一株光合细菌的鉴定及其处理大豆加工废水试验

哈 尔 滨 工 业 大 学 学 报JOURNAL OF HARBIN INSTITUTE OF TECHNOLOGYVol. 43 No. 12Dec 2011第 43 卷 第 12 期2011 年 12 月一株光合细菌的鉴定及其处理大豆加工废水试验卢海凤，张光明，何春华( 哈尔滨工业大学 市政环境工程学院，150090 哈尔滨，zgm200 126 com)摘 要: 为进一步明晰从土壤中提取的一株光合细菌的生理生化特性，并实现利用其处理污水、达到资源化的目标，对此株光合细菌进行了菌种、形态以及生理生化鉴定，并考察了其在不同条件下降解人工配制的大 豆加工废水的效果 结果表明，此株菌为球形红假单胞菌( Rhodopseudomonas sphaeroides，命名为 Z08) 在初 始 COD 质量浓度为 8 000 12 000 mgL 1 、温度为 26 28 条件下，菌种最佳投量为 160 400 mgL 1 ， 经过 72 h 的处理，COD 去除率达 85% 以上 比较多种光照氧气条件发现在自然光微氧的条件下，经过72 h处 理，Z08 对大豆废水 COD 的去除率达 73. 5% ，菌体产量达 2 125 mgL 1 由此确定了 Z08 处理大豆加工废 水的最佳处理条件为自然光微氧，投菌量为 160 400 mgL 1 ，处理时间为 72 h关键词: 光合细菌; Z08; 菌种鉴定; 大豆加工废水; 处理条件中图分类号: X703. 1文献标志码: A文章编号: 0367 6234( 2011) 12 0072 05The identification of a strain of photosynthetic bacteria andits effect in treating soybean wastewaterLU Hai-feng，ZHANG Guang-ming，HE Chun-hua( School of Municipal and Environmental Engineering，Harbin Institute of Technology，150090 Harbin，China，zgm200 126 com)Abstract: This paper studied the physiological and biochemical characteristics of a new strain of photosynthet-ic bacteria isolated from soil in details，identified its belonging，and used it to treat artificial soybeanwastewater and reclaim resources Results showed that the strain belonged to Rhodopseudomonas sphaeroides，and was named Z08 For treating wastewater with COD of 8 000 12 000 mgL 1 under 26 28 ，the op-timal dose of PSB was 160 400 mg L 1 ; COD removal reached 85% after 72 h Various oxygen light conditions were examined，and the best one was found to be natural light micro oxygen condition Under this condition，COD removal reached 73. 5% and biomass reached 2 125 mgL 1 after 72 h treatment The opti- mal condition of Z08 treating soybean wastewater was as follows: natural light and micro oxygen condition，Z08 dose of 160 400 mgL 1 ，and hydraulic retention time of 72 hKey words: photosynthetic bacteria; Z08; strain identification; soybean wastewater; treatment condition自 20 世纪 60 年代日本科学家 M Kobayashi等发现光合细菌( PSB) 具有能够净化水质的作用 以来，光合细菌就一直受到关注1 光合细菌是 一大类在厌氧条件下进行不放氧的光合作用细菌的总称，其分布广泛，种类繁多 文献2 3将其划分为绿硫细菌、红硫细菌、红螺菌 3 科 其中红 螺菌能在厌氧光照的条件下以低级脂肪酸、多种 二羧酸、醇类、糖类、芳香族化合物等低分子有机 物及二氧化碳等作为光合作用的电子供体进行光 能异养生长，而且能在微氧黑暗条件下，以上述有 机物为呼吸基质，进行好氧异养生长 另外，光合 细菌还具有繁殖速度快( 优于厌氧法) 、能耗低收稿日期: 2010 07 21基金 