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植物远缘杂种和多倍化中的表观遗传研究李锁平多倍化是植物进化变异新物种形成的途径之一,也是促进植物发生进化改变的重要动力。据估计，至少50%也许70%以上的被子植物进化历史上曾发生过至少一次多倍化（Masterson，1994 ；Wendel 2000）。许多重要的作物如香蕉、咖啡、棉花、马铃薯、小麦、甘蔗等都是多倍体。比较基因组研究发现，即使是以前认为是二倍体的物种，如水稻（Guyot and Keller 2004）玉米（Gaut等 1997）、大豆（Shoemaker等1996）拟南芥（Vision，2000；Anonymous，2000）等植物在进化过程中也曾发生过多倍花和加倍后广泛的染色体断裂融合重排。由于多倍体的广泛分布和重要的经济价值，最近50年来，多倍体特别是异源多倍体的合成和进化得到了人们相当多的关注（Soltis和Soltis，1995）。然而，有关多倍体基因组进化的信息人们一直知之甚少。 新合成的人工多倍体由于其亲缘关系明晰，是研究异源杂交和多倍化后早期基因组遗传和后遗传变化的理想材料。自Song等（1995）以人工新合成芸薹属异源多倍体为材料研究基因组的进化以来，利用新合成的人工多倍体研究多倍体基因组进化已用于包括芸薹（song，1995）、小麦及其近缘属（Ozkan ，2001；Feldman and Levy，2003）、拟南芥（Comai etal， 2000；Malung etal ，2002）、棉花（liu ，etal， 2001）、大米草（Baumel etal，2002）等多种植物。发现植物多倍体在形成的早期基因组发生序列的快速消除、亲本基因组的累加、序列和染色体的重排等遗传改变和基因沉默、转座子激活和核仁显性等表观遗传学变化 一植物远缘杂交和多倍化中的遗传改变v1、亲本序列的快速消除和增加v研究表明，芸薹属，小麦属等植物在杂交和多倍化过程中，多倍体的基因组并不是双亲基因组的累加，而是表现出亲本的一些序列的快速消除和增加（消除是主要的）。Song等（1995）以人工新合成芸薹属异源多倍体F2F5为材料，最早的报道了多倍体形成后伴随着广泛的快速的基因组变化，他用89 个核探针（19 个未知克隆, 63 个cDNA 克隆和7 个已知功能的核基因）分析了多倍体基因组限制性片段长度多态（RFLP）,发现F2-F5 各世代基因组均发生变化;其中包括亲本片段消失、出现亲本不存在的新片段、F2 未检测到的亲本片段在F5 重新出现等。 在小麦属和山羊草属种间或属间杂交中,Ozkan 等（2001）以新合成的35 个杂交组合的F1 及22 个异源多倍体(13 代) 为材料,详细研究了小麦基因组(GSS) 或染色体(CSS) 特异的低拷贝、非编码序列的丢失规律。结果显示,序列丢失是一个快速的过程,即丢失发生于F1 ,并在多倍化后的几个世代内完成;GSS 丢失始于F1 ,而CSS 丢失一般始于多倍体1 代,暗示杂合性触发了GSS 丢失,而多倍化导致CSS 丢失。如合成多倍体的基因组组成与天然存在的异源多倍体相似,其染色体序列消失较早;如基因组组成无对应的天然异源多倍体,其染色体序列消失较晚。序列消除对于自然界中多倍体的形成和稳定起重要的作用。推测只有特定的基因组合才能有效的处理好2个基因组的整合，即通过一系列的序列消除来完成，从而生存下来并形成新物种； 对芸薹属多倍体的研究也表明序列消除发生在多倍体形成的早期阶段（song等，1995）。此外, 在芸薹属(B rassica ) 和山羊草属(A eg ilop s) 中观察到的消除序列表明被消除的序列在某种程度上倾向于来自其中一个亲本基因组的序列。在异源多倍体AABB (B. rap a B. n ig ra ) 中观察到丢失的片段倾向于来自父本基因组, 但在异源多倍体AACC 中并没有类似的现象（ Song等，1995）。小麦多倍化过程中倾向于丢失来源于D 基因组的GSS 和CSS（Ozkan 等，2001）。