IRF9下调SIRT1在急性胰腺炎发生发展中的作用及机制研究

IRF9下调SIRT1在急性胰腺炎发生发展中的作用及机制研究1. 引言急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是由胰腺的急性炎症所引发的一种疾病。该病在临床上常见，国内外均报道具有很高的发病率和死亡率，发病过程中涉及多器官功能紊乱及细胞因子释放增加1,2。近年来AP的发病率呈升高趋势3，约20%30%的AP患者可发展为SAP。该病死亡率高达15%30%，导致局部及全身并发症，且预后不良，严重威胁到人类生命健康4,5。AP6的起源被认为是胰腺腺泡细胞，发病原因是过度激活的胞内胰蛋白酶原转化为胰蛋白酶消化胰腺组织，胰腺水肿或坏死而致胰腺炎。1896年，Chiari7发现十二指肠中的胰蛋白酶可活化为胰蛋白酶而激活其他酶，以此提出酶过早激活消化胰腺的概念。敲除胰蛋白酶原7基因的小鼠被用来研究蛋白酶原的作用，该类小鼠早期腺泡内胰蛋白酶原的激活功能病理学缺失。该类小鼠对于研究胰蛋白酶原的激活可影响胰腺损伤过程。该小鼠与雨蛙素AP小鼠相比8，细胞死亡数明显降低、腺泡坏死率降低50%。腺泡细胞的死亡与腺泡内胰蛋白酶原的活化有不可分割的作用，但该实验却缺乏腺病毒介导的活化胰蛋白酶在腺泡内表达引发小鼠的胰腺炎的机制说明。还有实验研究9显示，腺泡细胞的死亡，与腺病毒介导的活化胰蛋白酶原的表达具有重要联系，但其中的机制模糊不清。IRF(interferon regulatory factor)对病毒诱导的IFN-和IFN-基因表达具有调节作用。后来发现IRF还能调控II型和III型干扰素基因的表达。迄今为止，已经发现了9种IRF：IRF1910。在过去数十年里，有足够多的的实验证明10,11,12,13显示IRF对转录调控、免疫调控、细胞因子信号转导、自稳平衡等多方面发挥着不可替代的作用。IRF参与多种疾病的发生过程，包括炎症性肠病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、干燥症以及肿瘤发生及心血管疾病等10,11,14,15,16。IRF9是干扰素刺激基因因子3的组成部分，参与启动多个干扰素刺激基因，产生抗病毒应答作用。它在治疗疾病、病原体分离中具有十分重要的作用，但目前对于其功能机制研究，仅局限于STAT1和STAT2。对于其对转录、翻译的调控机制以及促进和减少炎症功能可作为未来研究方向。此外亦有研究证明17，c-Myc原癌基因上调了IRF9的表达，表明在肿瘤发生中有IRF9的参与作用。IRF9可在胰岛素分泌以及损伤修复中发挥重要作用，但是其在AP的发挥的作用和机制暂未见相关文献报道。SIRT1是sirtuin家族蛋白之一，是依赖于NAD+的HDAC，主要位于细胞核内。近期有文献报道在急性胰腺炎小鼠模型中，SIRT1的表达显著下调，乙酰化酶活性下降，p53及NF-B的酰化水平增加。SIRT1的敲低诱导了炎症反应及细胞死亡，加重胰腺炎病程18。近年来有文献报道IRF9能够直接下调组蛋白去乙酰化酶SIRT1的表达，抑制SIRT1的去乙酰化酶活性，增加下游靶蛋白，例如p53，NF-B等蛋白的乙酰化水平，从而参与炎症反应、细胞凋亡、增殖以及迁移等过程19,20,21,22,23,24,25。例如，在AML患者中，IRF9表达下调，SIRT1表达上调，p53乙酰化水平下降且下游靶基因的表达下调；敲低IRF9能够上调SIRT1的表达，促进细胞克隆、增殖形成；过表达IRF9则有着相反的结果。IRF9是SIRT1的一个负调节因子，能够靶向下调SIRT1的表达，增加p53的乙酰化水平，促进p53靶基因的表达，阻制细胞生长，诱导细胞凋亡，阻止AML的进一步发展25。因此IRF9靶向下调SIRT1参与了细胞死亡、繁殖、迁移以及炎症反应等过程，调节着多种疾病的发生发展过程。在急性胰腺炎中，IRF9是否通过下调SIRT1的表达来调节细胞凋亡、增殖和迁移等过程，进一步影响细胞内炎症反应，国内外未见相关报道。本实验内容在于探究IRF9基因在AP中所起的效用，研究可能存在的分子机制。