凋亡细胞由于膜通透性的改变,可摄取Hoechst染料,后者与DNA结合,在紫外线下呈蓝色荧光;而正常细胞可摄取少量Hoechst荧光染料,坏死细胞侧不能摄取,故在荧光显微镜下,可观察到正常细胞的细胞核呈弥散均匀荧光,而凋亡细胞细胞核内可见浓染致密的颗粒块状荧光.本研究试验组观察发现,随着磁流体中Fe,O浓度增加,Hoechst33258染色,荧光显微镜下可见,细胞核染色质凝聚,浓缩,有的成半月形,可见细胞核碎裂成梅花瓣状.HepG2细胞凋亡率与磁流体浓度,温度呈明显的量效依赖关系.随F%O浓度从4.5mg/mL增加到6.0mg/mL时,培养基温度由41.4cI=增加到42.3cI=,凋亡率分别由27.06%增加到66.05%.F%O浓度为3.0mg/mL时,温度为39.8cI=,<40.OcI=,凋亡率为14.20%.此结果与以往的研究一致.张红新等t3研究报道:单纯热疗,温度低于41.OcI=,对VX一2瘤株细胞毒性作用较弱,几乎与37.0C没有区别,温度高于43.OcI=,有较强的毒性作用;SMMC7721细胞经FeO磁流体热疗作用后,随着Fe,O浓度的增加,细胞增殖受到明显抑制,最大抑制率达81.2l%;细胞凋亡率明显增加,最大凋亡率达69.33%ttal.细胞周期可分为问期和M期(分裂期).问期由Gl期,S期,G2期组成【.本研究发现随着磁流体中Fe,O粒子浓度的增加,G期细胞所占比例下降,而G2期和S期细胞增加.这与YUGUCHItt61,何跃明等【t7】的发现一致,Fe,O4磁流体热疗能引起细胞周期S期,G2/M期的细胞增加,细胞周期阻滞于S期.磁流体诱导细胞凋亡的机制不很清楚.有研究证明与肿瘤细胞内吞的铁磁微粒,在交变磁场作用下可引起细胞内发热有关;可是,2002年,RABINt8通过传热学模拟试验,证明摄取了大量纳米磁性粒子的单一细胞不足以达到热疗的温度,除非吞噬了大量的纳米磁性粒子的细胞聚集在一起,形成直径大于1mm的细胞群,才能达到细胞内磁热疗所需要的高于41.OcI=的有效温度,而且这个细胞群的直径随着热疗需要达到的温度的提高而增大.因此,有人对细胞内热疗的观点提出质疑,究竟是细胞内的热疗还是细胞外的热疗,或者二者的结合共同作用,导致温度的升高及细胞凋亡,还有待进一步研究.但是,研究证明高热对细胞具有杀伤作用.高热改变生物膜的流动性,导致细胞浆破坏;改变细胞膜的通透性,提高细胞质中药物浓度;高热能抑制细胞DNA,RNA,蛋白质的合成与修复;抑制细胞有丝分裂,使S期细胞增加,而S期细胞对高热最敏感【?20.因此,单纯的铁磁流体热疗,达到一定浓度和温度后,亦可导致细胞凋亡或死亡.4结论在交变磁场作用下,磁流体对体外人肝癌细胞HepG2的毒性作用,随着磁流体中Fe,O浓度增加,温度的升高,细胞杀伤率,凋亡率增加,细胞周期停滞于S期,使S期的细胞增加;磁流体中Fe,O浓度与温度,细胞毒性作用成明显的量效依赖关系.但是,热必须达到一定温度才对细胞有杀伤作用,低于41.0cI=,热疗效果较弱,高于43.0C,有较强的细胞毒性作用.参考文献:【1】LAISX,XIAOXS,HW,eta1.ExperimentalstudyofinductiveapoptosisofHep一6inlivertumorceilslinebymagneticnanoparticleencapsulatedepirubicinJ.ChineseJournalofCliniealrehabilitation,2003,7(2o】:2812-2813.2JORDANANDREAS,SCHOLZREGINA,WUSTPETEReta1.Endocytosisofdexanandsilan-coatedmagnetitenanoparticlesandtheeffectofintracenularhyperthermiaonhumanmammarycalclnolllacellsinvitro叨.JournalofMagnetismAndMagnetic?1044?第9期贺莲香,等:铁磁流体联合交变磁场对人肝癌细胞HepG2的影响Materials,1999,194:185-196.【3】YANGSY,ZHANGDS,ZHENGJeta1.Studyonthethera-peutieeffectofFe203nanopartielemagneticfluidhyperthermiaonlivercancer叨.ChinJExpSurg,2004,21(12):14431446.Chinese41GUEDESMHA,ofACmagneticnanopartlelesonSADEGHIANIN,PEIXOTODLG,eta1.Effectsfieldandmagnetitemiceperitonealcells叨.JMagnMagnMater,2oo5.293(1):283-286.【5】INGRIDH,ROBERH,RUDOLFH,eta1.Thermalablationofturnoutusingmagneticnanopartieles:Aninvivofeasibilitystudy叨.InvestigativeRadilogy,2002,37(10):580-586.6】MASASHIGESHINKAI,MASATAKASUZUKI,eta1.Intracellularhyperthermiaforcancerusingmagnetitecationiclipesemes叨.JournalofMagnetismandMagneticMaterials,1999,194:176184.7】YANASEM,SHINKAIM,HONDAH,eta1.Intracalhlarhyperthermiafor811eerusingmagneticcationicliposomes:invitrostudyL刀.JpanJCancerRes,1996,7(11):119-1183.【8】SITUZQ.wuJZ.ClutureOfCellM.Xiall:WorldBookPublishingCompany,2004:276.Chinese9】KROEMERG.DALLAPORTAB,RESCHEfUGONM,eta1.Themitechondrialdeath/liferegulatorinapoptosisandnecrosis叨.AnnuRevPhvsi0】,1998,60:619.【101JIANGB,ZHANGYLZHOUDY.CommonExperimentationmethodsofMolecularBiologyM】.Beijhag:PeopleHyenePub-lishingCompany,1996:170-183.Chinese【11】ADJEIPN,eta1.SelectiveinductionofapoptosisinHep3GcellbytopoisomeraseIinhibitors:evidenceforaproteasede-pendentpathwaythatdoesnotactivatecyseineproteaseP32叨.JClinInves1996.98:2588.【12】HASEGSWAJeta1.Inv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