Shaked 等（2001）也观察到类似的单向丢失现象,如山羊草属的Ae. sharonensis ( S1 S1 ) 与Ae.umbellulata (UU) 杂交,前者AFLP 带在杂种中丢失达14 % ,而后者丢失仅有0.5 %,大部分序列消除发生由杂交不是加倍.而在另一个杂交Ae.longissima X T.urartu,序列消除在加倍后更频繁发生。被消除的序列与该异源多倍体物种基因组组成相关。 v消除的涉及的序列有重复序列和低拷贝的非编码序列，也有编码序列。Feldm an 等（1997）最初用16个低拷贝非编码的探针进行了RFLP 研究, 其中9个探针在供试的二倍体基因组中都产生了强烈的杂交信号,但每个序列仅在异源四倍体的一个基因组中检测到了信号, 即两个亲本基因组之中的一个消失了,并且,伴随着六倍体小麦的形成, 又发生了新一轮的序列消除。在随后的实验中,Liu等（1998a）用同一套探针检测了Triticum 和Aegilops人工杂交合成的四倍体、六倍体、八倍体和十倍体中RFLP的情况,与前面的研究一致, 快速而非随机的序列消除在每个异源多倍体中都观察到了。为了进一步确认多倍化诱发的序列消除是否也发展到了编码序列,Liu等（1998b）又用分别定位在六倍体小麦42个染色体臂上的42个编码序列做探针,发现有片段的丢失或新片段的产生, 但是他们证实了这些变化是由于甲基化的影响而不是因为序列消除。这就说明在小麦中发生序列消除的多是低拷贝的非编码序列。编码序列主要进行了表观遗传修饰。v综合小麦属等物种的有关研究表明：在合成新的异源多倍体中的快速序列消除是普遍、非随机、有方向和高度可重复的事件，虽然有一些随机改变，但变化的方向是由双倍体的基因组组合决定的。序列消除不受亲本基因型和杂合性、细胞质背景和倍性水平的影响，也不是基因组间重组造成的（Ma等，2004）。2、亲本基因组在多倍体中的累加v序列的快速消除并不是在所有物种多倍化过程中都发生。双倍体芥菜（B.rapaX B.nigra）真实的继承了双亲的基因组。Liu 等（2001）在棉花中利用扩增片段长度多态性分析（AFLP）和甲基化敏感多态性分析（MSAP）研究了新合成的棉属( Gossypium)异源四倍体、六倍体、双亲及多倍体自交后代的基因组,在AFLP 增的总共约22 000个基因组位点中,亲本的扩增带均能真实地传递给多倍体后代,多倍体基因组也未出现与亲本不同模式的甲基化;用5 个反转座子序列作探针的Southern 分析也显示异源多倍体基因组系2 个亲本基因组的忠实累加。新近Baumel 等（2001，2002） 采用反转座子间扩增多态性( IRAP)、反转座子-微卫星扩增多态性(REMAP) 及简单序列重复间隔( ISSR) 方法,比较了2 个亲本、杂种( Spartina townsendii ) 及仅仅形成110年的年轻的多倍体大米草的基因组。结果显示大米草和杂种一代的基因组有很高的相似性,多倍体基因组系2个亲本基因组的精确累加。然而，在异源四倍体棉花上作的基因表达分析（Adams 等，2003）揭示相当比例高（25%）基因表达差异，人工合成的多倍体和自然多倍体基因表达谱累似表明重复基因表达谱差异是快速可重复的事件。这个结果表明棉花多倍体发生了直接的表观遗传学修饰而不是直接的遗传改变。 3、杂交和多倍化过程中的基因重排v植物多倍化过程中还会出现基因组的重排，在小麦、花生的远缘杂种和多倍体中均出现DNA重排（Levy，Feldman，2002；Liu等，2002；Wendel，2000；Burow等，2001）。在有些情况下,重排几乎涉及整个基因组,每条染色体也可能发生多次重排例如,多花黑麦草( Lolium multiflorum) 与牛尾草( Festucapratensis) 属间杂交合成的四倍体(2n = 4x = 28) 观察到基因组间广泛重组;GISH 分析了代表25 个不同F8 植株的72 个有丝分裂细胞,平均每个细胞发生2238 次易位,至少涉及28 条染色体中的20 条,每条染色体易位07 次（Wendel，2000） 。