故本实验将大鼠AR42J胰腺腺泡细胞系作为研究对象,选用雨蛙素诱导AR42J胰腺腺泡细胞，结合qRT-PCR、Western Blot、流式细胞术、MTT法、Transwell等手段，敲低IRF9后检测SIRT1、p53及乙酰化P53水平，检测细胞凋亡、增殖及迁移等情况，进一步探讨IRF9靶向下调SIRT1在AP的发生发展中的分子机制，通过对靶基因功能的理解,对疾病诊断和治疗提供理论指导。2. 材料与方法2.1. 材料2.1.1.主要仪器与试剂主要仪器及试剂生产公司AR42J大鼠胰腺腺泡细胞系上海富衡细胞库IRF9抗体proteintechSIRT1抗体 AbcamP53抗体、Ace-P53prproteintechRIPA裂解液谷歌生物山羊抗小鼠及山羊抗兔Ig G谷歌生物一抗、一抗稀释液谷歌生物胰酶谷歌生物PCR试剂盒宝日医生物si-RNA（IRF9沉默）上海生工PVDF膜MilliporeTRIzolAmbion逆转录试剂盒宝日医生物雨蛙肽北京索莱宝BCA蛋白浓度测定试剂盒碧云天SDS-PAGE凝胶配置试剂盒碧云天蛋白上样缓冲液碧云天培养基HyCloneOpti-MEM(x1）、Lipofectamine 2000Life TechnologyELISA试剂盒武汉基因美生物DMSO、MTT检测试剂盒塞维尔流式细胞凋亡试剂盒试剂盒上海七海复泰生物上海七海复泰生物离心机、移液器EppendorfCytoFLEX流式细胞仪BECKMAN 恒温培养箱SHELLAB显微镜上海精密科学仪器公司酶标仪上海仪器公司恒温金属浴天力医疗器械PCR扩增仪ABIWestern Blot电泳仪上海天能2.2. 方法2.2.1. 细胞培养:培养基（DMEM培养基100：胎牛血清10：青链霉素1），培养箱环境为37、5%CO2，2天更换培养基一次。1） 验收：在超净台中严格无菌操作，静置2h，而后镜下观察，以80%汇合度为界限，未达到80%需要去除旧培养基添加新鲜培养基再次培养。2） 复苏：取出冻存的细胞，迅速于37水浴锅中摇晃解冻，超净台中移入离心管并加入5ml培养基，以1000r/min离心5min，于超净台中倒出上清液，而后添加6ml新培养基，轻轻吹打制造细胞悬液，而后移入培养瓶，放入培养箱中培养24h，视细胞状态，考虑传代。3）传代：按如下步骤进行传代：4）冻存：收集状态良好的细胞（细胞汇合度达到80%），离心除去旧培养基，用含10%DMSO的血清使细胞重悬，同时转存冻存管中病加入细胞冻存液（含异丙醇），在-80稳定冻存，或移入液氮罐冻存。2.2.2.细胞模型的构建及效果评价:细胞模型构建：取对数生长期的AR42J细胞接种于6孔板中，待其细胞密度达到60%-80%时，分为空白对照组和实验组，每组设置3个复孔，空白对照组加入正常培养基，实验组加入含100nmol/L雨蛙素培养基,分别培养0、2、6、12、24、48小时。模型效果评价：分别提取不同时间段后的蛋白,用Western Blot法检测各组TNF-蛋白的表达。另收集不同时间段的细胞上清用ELISA法检测炎症因子水平。蛋白提取步棸及Western Blot法下文会详细叙述，在此详细介绍ELISA实验方法。ELISA法检测AMY、TNF-、IL-1浓度：1） 准备试剂以及微孔板；2） 使用1x洗液洗板，洗液在微孔板中持续浸泡30s；而后倒出洗液，而后立即使用微孔板；3） 标准品2倍稀释，设置复孔空白孔并加入100l稀释标准品；4） 使用移液枪将20l样本加入样本孔并加入80l 1x检测缓冲液；5）抗体稀释，每孔中加入50l稀释抗体；6）封板振荡（300 r/min），室温孵育2h；7）倒出液体，再次洗板，重复6次；8）加入100l稀释链霉亲和素至每个孔；9）所有操作流程过后，封板震荡，而后静置45min；10) 再次洗板6次；11) 加入100l显色底物，并避光，室温下静置30min；12) 加入100l终止液，孔中颜色需由蓝变黄。13）检测OD值：30分钟内检测450nm以及570nmOD值；校准OD值=OD450-OD570。14）计算出数值。横坐标：标准品浓度，纵坐标：校准OD值，使用EXCEL软件制作标准曲线以及计算回归方程，而后将校准OD值代入计算样本浓度。