项 目: 国 家 水体 污染 控制 与治理科技重 大 专项课题 ( 2009ZX07424 005) 作者简介: 卢海凤( 1983) ，女，博士研究生;张光明( 1973) ，女，教授，博士生导师3( 优于好氧法) 和无需污泥处置 等优点在污水治理领域逐步得到推广应用4 10 光合细菌菌体无毒、含有多种营养物质，如蛋白质、多种 B 族维 生素、泛酸、辅酶 Q 等生理活性物质以及菌绿素、 类胡萝卜素等天然色 素，具有很强的回收价 值11 16 基于光合细菌在水处理和资源回收等方 面的优势，对从土壤中富集分离出的一株新型光 合细菌进行了生理生化以及菌种鉴定，并初步探 讨了其对大豆加工废水的处理效果，发现在自然 光微氧条件下，该菌株对大豆加工废水的 COD 具 有较好的降解作用，比传统的光照厌氧及黑暗好 氧条件下利用 PSB 处理高浓度有机废水在工程 上的应用更具有现实意义2)投菌量: 采用称重法 设 置 投 菌 量 ( 干 质量) 为 8、40、160、400、960、1 920 mgL 1 的 6 个处理;3)光 照 及 氧 气 条 件: 光 照 厌 氧 ( 光 强 为1 000 lx) 、自 然 光 微 氧 ( 保 持 溶 解 氧DO 0. 5 mgL 1 ) 以及黑暗好氧( 保持 DO 介于2. 0 4. 0 mgL 1 ) 3 个处理，投菌量为 120 mg / L;4)5)COD: 国标法，详见文献18;生物量采用烘干法，即 MLSS 测定方法，详见文献18结果与讨论22. 1菌种及生理生化性质鉴定1实验光合细菌 Z08 单染色试验及原子力扫描镜试验由图 1，2 可知，该菌的细菌菌体为球状，单个 细菌的直径约为 0. 3 1. 0 m 光合细菌 Z08 复 染色过程中的颜色变化为: 紫色红色无色 紫色，故 Z08 为 G 2. 1. 11. 1实验设备主要实验设备见表 1表 1 主要实验设备紫外可见分光光度计T6 新世纪4ND实验方法菌种形态及生理生化性质鉴定实验1. 21. 2. 11)2)菌种单、复染色试验: 参考文献17;原 子 力 显 微 镜 扫 描: 将 原 始 菌 液图 1 100 倍光学显微镜下 Z08 菌体图像1 000 r / min离心 10 min，取上清液 3 000 r / min 离心10 min，弃上清沉淀部分加入 pH 为 7. 2 的磷酸 盐缓冲液 2 mL，洗涤离心 10 min，如上洗涤 3 5 次即可 将洗涤好的菌体加入磷酸盐缓冲液少许 并稀释到合适的质量浓度进行原子力显微拍照;3) 菌种的碳源利用试验: 参考文献17;4)菌种吸收峰点试验: 将菌液用无菌水稀释至 OD660 = 1. 000 左右，将该菌液在紫外分光光度计上 100 1 000 nm 波长内进行扫描，记录峰点;5) Sherlock MIS 鉴定试验: 详见 sherlock MIS系统操作说明书;图 2 光合细菌 Z08 的原子力镜扫描照片光合细菌 Z08 的碳源利用试验2. 1. 26)光密度 OD660 : 国标法，详见文献18由表 2 可知，该菌能够在以乙醇、果糖、葡萄糖、甘油、甘露糖、甘露醇、山梨醇等小分子有机物 为碳源的培养基中生长，说明该菌能够利用此类 有机物进行新陈代谢; 而不能利用丙酸钠、硫代硫 酸钠、甲基纤维素、油酸钠及蛋白质作为碳源进行1. 2. 2处理大豆加工废水条件及效果实验1) 废水: 采用人工配水方式，用豆浆配制初 始 COD 为 8 000 12 000 mgL 1 的污水; 处理温 度为 26 28 ;仪器名称 型号仪器名称 型号COD 快速测定仪 5B1 台式离心机 TGL16G 空气浴振荡器 HZQC 海尔冷藏柜 BC117FC 电热恒温培养箱 DH3600AB 溶解氧测定仪 YSI2001 /10000 电子天平 ALC110. 不锈钢手提式灭菌锅DSX2808B 立式透明冷藏柜 SC230超净工作台 DLCJI 原子力显微镜 BioScope 电热烘干箱 101 1AB哈 尔 滨 工业大 学 学 报第 43 卷74代谢2. 1. 3光合细菌 Z08 的菌液特征吸收峰点试验 由表 3 可知，该菌在 340、370、450、570、850、980 nm 均有吸收峰，其中 370、850 nm 是菌绿素 a特征吸收峰，980 nm 是菌绿素 b 的特征吸收峰，450、570 nm 是类胡萝卜素的特征吸收峰2 由此 可知，该菌体内含有菌绿素 a、菌绿素 b 以及类胡 萝卜素2. 1. 4光合细菌菌种鉴定经微生物鉴定自动化系统 Sherlock Microbi-alIdentification System ( MIS) 鉴定，该菌种为球形红 单 假 单 胞 菌:Rhodobacter sphaeroides(Rhodopseudomonas sphaeroides ) ，MIS 图谱见图3，对照的标准图谱来源于美国 MIDI 公司，相似度为 0. 838( 相似度 0. 7 鉴定可靠) 表 2 Z08 的碳源利用情况有机物乙醇果糖 甲基纤维素油酸钠蛋白粉葡萄糖甘油甘露糖 丙酸钠甘露醇山梨醇硫代硫酸钠利用情况+表 3菌液特征吸收峰点波长 / nm序号21024526034037045057085098013. 1523. 1453. 1240. 8290. 