基因重排有时会导致多倍体染色体数目的减少, 如苇状羊茅( Festucaarundinacea) 与多花黑麦草杂交后,染色体经秋水仙碱加倍,可育后代在减数分裂时出现有规律的配对,并表现出二倍体的染色数;GISH 分析显示二倍体的基因组是双亲染色体不同片断的重组体（Wendel，2000） 。二、远缘杂交和多倍化过程中的表观遗传学变化 v多倍化除发生遗传改变外，还会发生表观遗传学（epigenetic）既不涉及DNA序列的变化导致的基因表达改变，如基因沉默、基因激活、核仁显性等。它主要通过对DNA和/或组蛋白的共价修饰（如DNA甲基化和组蛋白乙酰化）来实现。DNA（特别是胞嘧啶）甲基化（脱甲基化）是高级动物、植物调控基因表达和维持基因组稳定性（基因组防御）的重要表观遗传学机制。组蛋白乙酰化（脱乙酰化）是真核生物中另外一种基因表达的重要表观遗传学机制，有证据表明，组蛋白乙酰化和DNA甲基化密切相关，甲基化是关、组蛋白乙酰化是开（胡楷，2002），二者通过染色质结构来影响基因的表达。远端杂交和基因组加倍可诱发基因组内转座子内外的编码及调控序列发生迅速的表观遗传修饰，从而导致基因沉默、产生新性状以及转座子活性的激活和抑制 三、杂交和多倍化过程中的遗传和表观遗传改变的机制和意义 v对于亲本序列的消除，一些研究者认为是同源重组（Feuillet，等，2002；Comai等2000）。在远缘杂种中，部分同源染色体间的遗传重组产生了大量的错配，超过了DNA错配修复系统的修复能力，从而使种间杂种后代保存大量的重组体。不同的基因组间的染色体部分同源序列的重组，可能产生无着丝点的染色体和双着丝点的染色体，不能传替给后代，导致亲本遗传信息的流失，而部分同源的顺向重复序列的重组，会导致两个重复序列间的序列的丢失。Feldman 等(1997) 认为通过DNA 排除过程,可以把某些部分同源染色体(homoeologous)所共有的序列转化成某些染色体所特有的序列,增加部分同源染色体之间的差异水平,减少它们在减数分裂过程中配对的机会,保证严格的同源染色体(homologous) 之间的配对,从而为多倍化以后在多倍体基因组中尽快恢复二倍化的染色体配对式样奠定基础。 vL iu 等（1998a，1998b，1997）通过比较人工合成的异源多倍体和自然生成的多倍体发现, CSSs 和GSSs 的消除在模式、速率和时间等参数上受到异源多倍体基因组组合情况的影响, 快速的序列消除总出现在那些在自然界中已存在的异源多倍体中,即,序列消除似乎和异源多倍体的成功进化相关联。在多倍体形成过程中出现的这类基因组的非加性变化很有可能是基因组在杂交和多倍化这两大压力下产生的适应性变化, 使得新形成的多倍体的发育调控朝着有利于多倍体基因组在自然界快速稳定的方向发展（Pikaard etal，2002；Ozkan etal，2003） v植物异源多倍化过程中发生的基因沉默和基因表达的改变等表观遗传学改变，能产生新的表型，从而提高了基因表达的多样性（Liu and Wendel,2003），提高其对自然的适应性；快速的基因沉默等表观修饰可引起多倍体遗传学和细胞学的二倍化；远源杂交和多倍化被认为是一种基因组“休克”，不同亲本基因组的突然整合会破坏基因间的协调性。而表观修饰是消除基因间不利的相互作用的一种有效方法，通过基因沉默等表观遗传变易和染色质区的结构重组，不利的相互作用可快速得到改善，从而促进基因间的相互协调（liu and Wendel,2003）。