2.2.3.IRF9-siRNA转染AR42J细胞：沉默IRF9：使用Lipo2000 TM转染IRF9沉默的si-RNA，空载作阴性对照。按如下步骤进行转染：1） 胰酶消化；2） 消化后将细胞均匀接种到6孔板中（密度一致）；3） 加入2ml不含双抗的培养液到6孔板中；4） 待细胞贴壁后，弃培养液，PBS洗2次；5） 避光向6孔板中加入1500ul Opti-MEM(x1）；6） 设置分组，分为六组，上面3个孔分别为不用雨蛙素诱导的：正常的胰腺AR42J细胞为空白对照组,N-siRNA转染的胰腺AR42J细胞为阴性对照组，siIRF9转染的胰腺AR42J细胞为实验组，下面3个孔分别为雨蛙素诱导的：急性胰腺AR42J细胞，N-siRNA转染的胰腺AR42J细胞为阴性对照组，siIRF9转染的胰腺AR42J细胞为实验组。7） 分别将每组孔的药加好：取6个无酶EP管，先加无雨蛙素诱导组的3个孔：空白对照组：每孔加入250l Opti-MEM，其中一管中加5l Lipofectamine2000，另一管不加。阴性实验组：一管加5l liop2000，另一管加5l N-siRNA 。阳性实验组：其中一管加5l Lipofectamine2000，另一管加5l siIRF9充分混匀。有雨蛙素诱导组的3个孔：空白对照组、阴性实验组和阳性实验组三个孔加药方法同无雨蛙素诱导的三个孔加药方法一致；8） 加药后避光静置5min，药物混匀再避光静置20min；9） 分别将这6组药加入分组为无雨蛙素诱导和有雨蛙素诱导的空白组、阴性实验组以及阳性实验组的板孔中；10） 加药结束后，放入37，5%CO2细胞培养箱中培养6h，11） 培养结束后使用PBS洗2次，再换上2ml细胞培养基(DMEM+10%胎牛血清用于AR42J细胞)，培养24h。此种siIRF9转染AR42J细胞实验重复无三次。注意事项：1）适当进行细胞传代，以提高转染效率、稳定性并减少毒性，所有细胞传代次数需要一致；2）为防止局部复合物浓度过高乃至高细胞毒性，不可使用其他试剂稀释核酸或转染试剂，直接将核酸及转染试剂混匀。复合物以及培养基混匀后，静置六孔板；3）使用无双抗的opti培养基混合复合物，37恒温培养6h拍照，而后更换普通培养基。若首次转染效率不佳，可在转染24h后再次添加复合物转染，提升转染率。2.2.4.qRT-PCR检测IRF9-siRNA对胰腺AR42J细胞中IRF9mRNA、SIRT1mRNA相对表达量的影响：细胞成功转染24h后，进一步提取RNA,检测IRF9mRNA、SIRT1mRNA的表达。步棸如下：提取总RNA：1） 超净台操作，使用移液器吸出六孔板中培养基，1ml PBS冲洗2次，而后吸净残留，加入1ml TRIzol试剂，置于摇床上慢摇10min，需低温放置，促使其充分裂解。2） 使用移液枪将六孔板中混合试剂转移至1.5ml 无酶EP管中，再加入TRIzol试剂体积的五分之一即200l氯仿，加入完成后，上下摇晃15次，使其充分混匀。而后置于冰上静置5min，待分层完全后放置于离心机（4，13200r/min）离心15min。3） 使用移液枪小心转移200l上层水相至另一个1.5ml 无酶EP管中，同时加入等体积异丙醇，15次上下振荡，充分混匀后于-20冰箱中静置30min，然后取出，于低温离心机（4，13200r/min）离心15min。4） 弃上清，使用提前配好的75%乙醇1ml将所得RNA沉淀物洗涤，于低温离心机（4，13200r/min）离心5min，而后弃上清，并将吸水滤纸剪成长条状，伸入EP管中吸出可见的液体。5） 将EP管静置30min，需倒置放于吸水滤纸上，干燥至一定程度（切忌不能完全干燥）后将20l DEPC水加入其中，充分振荡混匀，保存于-80冰箱，处理后的样本可于-80冰箱中长期保存。逆转录步骤：1） 从-80冰箱取出已经经过处理的样本总RNA，使用定量PCR检测仪对总RNA实施定量检测。2） 取200l无酶EP管一只，依靠定量检测而后计算RNA溶液所需量，同时加DEPC水，总容量需至8l，而后将2ul Takara逆转录试剂盒中的Mix试剂加入其中，总体系容量需要达到10l，而后将100ul DEPC水加入其中，并将混合物充分振荡混匀。