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,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验二 流感病毒的收获及血凝效价测定,第一部分 流感病毒的收获,实验目的,掌握从鸡胚尿囊腔收获流感病毒的方法，获得大量的病毒抗原。,实验原理,将流感病毒接,种于鸡胚尿囊腔后，,病毒就在尿囊的内,胚层细胞繁殖，繁,殖,12,天后，病毒颗,粒释放至尿囊液中，,从而使尿囊腔中含,有大量病毒，通过收获尿囊液，,可以得到较大量的流感病毒。,实验材料及器械,1.,已接种流感病毒的十日龄鸡胚,2.,无菌镊子、眼科剪刀、玻璃吸管、无菌,EP,管（,1.5,和,10mL,各一个）,3.75,酒精棉球,实验方法与步骤,收获时间根据不同的病毒而异，流感病毒一般培养,36,48,小时即可进行收获。收获前一天晚上，将鸡胚于,4,冰箱过夜（如果急于收获亦可于,20,放置,1,小时左右），将鸡胚冻死，使红血球凝固，这样可避免在收获时流出的血细胞，同尿液或羊水里的病毒发生凝集，造成病毒滴度的下降。,4,冷藏时间不宜过长，过长易造成散黄，影响收获。快速冷冻时间也不易过长，一旦鸡胚冻成冰块就无法收获。,2.,经过冰冻的鸡胚用碘酒、,75,酒精消毒鸡胚气室部卵壳,3.,用无菌镊子将消毒过的壳打碎，轻轻揭去气室部位卵壳，撕去壳膜和绒毛尿囊膜，并将鸡胚轻轻推向一侧，压住。,4.,用无菌吸管通过绒毛尿囊膜进入尿囊腔吸出尿囊液（无大血管处轻轻吸取清亮的黄色液体）。收取的尿囊液可无菌小瓶,第二部分 血细胞凝集实验测定流感病毒效价,实验目的,掌握血凝试验的方法和原理，了解流感病毒具有凝集鸡红细胞的能力，掌握病毒类型的测定的一种方法。,血凝原理,血凝抑制原理,实验材料及器械,1.,收获的尿囊液（即流感病毒）,2.1%,鸡红血球、,0.85,生理盐水,3.,血凝板、吸管、三角瓶,实验方法及步骤,1.,第,1,孔加入,0.4ml,尿囊液，第,2,孔加入,0.1ml,尿囊液。,2.,吸取,0.9ml,生理盐水于血凝板第,2,孔，从第,3,孔至第,10,孔每孔各加生理盐水,0.4ml,。,3.,反复吹打,3,4,次第,2,孔，从混匀的第,2,孔中丢弃,0.2ml,，吸取,0.4ml,至第,3,孔混匀，再吸,0.4ml,至第,4,孔，依次稀释到第,9,孔，第,9,孔经稀释吹打后吸出,0.4ml,，,弃去，第,10,孔为血球对照，即不加尿囊液。,以上各孔（从第,1,孔到第,10,孔）的病毒的稀释度分别为：,孔数,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,稀释度,病毒原液,1,：,10,1,：,20,1,：,40,1,：,80,1,：,160,1,：,320,1,：,640,1,：,1280,空白对照,注意：各孔内液体量应为,0.4ml,4.,从第,10,孔开始，按,10-1,的方向，向每孔加,0.4ml 1,鸡红血球，轻轻振荡均匀，置室温,45,分钟后观察实验结果并记录，各孔的总体积应为,0.8ml,。,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10,病毒原液 红细胞对照,依次加入,0.4ml 1,鸡红血球,实验结果判断,血凝结果以,+,、,+,、,+,、,+,、,表示。,红细胞均匀分布于孔底者为,+,；,红细胞均匀分布于孔底，但有卷边现象为,+,，即不完全凝集；,红细胞在孔底形成一个中等大小环状，四周和中心有凝集以两个加号,+,表示。,红细胞在孔底形成一个小团，边缘光滑圆润者为,，红细胞完全未被凝集；,实验中应注意的一些问题,1.,实验所使用的玻璃器材及有机玻璃板均应干净，血凝板使用完毕及时处理，避免残留的酸、碱和沉着的红细胞影响实验结果,2.,流感病毒是对温度比较敏感的病毒，标本置于,20,时在一两个星期内会出现病毒效价减少的现象，一般需要在,70,存放。,3.,一般采取公鸡的红细胞，而且存放时间超过一周就不可再用。红细胞采来后用,PBS,洗,3,到,4,遍，直到上清很清亮，放置后如果上清变红，说明有溶血，则不可再用。,4.,温度、反应时间、反应体系对血凝试验的结果影响都很大。温度过高病毒毒力过强会出现溶血，不利于判定。反应的时间不能太长，对照孔出现沉淀就可以判定。,思考问题,加病毒液和红细胞悬液时为什么要反向加？,血凝试验设置空白对照的意义？,病毒悬液为什么采取倍比稀释而不是更高倍数如十倍比稀释？,
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