免疫浊度技术概述

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Edited by E.Dalla Dea ESTS,试验免疫浊度技术,免疫反响进展,1897年 Kraus 就觉察细菌培育液毒素与相应,抗血清混合消失沉淀,1905年 Bechhold 把抗体放在明胶中，将抗原加于,其中，觉察沉淀反响可在凝胶中进展,1946年 Oudin 报告了试管免疫集中技术,1965年 Mancini 提出单向免疫集中技术，使定性,免疫试验向定量化进展,1966年 免疫浊度法的消失，使沉淀反响到达快速、微,量、自动化的新阶段。,试验免疫浊度技术,免疫测定原理,利用抗原抗体反响检测标本中微量物质,抗原+抗体 抗原抗体复合物,Ag +Ab Ag*Ab,试验免疫浊度技术,免疫测定特点,特异性,抗原性不同的物质不干扰,敏感性,g-ng-pg,可测物,蛋白质，酶，激素，药物，,毒品,试验免疫浊度技术,免疫检测的根底抗原抗体间的特异性反响,手工操作 自动化分析,免疫比浊分析技术进展,试验免疫浊度技术,两,个,阶,段,测定抗原抗体形成后的阶段,散射,(,终点,),比浊,测定抗原抗体结合的峰值,速率散射比浊,免疫比浊法分类,当一束光,线通过溶,液受到光,散射和光,吸取两个,因素的影,响而使光,的强度减,弱,透射比浊法:,在光源的光路方向00,测量透射光强度和被检测,溶液微粒浓度关系的方法。,散射比浊法:,在光源的光路方向50-960,角的方向上测量散射光强度,和被检测溶液中微粒浓度关,系的方法。,试验免疫浊度技术,透射比浊/散射比浊,光源,滤光片,反响杯,透射光检测,散射光检测,试验免疫浊度技术,一、散射免疫比浊分析原理,散射比浊法：在液相中可溶性抗原、抗体特异性结合，形成肯定大小的复合物粒子，当入射光沿水平轴照射在粒子颗粒上时，光线被颗粒吸取或折射，发生偏转，其偏,转的角度与放射光的波,长和复合物颗粒大小和,多少有关。散射光的强,度与复合物的含量成正,比，即待测抗原越多，,形成的复合物越多，散,射光就越强。,影响散射信号的因素：,如入射光的波长、偏振、,微粒大小、浓度、质量、,以及检测点的距离。,试验免疫浊度技术,一散射颗粒与散射光,Rayleigh原理：即散射光的强度与复合物的量呈正比，与散射,光的夹角呈正比，与波长呈反比。,在散射比浊中，增加抗原-抗体复合物的体积，削减入射光的波,长，扩大散射光夹角等因素，均可增加检测的敏感度。,假设颗粒直径比入射光的波长小的多,则散射光的分布比较均匀,假设颗粒直径接近入射光的波长，,则散射光的分布呈明显不均匀,称为,Rayleigh,散射,称为,Mile,散射,试验免疫浊度技术,二反响物含量与散射浊度,Heidelberger曲线：,即当抗体量恒定时，形成的抗原抗体复合物的反响与散射,信号响应值的上升呈正比。同时，散射信号随抗原抗体,反响时间增加而曲线上升。,当抗原量与响应值上升到一极限时，再增加抗原量，,使散射响应值快速下降,因此，在承受散射比浊测定时，肯定要保证抗体过量。,试验免疫浊度技术,二、定时散射比浊分析,一根本原理,是将沉淀反响与散射比浊分析相结合，“在抗原抗体反,应几秒钟后开头测定峰值信号”。,目的是排解抗原抗体反响的不稳定性，降低检测误差。,承受抗体过量，以获得颗粒产生的最强的散射光信号。,时间,检测分两个,在预反响时段，,加小量样本与,抗原抗体反响，,测定第一次散,射光信号值,加全量样本，约反响 2分钟后，其次次测定散射光信号,信号峰值,计算机处理,转换为样,品浓度,试验免疫浊度技术,二、定时散射比浊分析,二抗原过量检测,抗体过量,在检测中抗体结合抗原的力量可到达相当于正常,血清的50倍以上，以保证高浓度样本中的抗原与,抗体的结合。,对抗原过量进展阈值限定,先测定预反响时段抗原-抗体复合物的散射光信,号，假设未超过阈值，可进展全量样本测定。假设超,过阈值，提示样品浓度过高，需稀释后测定。,承受两项保证措施：,试验免疫浊度技术,三、速率散射比浊分析,一根本原理,是测定抗原抗体结合反响的动态过程。,所谓速率，是在单位时间内抗原抗体结合形成,复合物的速度。将各单位时间内形成复合物的,速率及测定的散射信号连接在一起，即是动态,的速率比浊分析。,当仪器测定到某一时,间内形成速率下降时，,即消失速率峰，该峰,值的凹凸，即代表所,测抗原的量。,试验免疫浊度技术,三、速率散射比浊分析,一根本原理,二抗原过量检测,设计原理 ,速率峰值一般在25秒时消失。,在反响介质中参加肯定量的促凝剂，可加速抗,原抗体复合物的形成，以削减反响时间。,速率法的优点：是快,速、不需要减去样本,和试剂本底读数，校,正结果也较稳定。,试验免疫浊度技术,四、免疫透射比浊分析,一根本原理,当光源的光路角度与正前方夹角为00时，通,过肯定体积的溶液，由于溶液中抗原抗体结合复,合物粒子对入射光因反射、吸取或散射而衰减。,透射光的强度和形成的复合物的量呈反比。