3） 将混合所有试剂的EP管放置于逆转录使用仪器中，启动逆转录程序，逆转录程序条件如下：37预热16min，90解链5秒钟，5退火12min。所有逆转录程序结束后，将逆转录所得cDNA放置于-80冰箱中保存。qRT-PCR步骤：1） 引物配制：实验中所需要使用到的引物其序列如下图所示。将装有引物粉末的EP管放置于离心机（3000r/min）离心1min，尽量使其不沾壁，而后取出后轻轻开启EP管管盖，根据引物说明书，将适量DEPC水加入到EP管中进行稀释，而后盖上瓶盖，放置于振荡仪上振荡，使其充分混匀。再另取一200l无酶EP管，将190ul DEPC水加入其中，并使用移液枪吸取出5l正义引物及5l反义引物加到无酶EP管中，标记并且放置在振荡仪上，充分混匀后将其置于-20冰箱中保存。mRNA引物序列IRF9正义引物：CTGCTCACCTTCATCTACAACG反义引物：ACTAGGATGCCCCTCTCAAGAPDH正义引物：TTGGTATCGTGGAAGGACTCA反义引物：TGTCATATTTGGCAGGTTT2） 取出逆转录后得到的合格的cDNA样品，在超净台中严格无菌操作，取无酶100l八联排管，按表中反应体系制作反应试剂，而后将准备好的10l体系全部置于八联排管中，使用迷你离心机使其振荡充分混匀，而后将把脸排管置于荧光定量PCR仪中进行PCR反应，反应设置的条件为：95 加热10min，95变性 15s，60 退火30s，此程序循环次数为45次。反应体系如下：体系体积2 x SYBR Green mixture5.2lcDNA1.6l引物3.2lTotal10l3） 整个PCR反应流程约需要2小时，待反应结束后，可依靠仪器获取目的基因的CT值，使用2-Ct法可计算出目的基因相对表达值，计算出表达值后，使用电脑软件绘制柱状图。注意事项：1） 避免反复冻融所提取的RNA、cDNA以及逆转录试剂，可避免RNA的降解以及降低酶的活性。2） 使用前将逆转录试剂及相关PCR反应试剂上下颠倒以充分混匀其中各种试剂成分，可避免反应体系的总体积与实际不符，确保定量结果的准确性。此外，使用过程中吹打力度需要轻缓，若试剂产生泡沫，需要再次放于离心机中离心至无泡才可使用试剂。3）PCR试剂盒中含有荧光染料SYBR Green I，此物质遇光易挥发，故配制混合体系时应避光操作。4）空气中微量DNA气溶胶可能会导致灵敏度高的实验试剂受到污染，从而导致实验结果出现偏差甚至错误，为避免这种实验试剂受到污染，应在超净台中配制相应反应体系，严格按照无菌操作流程操作。另外，使用的相关器材需要保证无菌无霉。2.2.5.Western Blot法检测IRF9-siRNA对胰腺AR42J细胞中IRF9、SIRT1、P53、乙酰化P53蛋白表达的影响：Western Blot法分别检测无雨蛙素诱导的和有雨蛙素诱导的空白对照组、N-siRNA组、siIRF9转染24h后的胰腺AR42J细胞中的IRF9、SIRT1、P53、乙酰化P53蛋白的表达情况。细胞蛋白提取：将胰腺AR42J细胞消化后，以相同的数量接种到6孔板中，待细胞贴壁，弃培养液，PBS洗2次，加入培养基至空白对照组(DMEM配的培养基用于AR42J细胞)，阴性实验组加入N-siRNA，阳性实验组加入沉默siIRF9处理4h-6h后用PBS洗2次，再换上细胞培养基：(DMEM+10%胎牛血清用于AR42J细胞)，每孔加2ml，培养24h。PBS清洗细胞，在培养板中加入蛋白裂解液裂解细胞，上离心机进行离心13200r/min，4,20min，上清液就是所要的蛋白液；提取的蛋白液要用BCA试剂盒检测蛋白浓度后再分装保存。根据测定的不同的蛋白浓度，加入5load-ingbuffer(比例为41)和相应体积的总蛋白样品，混匀，蛋白液要在干浴锅中煮10010min，变性后才能用，煮好的蛋白样本放在20冰箱中保存。细胞蛋白Western Blot方法：1）SDS-PAGE电泳 将已经过处理且变性的蛋白样品使用移液器转移至含有浓缩胶的孔中，而后将5l marker添加至另一个样品加样孔中。