7410. 5020. 3180. 2410. 43823. 1103. 1173. 0620. 7470. 5050. 3160. 2410. 43633. 1973. 1563. 0540. 7450. 7450. 5030. 3140. 2400. 4352624222018162.55.07.5t/min10.012.512.65图 3GH 1 脂肪酸 IC 法鉴定图谱图 4 为该菌株 16srDNA 序列鉴定结果，根据降解率分别达 86. 8% 与 81. 9% ，在 96 h 时，上述数值分别达 93. 7% 与 90. 5% ; 菌种添加量为 960 与 1 920 mgL 1 的处理组中，前 96 h 时的 COD 去除率均小于菌种投加量为 160 与 400 mgL 1 的组合，而在第 96 小 时 以 后，其去除率数值与 160 和 400 mgL 1 的处理组相差不大; 菌种添加 量为 8、40 与 80 mgL 1 的处理组 COD 去除率在 每 个时间点上均小于其他菌种添加量 160 mgL 1 的 4 个处理组 综合考虑每个处理组 的 COD 降解效果、菌种添加量的经济性与处理时 间的长短可以得出，利用 Z08 处理大豆加工废水 最佳的投菌量为 160 400 mgL 1 ，处理时间为72 h测 序 结 果 分 析: 该 菌 株16S rDNA序 列 与Rhodobacter sphaeroides KD131 ( CP001151 ) 、Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029 ( CP00578) 、Rhodobacter sphaeroides IFO 12203 ( D16425) 等相似 性 为可以确定其分类地 位 属 于100% Rhodobacter sphaeroides 2. 2处理大豆加工废水条件优化及效果2. 2. 1投菌量如图 5 所示，各处理组的 COD 去除率随处理时间的增加逐渐升高，前 72 h 增加最快，72 h 后 数值变化趋于平缓，逐渐达极限值 投菌量为 160 与 400 mgL 1 的处理组在第 72 小时时，COD 的出 峰 高 度/pA图 4球形红假单胞菌(Rhodopseudomonas sphaeroides)进化树因此，相比之下，在自然光微氧条件下的 PSB 处理高浓度有机废水工艺在工程上的应用更具有现 实意义100806012光 照 厌 氧黑 暗 好 氧 自 然 光 微 氧40108206024487296t/h12014416842图 52. 2 2大豆加工废水中 COD 去除率随投菌量变化光照氧气024487296 120 144 168 192t/h从图 6 中可以看出，各处理组的 COD 值随处理时间的增加呈下降趋势，且同一时间点上，各组 COD 去除率的趋势为黑暗好氧 自然光微氧 光照厌氧; 在前 72 h 内，各组 COD 值下降最快，72 h 后各组 COD 值变化相对平缓，逐渐达到处理 极限值; 在第 72 小时时，各组 COD 去除率相差不 大，而在第 168 小时时，各组对 COD 的去除率为: 黑暗好氧( 95. 1% ) 自然光微氧( 91. 9% ) 光 照厌氧( 83. 4% ) 另外，在第 72 小时时，各处理 组 的 菌 体 产 量 分 别 为: 自 然 光 微 氧图 6 大豆废水中 COD 质量浓度随光照氧气组合变化结1)论3从土壤中富集分离的菌株 Z08 经 SherlockMIS 系统鉴定及 16S rDNA 序列测定，判断其为Rhodobacter sphaeroides，菌体为球状，单个细菌 的直径约为 0. 3 1. 0 m，属于革兰氏阴性菌Z08 能够在以乙醇、果糖、葡萄糖、甘油、甘露糖、甘露醇、山梨醇等小分子有机物为碳源的培养基中生长，而不能利用丙酸钠、硫代硫酸钠、甲基纤 维素、油酸钠及蛋白质作为碳源进行代谢( 2 125 mgL 1 ) 光照厌氧( 1 350 mgL 1 )黑暗好氧( 862. 5 mgL 1 ) ，综合处理效果、经济节能性以及菌体产量，自然光微氧为最佳处理条 件 从 COD 去除效果的角度考虑，自然光微氧条 件下对污水中 COD 的去除效果与黑暗好氧条件 下的相差不大，且优于光照厌氧条件 而高浓度有 机废水由于透光性差，氧气传质差，需要通过设置 高光强的照明器以及高强度的曝气来分别控制污 水处理过程中的严格光照厌氧与黑暗好氧条件，2)处理温度为 26 28 条件下，投菌量为160 400 mgL 1 时，Z08 对大豆加工废水 COD的去除率最佳3)在不同的光照氧气组合条件中，自然光微氧组合处理条件最佳，第 72 小时时对 COD 的去除率达 73. 