细胞生物学：第13章 细胞凋亡

cell cell senescencesenescence第一节 细胞衰老(cellular aging或cell senescence)体外培养的二倍体细胞，细胞核随着细胞分裂次数的增体外培养的二倍体细胞，细胞核随着细胞分裂次数的增加不断增大加不断增大细胞核的核膜内折（细胞核的核膜内折（invagination）、）、 染色质固缩化染色质固缩化比较项目比较项目程序性细胞死亡程序性细胞死亡细胞坏死细胞坏死细胞调亡细胞调亡的生物学意义生物学意义：一种生理保护机制，清除体内多余、受损或危险的细胞而一种生理保护机制，清除体内多余、受损或危险的细胞而不对周围的细胞或组织产生危害。在成熟的动物个体中，不对周围的细胞或组织产生危害。在成熟的动物个体中，通过细胞凋亡和细胞增殖速率的调节来维持组织器官细胞通过细胞凋亡和细胞增殖速率的调节来维持组织器官细胞数量的稳定。数量的稳定。凋亡细胞的形态及与正常细胞的对比电镜图凋亡细胞的形态及与正常细胞的对比电镜图细胞核逐渐皱缩至最终解体的过程细胞核逐渐皱缩至最终解体的过程细胞色素c诱导的凋亡细胞DNA电泳图1细胞色素c诱导0 h2细胞色素c诱导1 h3细胞色素c诱导2 h4细胞色素c诱导3 h5细胞色素c诱导4 h6阴性对照7Marker 凋亡细胞组织转谷氨酰胺酶凋亡细胞组织转谷氨酰胺酶tTGtTG（tissue Transglutaminasetissue Transglutaminase）积）积累并达到较高水平累并达到较高水平 发生改变发生改变反转至外脂层反转至外脂层一些膜围小泡一些膜围小泡巨噬细胞表面的凝集素识别巨噬细胞表面的凝集素识别巨噬细胞对暴露的巨噬细胞对暴露的磷脂磷脂酰丝氨酸酰丝氨酸具有识别能力具有识别能力凋亡细胞凋亡细胞出芽方式出芽方式分解分解凋亡小体凋亡小体凋亡凋亡小体小体限定要凋亡的细胞限定要凋亡的细胞 凋亡小体被邻近凋亡小体被邻近 细胞吞噬细胞吞噬 经降解被清除经降解被清除凋亡小体凋亡小体a a 正常正常T T细胞杂交瘤细胞细胞杂交瘤细胞 b b 凋亡细胞凋亡细胞( (扫描电镜扫描电镜) c ) c 凋亡细胞凋亡细胞( (透射电镜透射电镜) )四四 细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测形态学观测：染色法、透射和扫描电镜观察DNA电泳：DNA片段就呈现出梯状条带TUNEL测定法，即DNA断裂的原位末端标记法彗星电泳法（comet assay）流式细胞分析 根据凋亡细胞DNA断裂和丢失，采用碘化丙啶使DNA 产生激发荧光，用流式细胞仪检出凋亡的亚二倍体细 胞，同时又能观察细胞的周期状态。三三 诱导细胞凋亡的因子诱导细胞凋亡的因子物理性因子，包括射线（紫外线，物理性因子，包括射线（紫外线， 射线等），射线等）， 较温和的温度刺激（如热激，冷激）等较温和的温度刺激（如热激，冷激）等化学及生物因子：包括活性氧基团和分子，DNA 和蛋白质合成的抑制剂，激素，细胞生长因子，肿 瘤坏死因子（TNF），抗Fas/Apo-1/CD95抗体等一一 切冬酶切冬酶(caspases)：在蛋白质水解酶级联途径中：在蛋白质水解酶级联途径中具有专一性切割蛋白质分子中的具有专一性切割蛋白质分子中的Asp-X肽键肽键活性的活性的半半胱氨酸蛋白酶胱氨酸蛋白酶系。全称为天冬氨酸特异性的半胱氨酸系。全称为天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白质水解酶。又被称为蛋白质水解酶。又被称为胱冬肽酶胱冬肽酶Caspase的研究首先是在秀丽隐干线虫细胞的凋亡开始的，从的研究首先是在秀丽隐干线虫细胞的凋亡开始的，从胚胎发育至成体，线虫共产生了胚胎发育至成体，线虫共产生了1090个体细胞，其中个体细胞，其中131个个体细胞凋亡。研究发现体细胞凋亡。研究发现ced3,ced4基因促进细胞凋亡，基因促进细胞凋亡，ced9基因阻止基因阻止ced3/ced4的激活，抑制细胞凋亡。的激活，抑制细胞凋亡。2002年美国麻年美国麻省理工学院的省理工学院的Robert horvitz,英国的英国的Sydney Brenner和和John E. Sulston因在线虫细胞凋亡方面的创新性研究共同因在线虫细胞凋亡方面的创新性研究共同获得诺贝尔医学和生理学奖。获得诺贝尔医学和生理学奖。Ced3哺乳类同源物是ICE(Interleukin-1-converting enzyme)，即Caspase1，催化白介素-1前体的剪切成熟过程。在大鼠上成纤维细胞过量表达ICE和Ced3都会引起细胞凋亡。生存细胞生存细胞死亡细胞死亡细胞被判处死刑的细胞被判处死刑的细胞 寡聚化寡聚化 加工加工激活激活 无活性无活性 切冬酶家族成员的特征：切冬酶家族成员的特征：细胞凋亡的过程：激活期和执行期两个阶段。