接通电泳仪电源，第一阶段电泳：将电泳仪电压设置为80V恒定电压，电泳时间设置为30分钟；第二阶段：第一阶段结束后，将电泳仪电压调整为120V恒定电压，持续电泳90分钟。第二阶段电泳持续到marker提示目的蛋白已于凝胶上分离，然后停止电泳。2）转膜 电泳结束后，自电泳仪中小心取出凝胶，使用超纯水将凝胶表面电泳液清洗干净，注意保持凝胶完成性；事先需要准备好容器，并向容器中添加足量的转膜液，而后将凝胶以及转膜夹放入容器中浸泡；使用直尺及其他切胶器具将目的蛋白以及marker的凝胶切下，使用直尺测量其大小，而后裁剪大小相当的PVDF膜覆盖在胶条上（注意：PVDF膜在使用之前需要使用甲醇溶液浸泡30s激活），而后依次将凝胶和PVDF膜放在正负极明显的转膜夹中，转膜夹需要设置6层，从阴极侧到阳极侧分别为海绵垫片、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵垫片（注意每一步都需要去除气泡），放置好后将转膜夹扣紧并转入有足量转膜液的电泳槽中，转膜过程应保持低温，故应在电泳槽周围放入足量的冰渣，维持转膜过程中的低温环境，而后接通电源并将电流设置为200mA恒流，转膜时间设置为120min。3）封闭 转膜结束后，回收转膜液，小心将转膜夹取出，而后细心取出PVDF膜，放置于容器中（注意，条带摆放不宜过于集中，最好一格一个条带），使用1 x TBST溶液将转膜液洗4次，洗涤过程中将容器放于摇床上，每次震荡5分钟。而后使用TBST溶液与脱脂奶粉混合（脱脂奶粉5g，TBST溶液100ml），两者混合后，使用震荡仪使其充分混匀，然后将处理干净的PVDF膜放置于混合物中开始封闭，室温摇晃封闭1.5h。4）抗体孵育：一抗孵育：封闭结束后，小心将PVDF膜取出，用1 x TBST溶液将转膜液洗4次，洗涤过程中将容器放于摇床上，每次震荡5分钟。洗涤结束后，将一抗IRF9、SIRT1、P53、乙酰化P53以及内参抗体-actin分别足量添加到入目的条带中，然后将其放置于摇床上，于4环境下震荡孵育24h。二抗孵育：一抗孵育结束后，小心取出PVDF膜，使用1 x TBST溶液将留滞在PVDF膜表面的一抗洗去，洗4次，洗涤过程中将容器放于摇床上，每次震荡5分钟。洗涤结束后，将稀释的二抗（使用TBST，稀释比为1:5000）足量放入条带中，然后在室温下摇晃震荡60min。5）显影 再次将条带使用1 x TBST溶液洗涤4次，期间放在摇床上快摇，5min每次，将二抗溶液洗去。按照ECL发光试剂盒使用说明书制备显影剂。而后取数个培养皿，将目的条带逐个放入培养皿中，并向培养皿中的条带滴加足量显影剂（操作过程需要避光进行），而后将滴加足量显影剂的条带放入自动凝胶成像系统中进行自动曝光，同时保留图像，使用Imaje-J处理拍摄的图像，分析目的蛋白的灰度值。注意事项：1) 显色液必须要新鲜配置使用。2) 配胶时注意操作，有致癌液体，避免溅在身上。2.2.6.流式细胞仪检测IRF9-siRNA对胰腺AR42J细胞凋亡的影响：把胰腺AR42J细胞消化，按1106接种到6孔板中，待细胞贴壁，弃培养液，PBS洗2次，分为雨蛙素诱导和无雨蛙素诱导的：空白对照组加入培养基，阴性实验组加入N-siRNA，阳性实验组加入沉默siIRF9,处理4h-6h后用PBS洗2次，再换上细胞培养基：(DMEM+10%胎牛血清用于AR42J细胞)，每孔加2ml，培养24h。用不含EDTA的胰酶消化细胞，用15ml离心管收集，上离心机，离心500g，5min，弃上清液，用1mlPBS轻轻重悬细胞并计数（细胞数量不少于105）然后500g离心5min，收集细胞。继而加入400ulBinding Buffer重悬细胞，再加入5ulAnnexin V-FITC/PI，所有操作需要轻缓，室温避光孵育染色15min。最后加入10ulPI染色，轻轻混匀冰浴避光5min。注意事项：1） 操作时注意避光，反应完毕后尽快在1小时内检测。2） 检测细胞数量需要达到1106个，但不宜过多。不足量细胞的样本流动量大，检测时会相应增加变异系数，导致实验结果出现偏差甚至错误。同时，细胞数量过多，会导致按量配制的抗体或其他试剂相对不足，影响实验结果。3） 在实验过程中，在确保实验科学性以及准确性前提下，可适当缩减实验工序。