5% ，菌体产量与光照厌氧及黑暗好氧 两个处理组相比达到最大，为2 125 mgL 1 COD 去 除 率/%COD/(gL-1) 8 mg/L40 mg/L80 mg/L160 mg/L400 mg/L960 mg/L1 920 mg/L哈 尔 滨 工 业大 学 学 报第 43 卷76slaughterhouse wastewater J Bioresource Technol-olgy，2008，99 ( 9) : 3836 384210 SIRIANUNTAPIBOON S，SRIKU M Reducing red color intensity of seafood wastewater in facultative pondJ Bioresource Technology，2006，97 ( 14 ) :1612 161711 TIANA Y，YUEA T，YUANA Y，et al Improvement of cultivation medium for enhanced production of coen- zyme Q10 by photosynthetic Rhodospirillum rubrumJ Biochemical Engineering Journal，2010，51:160 16612 秦娟 光合细菌成分的研究及光合细菌制剂降血脂参考文献:1 小林正泰( 日) 光合细菌处理高浓度有机废水J发酵与工业，1978，36 ( 9) : 753 7602 R E 希坎南 伯杰氏细菌鉴定手册M 8 版 北 京: 北京科学出版社，19843 东秀珠，蔡妙英 常见细菌系统鉴定手册M 北 京: 科学出版社，20014 BAI H，ZHANG Z，YANG G，et al Bioremediation of cadmium by growing Rhodobacter sphaeroides: kinetic characteristic and mechanism studiesJ Bioresource Technology，2008，99 ( 16) : 7716 77225 EROGLU E，GUNDUZ U，YUCEL M，et al Photosyn- thetic bacterial growth and productivity under continuous illumination or diurnal cycles with olive mill wastewater as feedstockJ International Journal of Hydrogen En- ergy，2010，35: 5293 53006 KAEWSUK J，THORASAMPAN W，THANUTTAMA- VONG M，et al Kinetic evelopment and evaluation of membrane sequencing batch reactor ( MSBR ) with mixed cultures photosynthetic bacteria for dairy wastewater treatment J Journal of Environmental Management，2010，91: 1161 11687 LU H F，ZHANG G M，DAI X，et al Photosynthetic bacteria treatment of synthetic soybean wastewater: di- rect degradation of macromolecules J Bioresource Technology，2010，101: 7672 76748 MYUNG K K，CHOI K M，YIN C R，et al Odorous swine wastewater treatment by purple non sulfur bacte- ria，Rhodopseupdomonas pulustris， isolated from eu- trophicated pondsJ Biotechnology Letter，2004，26:819 8229 PONSANO E H G，PAULINO C Z，PINTO M F Pho- totrophic growth of Rubrivivax gelatinosus in poultry药效 学 初 步 筛 选D 太 原: 山 西 医 科 大 学，200913 李福枝，刘飞，曾晓希，等 光合细菌( PSB) 应用的 研究进展J 食品与机械，2009，24 ( 1 ) : 152 156，15814 王剑秋，管云涛，腾飞 光合细菌法降解淀粉废水积 累菌体蛋白的研究J 清华大学学报: 自然科学 版，2007，47( 3) : 348 35115 李福枝，刘飞，邓靖 沼泽红假单胞菌中类胡萝卜素的提取与分析J 生物技术，2007，11( 1) : 535116 LORRUNGRUANG C，MARTTHONG J，SASAKI K，et alSelectionof photosyntheticbacteriumRhodobacter sphaeroides 14F for polyhydroxyalkanoateproduction with two stage aerobic dark cultivationJ Journal of Bioscience and Bioengineering，2006，102( 2) : 128 13117吕春梅 环境污染微生物学实验指导M 哈尔滨:哈尔滨工业大学出版社，200618 国家环保局水和废水分析方法编写组 水和废水监 测分析方法M 北京: 中国环境出版社，1989( 编辑 刘 彤)