这些新颖的表观修饰方式对植物的进化将产生重要的影响，同时对整个生物界都具有重要的意义 四节节麦和黑麦杂种和双倍体稳定过程中的遗传变化酶切组合亲本片段数亲 本 片 段 消 失 数（%）仅F1消失（%）新 增 片 段 数 （占 亲 本 片 段 总 数 %）仅F1,C1新增带（%）合计 F1 C1 C2 C3 C4 合计F1C1C2C3C4 Pst/MseDD+RR1516211024（3.97）（1.32）（0.66）（0.66）（0.00）（1.32）（2.64）RR179494041049（27.37）（22.34）（2.23）（0.55）（0.00）（2.23）（5.02）DD177179800 03（9.60）（5.08）（4.51）（0.00）（0.00）（0.00）（1.69）合计50772511320616663858783（14.20）（10.05）（2.56）（0.39）（0.00）（1.17）（3.15）（13.02）（7.50）（0.99）（1.58）（1.38）（1.58）（0.59）表1：AFLP在节节麦（DD）、黑麦（RR）杂种及双二倍体各代消失、新增的片段统计 酶切组合亲本片段数亲 本 片 段 消 失 数（%）仅F1消失（%）新 增 片 段 数 （占 亲 本 片 段 总 数 %）仅F1,C1新增带（%）合计 F1 C1 C2 C3 C4 合计F1C1C2C3C4 EcoR/MseDD+RR1513110102（1.98）（0.66）（0.66）（0.00）（0.66）（0.00）（1.32）RR103323101005（31.06）（30.09）（0.00）（0.97）（0.00）（0.00）（4.85）DD245302124302（12.24）（8.57）（0.81）（1.62）（1.22）（0.00）（0.81）合计49965533340966381945016（13.02）（10.62）（0.60）（1.22）（0.8）（0.00）（1.80） （13.23）（7.62）（3.81）（0.80）（1.00）（0.00）（3.21）引物亲本片段数 亲 本 片 段 消 失 数（%）仅F1消失（%）新 增 片 段 数 （占 亲 本 片 段 总 数 %）仅F1,C1新增带（%）合计 F1 C1 C2 C3 C4 合计F1C1C2C3C4 D-SSRDD+RR192200001（10.53）（10.53）（0.00）（0.00）（0.00）（0.00）（5.26）RR130000000（0.00）（0.00）（0.00）（0.00）（0.00）（0.00）（0.00）DD130000001（0.00）（0.00）（0.00）（0.00）（0.00）（0.00）（7.69）合计4522000020000000（4.44）（4.44）（0.00）（0.00）（0.00）（0.00）（4.44）（0.00）（0.00）（0.00）（0.00）（0.00）（0.00）（0.00）表2：节节麦（DD）、黑麦（RR）杂种及双二倍体各代SSR片段分析 引物亲本片段数 亲 本 片 段 消 失 数（%）仅F1消失（%）新 增 片 段 数 （占 亲 本 片 段 总 数 %）仅F1,C1新增带（%）合计 F1 C1 C2 C3 C4 合计F1C1C2C3C4 EST-SSRDD+RR393100110（7.69）（2.56）（0.00）（0.00）（2.56）（2.56）（0.00）RR243000212（12.5）（0.00）（0.00）（0.00）（8.33）（4.17）（8.33）DD352000205（5.71）（0.00）（0.00）（0.00）（5.71）（0.00）（14.28）合计9881005274301001（8.16）（1.02）（0.00）（0.00）（5.10）（2.04）（7.14）（4.08）（3.06）（0.00）（1.02）（0.00）（0.00）（1.02）图1. 节节麦，黑麦及其杂种双二倍体各代的AFLP(PstI-MseI)片段图2. 节节麦，黑麦及其杂种双二倍体各代的EST-SSR(CWEM39)片段图3. 节节麦，黑麦及其杂种双二倍体各代的EST-SSR(CWEM49)片段图4. 节节麦，黑麦及其杂种双二倍体各代的SSR(SCM43)片段图11.杂种F1花粉母细胞中期I构型:8I+3II(D-R),2n=14
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