2.2.7.MTT试验取转染成功后的AR42J细胞,细胞分组同上，每组处理设三个重复，将细胞在培养箱中常规培养，待细胞处于对数生长期时用0.25%胰蛋白酶常规消化，配置细胞悬液，分别加入96孔板中每孔加入100l 500个细胞，放入CO2（5%）培养箱中37C下培养以贴壁。按照实验需要，进行培养并给与10l雨蛙素诱导。待24小时后，每孔加入20l MTT工作液，在细胞培养箱内继续孵育4小时。四小时后待孔板底部出现少量紫色结晶并且40倍镜下观察细胞周围也出现时，实验课停止。而后吸取上清溶液（注意留存紫色结晶），待吸出干净，加入100l DMSO。 37孵育15min，待紫色结晶溶解完毕。在570nm测定吸光度。注意事项：1） 细胞的接种密度一定不能太大，一般每孔500-1000个左右就够了，宁少勿多。尤其对于肿瘤细胞。10000/孔太多了，这样即使药物有作用，MTT方法也是表现不出的，最佳点板浓度在4000-5000/孔，太少的话SD值会很大。2） 注意细胞悬液一定要混匀，已避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接几个就要再混匀一下。3） 加样器操作要熟练，尽量避免人为误差。另外，吹散次数过多也会影响细胞活力，所以要熟练、快些上板。2.2.8.Transwell实验取转染后细胞，细胞分组同上（分为6组），实验步棸如下：1）消化，而后终止消化并离心弃培养液，PBS洗2次，无血清培养基（含BSA）重悬，细胞密度为3105。2）接种：a. 取200l细胞悬液到Transwell小室；b. 向24孔板下室加入600l的培养基（含15%FBS）；c. 培养24h。3）固定染色取出Transwell小室，弃去孔中培养液。用PBS洗2遍，再用甲醛固定30分钟。后清洗风干，取800l结晶紫于孔中，将小室放在上面25分钟。最后清洗显微镜下拍照。3） 计数：取若干个视野计数细胞个数，本实验选取3个视野，都是随机选取。注意事项：1）细胞重悬时，个人认为不要超过5105，具体实验室采用密度要自己摸索，因为不同细胞其侵袭能力有别，细胞量过多过少都会导致难以计数；2）细胞数目差异会对实验结果产生影响，故对细胞应该同时计数；3）细胞一般常规培养12-48h，主要依据侵袭能力而定。本实验采用的最佳培养时间为24h。4）固定染色擦洗应擦净膜表面上未迁移的细胞，但避免擦除膜底细胞，保证计数准确。2.2.9.荧光素酶基因实验1 于转染前24h将细胞接种于12孔板中（1105/孔），每孔细胞汇合度应达到60%，每组样品3个重复。2 转染前半小时将完全培养基换无血清培养基0.5ml。 3 A液，按照实验需求进行分组，各三个复孔，各加入50l 无血清培养基，轻轻混匀，室温静置5min。其中过表达质粒1g，启动子质粒 1g， pRL-SV40质粒0.2g4 B液：脂质体使用前轻轻混匀，脂质体4ul与50l无血清培养基混匀，室温放置5min； 5 将A液、B液混合，然后放置在震荡仪上震荡，使其充分混匀，而后室温放置15min。放置结束后，将混合液均匀滴加至12孔板中； 6 将12孔板放置于37恒温箱中培养6h，然后用完全培养基替换无血清培养，再次放入培养箱中培养； 7 萤光素酶报告基因检测：在转染后48h后，裂解细胞，使用双萤光素酶检测试剂盒，在化学发光仪上进行检测。8 在以Renilla萤光素酶为内参的情况下，用萤火虫萤光素酶测定得到的LUC值除以Renilla萤光素酶测定得到的RLU值。根据得到比值来比较转录因子对启动子的活性。注意事项：1) 基因在检测过程中易受到细胞及载体状态、转染及裂解效率、加样精度等多重因素的影响，同批次样品检测值可因这些因素出现浮动。故实验需要设置3个或3个以上复孔，同时使用其他基因作内参。2) 培养细胞的时间宜在12-36小时之间，不宜过长，长时间细胞培养可能会导致细胞难以裂解。3) 选择目标基因a) 萤光虫荧光素酶：选取pGL-3或pGL-4载体或自身构建载体；b) 海肾荧光素酶：选取phRL-TK或pGL-4代载体或自身构建载体。