,检测器,检测器,光源 透镜 滤光片,平光线,散,射,光,透射光,散射比浊、透射比浊光路图,试验免疫浊度技术,四、免疫透射比浊分析,一根本原理,是个极其简洁的方法。在抗原过量状况下，与待测样品中相应的Ig发生抗原-抗体反响，形成可溶性复合物，使反响介质的浊度发生转变。,测量方法利用分光光度计测量被吸取的量。读数以吸取单位A或OD值表示，A值反映了入射光和透射光的比率。待测物中Ig含量可通过标准曲线计算得出。,待测样品中的抗原含量与吸光度呈正比，而与透射光呈反比。,反响在PEG的作用下，加速复合物的形成。,试验免疫浊度技术,四、免疫透射比浊分析,二试验要求,溶液中形成的复合物分子应足够大(35-100nm),溶液中形成的复合物分子要足够多,掌握抗原抗体反响的温度和时间,加促凝剂，提高复合物形成速度，缩短检测时间,应选择亲和力好、效价高的抗体，保证抗体过量,将标准品稀释至少5个浓度测定，以吸光度值(A),为纵坐标，浓度为横坐标，在半对数纸上绘出标,准曲线，,试验免疫浊度技术,免疫比浊分析的临床应用,检,范,围,测,如免疫球蛋白,IgG,、,IgA,、,IgM,、；补体,C3,、,C4,；,血浆蛋白,AAT,、,TRF,、,A1M,、,CER,；,尿蛋白系列,尿微量白蛋白,视黄醇结合蛋白 转铁蛋白,2,微球蛋白(,2,M),1,微球蛋白(,1,M),小分子治疗药物,检,范,围,测,血浆、体液中特种蛋白,试验免疫浊度技术,乳胶2 种反响模式:,+,+,试验免疫浊度技术,反响过程图,缓冲液,试剂1,搅拌器,样品,混匀,胶乳,试剂2,混匀,第一次读数,其次次读数,试验免疫浊度技术,吸光度/时间,试验免疫浊度技术,检测模式图,最终点,D,最终点-样品空白,D-A,最终点 初始点,D-B,动力学 (,C-B)/,时间,试剂2胶乳或抗血清,样品和试剂1缓冲液,时间,D.O.,OD,变化,试验免疫浊度技术,钩状效应,试验免疫浊度技术,钩状现象,抗体过剩区,沉淀随抗原量的参加而增多,上清液中仍旧有游离的抗体,平衡区,产生最大量的沉淀,没有游离的抗原和抗体,抗原过剩区,由于抗原量过多，造成小的免疫复合,物消失,上清液中有游离的抗原,试验免疫浊度技术,各组份的作用,缓冲体系:,供给最适合反响条件,提高反响灵敏度。,避开非特异性反响。,缩短反响时间。,主要反响物:完成抗原抗体反响所需的成份。,校准:建立测定吸光度和物质含量之间的计算关系。,质控:验证校准。,试验免疫浊度技术,欢送来到,速率散射王国,IMMAGE,Immunochemistry,System,IMMAGE,双光径速率浊度分析系统,高效蛋白,随机TDM,两种技术(透射法+散射法)，四种方法,速率散射比浊法(蛋白检测),速率抑制散射比浊法(,TDM),近红外颗粒速率法免疫分析(,Rate NIPIA),速率抑制,NIPIA (,低分子量,TDM),IMMAGE检测原理-,速率散射法(670nm),ARRAY的优秀传统：,20年实践证明卓越的准确度和准确度,激光光源,近红外颗粒透射免疫分析法：,速率透射法(940nm),增加高敏分析检测菜单：,地高辛，H-CRP，铁蛋白,排解高胆红素和溶血性样本的非特异性干扰,LED,光源,1,2,Conjugate-antibody,complexing,2,1,3,Inhibition of complexing by hapten(drug),1.,Conjugate(hapten on carrier)2.Antibody3.Hapten(drug),速率散射抑制法(670,nm),TDM,检测,On board cooling system,试剂冷藏系统-增加试剂稳定性,四个缓冲液位-完成1400个测试,样品针试剂针分别-,同时完成取样和加试剂,提高检测速度,全面的液面探测系统,Level Sensor,Fluid Sensor,IMMAGE,39个半永久性反响杯-,同时检测质控、定标和样本,全面的条形码系统(各种通用条形码),72个样本位,(每试剂位检测24种工程),真正的随机急诊,功能(不需停机),IMMAGE,-自动校正光源,-原始试管功能,-敏捷的系统界面：触摸式，鼠标，键盘,-24小时随时待机,-每日保养：擦拭探针,-特殊的试剂盖:不再需要开关瓶(穿刺式),IMMAGE,简便的操作系统,单点定标,IMMAGE,在速率峰根底上完成的定标曲线,Concentration,Rate,单点定标,IMMAGE,削减定标次数,提高检测速度,节省试剂用量,NCCLS证明：,单点定标的准确性常常优于多点定标，,至少是结果一样的,1824个月的试剂开瓶有效期,同一样本不需分装，在一次运行,中可以同时检测全部试剂工程,IMMAGE,用户自定义系统,IMMAGE,增加检测菜单,高达50个工程位,一次可同时检测 6 个工程,两种光学方法可以选择,670nmNIA,940nmNIPIA,专用自定义软件,简便的定标程序,