前期细胞应答死亡信号，起始Caspase活化；后期执行Caspase活化，执行细胞死亡程序。 最初翻译产物为无活性酶原，在最初翻译产物为无活性酶原，在Asp-X键处被切割成亚键处被切割成亚基后才组装成四聚体活性酶基后才组装成四聚体活性酶 (2大亚基和大亚基和2小亚基小亚基) ； 均有相同的催化部位均有相同的催化部位(含有含有QACXG保守结构域保守结构域) ； 具有自身活化和活化其它切冬酶的能力。具有自身活化和活化其它切冬酶的能力。 Caspase-8和和10含有串联重复的死亡效应结构域（含有串联重复的死亡效应结构域（），和含有），和含有Caspase募集结构域（募集结构域（）。）。 执行Caspase的活化属于异性活化，即起始Caspase招募执行Caspase原酶分子后，对其进行切割，产生具有活性的执行Caspase切割细胞内重要的结构和功能蛋白，导致细胞凋亡。DNA切冬酶原切冬酶原切冬酶切冬酶I无活性无活性CAD活性活性CADDNA断片化断片化细胞凋亡细胞凋亡DFF45, DNA fragmentation factor-45ICAD, inhibitor of caspase-activated DNase 核纤层解体核纤层解体染色质凝缩染色质凝缩Gelsolin FAK PAK2细胞骨架紊乱细胞骨架紊乱细胞结构解体细胞结构解体切冬酶切冬酶酶解酶解自身调节与修复功能丧失自身调节与修复功能丧失核酸合成、加工、修复核酸合成、加工、修复调节调节切冬酶切冬酶酶解酶解与相邻细胞脱离接触与相邻细胞脱离接触；细胞骨架重新装配细胞骨架重新装配；DNA复制和修复过程被关闭复制和修复过程被关闭；mRNA无法剪接无法剪接；DNA受破坏受破坏；核结构紊乱核结构紊乱。切冬酶切冬酶细胞解体细胞解体凋亡小体凋亡小体许多蛋白质许多蛋白质切割切割吞噬信号吞噬信号发出发出被吞噬清除被吞噬清除Caspase依赖性的细胞凋亡：包括死亡受体起始的外依赖性的细胞凋亡：包括死亡受体起始的外源途径和线粒体起始的内源途径源途径和线粒体起始的内源途径死亡受体介导的凋亡：死亡受体介导的凋亡：死亡配体与受体结合：死亡配体与受体结合：死亡配体主要是肿瘤坏死因子（死亡配体主要是肿瘤坏死因子（TNF）家族成员，）家族成员，TNF由激活的单核由激活的单核-巨噬细胞分泌，诱导细胞凋亡和巨噬细胞分泌，诱导细胞凋亡和诱发炎症反应。诱发炎症反应。死亡受体死亡受体TNF-R1和和Fas（Apo-1，CD95），胞质部），胞质部分含有死亡结构域（分含有死亡结构域（DD），负责招募凋亡信号通），负责招募凋亡信号通路中的信号分子。路中的信号分子。细胞凋亡的内源途径：线粒体是核心细胞凋亡的内源途径：线粒体是核心当细胞受到内部或外部凋亡信号的刺激，胞内线粒体当细胞受到内部或外部凋亡信号的刺激，胞内线粒体的外膜通透性改变，向细胞质基质释放凋亡的相关的外膜通透性改变，向细胞质基质释放凋亡的相关因子，引发细胞凋亡。因子，引发细胞凋亡。细胞色素细胞色素c的释放是细胞凋亡内源途径的关键，线粒的释放是细胞凋亡内源途径的关键，线粒体外膜的通透性主要受到体外膜的通透性主要受到Bcl-2蛋白家族的调控。蛋白家族的调控。 Bcl-2蛋白家族是线虫抗凋亡蛋白蛋白家族是线虫抗凋亡蛋白Ced9的同源物。其的同源物。其功能可以分为两组，功能可以分为两组，Bcl-2、Bcl-xL,Bcl-w等抑制细等抑制细胞凋亡，胞凋亡，Bax、Bak和和Noxa等促进凋亡。等促进凋亡。BCL-2家族成员Caspase非依赖性的细胞凋亡非依赖性的细胞凋亡Caspase非依赖性的细胞凋亡确实存在，但机制仍不完全清楚。非依赖性的细胞凋亡确实存在，但机制仍不完全清楚。凋亡诱导因子（凋亡诱导因子（AIF）位于线粒体外膜，可以转移到细胞质，）位于线粒体外膜，可以转移到细胞质，并进入细胞核，引发核内并进入细胞核，引发核内DNA凝集并断裂形成凝集并断裂形成50kb大小大小的的片段。片段。限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶G（Endo G)可以诱发可以诱发Caspase非依赖性的非依赖性的细胞凋亡。细胞凋亡。 Endo G属于依赖性的核酸酶家族，定位于线粒属于依赖性的核酸酶家族，定位于线粒体，在线粒体中，负责线粒体体，在线粒体中，负责线粒体DNA的修复和复制。受到凋亡的修复和复制。受到凋亡信号刺激，从线粒体进入细胞核，对和信号刺激，从线粒体进入细胞核，对和DNA进行切割。在进行切割。在Caspase未被激活的情况下，产生典型的以核小体为单位的未被激活的情况下，产生典型的以核小体为单位的DNA片段。片段。