此外海肾载体不应使用诸如V40、CMV等强启动子，应选用TK等中等强度的启动子；4） 20-22为最佳的反应温度，实验时细胞裂解产物、底物工作液等试剂的添加等操作都宜在适宜温度下操；5） 细胞裂解产物在常温下保存不宜超过6h，-20环境下不宜超过30天，-80环境下不宜超过180天；6） 手动快速使裂解产物与底物混合，并且混合的时间需要一致，以免荧光素酶衰变影响实验结果的准确性以及真实性；7）检测结果：样品检测OD值实际上应该比仪器背景值大得多，若样品OD值与仪器背景值过于接近，表明荧光素酶在样本中含量过少，可从转染量、转染效率、裂解效率等相关因素进行考虑。2.3统计处理实验检测数据均采用SPSS16.0软件分析。计量资料以均数标准差(xs)显示结果，使用独立样本t检验，检验标准为a=0.05。3. 结果3.1.细胞模型构建成功：ELISA测定结果表明,AMS的水平,IL-1和TNF-增加(图1 a、1 b和c)。Western Blot实验结果提示：不同时间段雨蛙素诱导胰腺AR42J细胞与空白对照组相比，诱导24小时后的AR42J细胞TNF-升高明显(图1 d)，各组间差异明显，具有有统计学意义（P0.05），这些结果表明，体外成功构建了急性胰腺炎细胞模型。图1各炎症因子水平3.2.qRT-PCR检测结果：qRT-PCR检测结果显示与空白对照组相比，雨蛙素诱导后IRF9的mRNA水平明显升高、SIRT1的mRNA水平下降。siIRF9转染后IRF9的mRNA表达水平与空白对照组相比降低，较雨蛙素诱导组也降低，SIRT1的mRNA表达水平升高,各组间差异具有统计学意义。（P0.05）（图2）。即siIRF9转染后IRF9的mRNA表达水平较雨蛙素诱导后IRF9的mRNA表达能力降低，SIRT1的mRNA表达水平较诱导前升高。图2 雨蛙素（100 nmol/L）诱导及IRF9基因沉默的AR42J细胞IRF9及SIRT1的mRNA表达的影响3.3.Western Blot结果：用N-siRNA转染24h后的胰腺AR42J细胞内的IRF9、SIRT1、P53、乙酰化P53蛋白的表达与空白对照组比较无明显变化，差异无统计学意义，用siIRF9转染胰腺AR42J细胞后蛋白表达与空白对照组相比：IRF9蛋白表达降低，SIRT1蛋白水平升高、乙酰化p53/p53的表达水平降低，差异有统计学意义(P0.05)（图3）。图3 Western blot 法检测雨蛙素（100 nmol/L）诱导及IRF9沉默的AR42J细胞IRF9、SIRT1、P53及ace-P53蛋白的表达水平3.4.沉默的IRF9基因对AR42J细胞凋亡的影响:AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测的结果表明：无雨蛙素诱导的三组结果：空白组凋亡率是12.4730.353,N-siRNA实验组凋亡率是8.8260.348,沉默IRF9实验组凋亡率是7.4400.647。有雨蛙素诱导的三组结果：空白对照组凋亡率19.2571.668，N-siRNA实验组凋亡率是16.2282.471,沉默IRF9实验组凋亡率是14.8173.069。与空白对照组和N-siRNA转染24h后的胰腺AR42J细胞比较，siIRF9转染24h后的胰腺AR42J细胞的凋亡率是明显降低的（图4）。图4 雨蛙素（100 nmol/L）诱导及IRF9沉默后各组AR42J细胞凋亡率3.5.沉默的IRF9基因对AR42J细胞增殖的影响：MTT实验结果显示:N-siRNA组与空白对照组相比，差异无统计学意义，siIRF9组的OD值较空白对照组及阴性对照组下降，差异有统计学意义（P0.05）（图5）,这说明siIRF9组细胞数明显下降，细胞生长受到明显抑制，siIRF9组细胞自我复制能力下降。图5 雨蛙素（100 nmol/L）诱导及IRF9沉默后各组AR42J细胞的吸光度3.6.IRF9基因沉默对AR42J细胞侵袭迁移的影响：采用transwell法检测AR42J细胞的迁移。结果显示，IRF9沉默组AR42J细胞活力明显低于空白对照组，差异有统计学意义(p0.05)(图6)。与空白对照组和阴性对照组相比，IRF9沉默组的迁移明显减少。阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义。IRF9基因沉默抑制AR42J细胞的迁移。图6雨蛙素（100 nmol/L）诱导及IRF9沉默后各组AR42J细胞的迁移率3.7.双荧光素酶报告基因实验结果显示：结果显示IRF9抑制了SIRT1的启动子活性(图7)。IRF9对SIRT1具有调控作用。图7 IRF9-SIRT1表达4.讨论AP的主要特征是胰腺局部炎症或伴有全身多器官损伤，但其病理机制不明26。AP可分为MAP(轻度AP）以及SAP(重度AP)。其中SAP的病死率较高27,28，达到17%30%。目前SAP无特异性治疗方法，需要依靠重症监护。为降低病死率以及增加治疗效果，应尽早对AP病情程度进行预判。轻度AP为自限性疾病，但若治疗不佳，会迁延不愈甚至成为SAP29。SAP伴有胰腺坏死及全身性炎症反应，甚至会引起脓毒症及器官功能障碍30。AP的发病机制研究是影响其防治方案以及致死率的一个重要影响因素31。为解决这些问题，需要大力投入对AP发病机制研究。IRF同族首先被鉴定为I型转录调节因子干扰素系统。在哺乳动物中，这个家族由9名成员组成，从IRF1到IRF9。在过去几十年来，越来越多的证据揭示了IRF家族在免疫反应，病理过程等方面的功能，包括癌变和心血管疾病32。IRF家族的功能人类AML也有报道。IRF3在人类AML中有着主要影响通过靶向miR-15533。IRF9是IRF家庭成员的另一名成员。IRF9介导先天免疫通过激活干扰素介导的靶基因转录反应34。此外，IRF9展出通过诱导针对干扰素诱导的p53依赖性细胞凋亡的抗增殖作用。IRF9还涉及抗肿瘤药物耐药性并促进细胞生长19,35。IRF9参与细胞增殖、肿瘤形成、炎症以及自身免疫性疾病等病理过程36,37,38。有研究表明39，IRF9与STAT1可形成复合物，其复合物的促炎作用作用结肠炎。IRF9在人类AP中的机制意义仍然未知。本实验采用体外培养大鼠急性胰腺炎细胞AR42J作为研究对象。通过siRNA干扰技术成功敲减了AR42J细胞的IRF9基因，通过qRT-PCR和Western Blot发现雨蛙素诱导后，IRF9基因的mRNA及蛋白水平升高，SIRT1基因的mRNA及蛋白水平均较雨蛙素诱导前降低；乙酰化p53/p53蛋白水平较雨蛙素诱导前明显上调，说明发生急性胰腺炎时IRF9基因、乙酰化p53/p53的表达水平均上调，而SIRT1基因的表达水平下调。流式细胞实验、MTT实验及Transwell实验显示：雨蛙素诱导后IRF9沉默组细胞的凋亡率、迁移能力及增殖能力降低。双荧光素酶基因实验结果示：IRF9抑制了SIRT1的启动子活性。这些结果表明AP发生时IRF9抑制SIRT1表达和增加了p53的乙酰化，促进AR42J细胞凋亡、增殖及转移扩散。沉默IRF9基因能够上调SIRT1，降低p53的乙酰化水平，抑制了细胞凋亡、增殖及转移扩散。我们猜测IRF9是SIRT1的负调节因子，通过抑制SIRT1的表达促进了p53的乙酰化，促进细胞凋亡、增殖及转移扩散。这暗示着IRF9通过SIRT1-p53信号通路在AP病情进展中有着主要作用。综上所述，AP发生时IRF9基因可能通过IRF9-SIRT1-P53信号通路下调SIRT1的表达，增加P53乙酰化水平，提高细胞的增殖和转移能力，进一步引起炎症反应的发生。以IRF9为靶点有望在研究急性胰腺炎发生发展上获得新的认识，为寻找更好的临床治疗方法提供新的方向。5.结论：1） 体外AP模型中IRF9蛋白表达上升，而SIRT1表达下降，p53乙酰化水平升高。细胞凋亡增加、增殖及转移扩散能力升高。2） 沉默IRF9基因能够抑制SIRT1的表达，增加P53乙酰化水平，促进AR42J细胞发生凋亡，提高细胞的增殖和转移能力，3） IRF9蛋白可通过调控SIRT1/p53信号通路进而参与AP的发生发展。IRF9可能是治疗AP的一个潜在的药物靶点。参考文献：1 Zhaorigetu S,Yang Z,Toma I,McCaffrey TA,Hu CA. 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