基于氧化石墨烯的高灵敏半胱氨酸传感器

精品论文基于氧化石墨烯的高灵敏半胱氨酸传感器刘红丽，王宇辉，周晓东，胡继明（武汉大学化学与分子科学学院，武汉 430072）5摘要：半胱氨酸（Cys）由于具有活性巯基而在人体扮演着重要的角色，为了实现高灵敏性地检测半胱氨酸，利用氧化石墨烯（GO）作为检测新平台，制备出了 Ag+调控的半胱氨酸 传感器：当半胱氨酸不存在时，FAM 修饰的富含胞嘧啶 C 碱基的单链 DNA（ssDNA）通 过与 Ag+反应形成“C-Ag+-C”结构从而自身折叠形成双链（dsDNA），此时 FAM 的荧光 不能被 GO 有效地猝灭；当半胱氨酸存在时，半胱氨酸有效地络合 Ag+并将其从“C-Ag+-C”10移除，DNA 变成单链，FAM 的荧光被氧化石墨烯有效地猝灭。通过这种检测半胱氨酸的 方法，除了有效地实现了 HEPES 缓冲液中浓度低至 2 nM 的半胱氨酸的检测，还实现了血 清中低至 5nM 的半胱氨酸的检测，体现了超高的灵敏性。关键词：分析化学 ；半胱氨酸；氧化石墨烯；Ag+；传感器中图分类号：O6515Graphene Oxide-based highly sensitive cysteine sensorLIU Hongli, WANG Yuhui, ZHOU Xiaodong, HU Jiming(College of Chemistry and Molecular Sciences, Wuhan University, Wuhan 430072)Abstract: Cysteine (Cys) plays an important role in human body because of its active thiol. Graphene20Oxide (GO) was applied as new platform to detect Cys with high sensitivity, and Ag+-mediated Cys sensor was developed: when Cys was absent, FAM-tagged Cytosine-rich single-stranded DNA (ssDNA) was employed to react with Ag+ and form special base pairs -C-Ag+-C, leading to the formation of FAM-tagged double-stranded DNA (dsDNA) by self-hibridizing, so the fluorescence of FAM could not be quenched effectively; However, when Cys was in presence, it strongly binded with Ag+ and25removed Ag+ away from C-Ag+-C base pairs, leading to the formation of ssDNA again, so the fluorescence of FAM was significantly quenched by GO. The proposed method for detection of Cyswas not only applied to detect Cys as low as 2 nM, but also sense as low as 5 nM Cys in human serum, displaying the high sensitivity of the sensor.Key words: Analytical Chemistry; Cysteine; Graphene Oxide; Ag+; Sensor300引言半胱氨酸因含有活性巯基而成为生物巯基的主要来源，在形成和稳定蛋白质的二级结 构，实现蛋白质的功能，维持细胞内的氧化还原反应和生物体的新陈代谢等方面起着主要的 作用，并具有抗氧化、抗衰老、解毒等重要的生理功能1。因此实现半胱氨酸的检测，尤其35是完成正常生理条件下的半胱氨酸的检测变得十分重要。 目前已报道的半胱氨酸的方法有很多，比如高效液相色谱的方法2，电化学的方法1, 3-6，比色检测法7-9等等，然而它们中有些需要昂贵而又复杂的仪器，有些需要繁琐的前期实验 准备以及非均相分离操作等等。更重要的是，大部分的方法只能实现微摩尔级别半胱氨酸的检测，因此缺乏高度的灵敏性。而作为一种对样品低损伤、快速、高灵敏并可以被广泛应用基金项目：国家自然科学基金（Nos. 20927003, 90913013，20805034），高校博士点基金（20090141110044） 作者简介：刘红丽（1989-），女，研究生，主要研究方向：基于功能化核酸的荧光分析 通信联系人：胡继明（1952-），男，教授，主要研究方向：激光光谱，分析仪器研制. E-mail: jmhu- 8 -40的技术，荧光光谱技术可以很好地弥补其他分析技术的不足，因此，将荧光技术应用于化学和生物传感器可以简单而又快速地实现目标物在均相体系中的高灵敏检测。图 1 基于氧化石墨烯新平台高灵敏检测半胱氨酸示意图Fig. 1 Highly sensitive detection of Cys based on GO new platform45本文鉴于这样的现状和问题，基于氧化石墨烯与 FAM 标记的单链之间的荧光共振能量 转移（FRET）效应10-14，并利用 Ag+与富含 C 碱基的单链之间的特殊作用15，制备了简单 易操作、具有高灵敏性、高选择性以及较强的生物医学应用潜力的新型半胱氨酸传感器（如 图 1 所示）。1实验501.1 仪器与试剂荧光光谱仪（F-4600，日本日立），WH-2 微型涡旋混合仪，标准型 pH 计（DENVER，UB-7）。半胱氨酸（Cys）、其他 19 种常见氨基酸以及胱氨酸、谷胱甘肽等均为分析纯，使用前 不需要进一步纯化；石墨粉、AgNO3、K2S2O8、P2O5、KMnO4、30%双氧水、浓 H2SO4、浓55盐酸，以上试剂均从武汉申试化工购得；HPLC 纯化 FAM 标记的 Ag+适配子 FAM-ssDNA（FAM-56-FAM-CTCTCTTCTCTTCATTTTTCAACACAACACAC-3，上海生工）；超纯水（18.2 M 阻抗）；HEPES 缓冲液（10 mM HEPES, 50 mM NaNO3, pH 7.4）、人血清（从 武汉中南医院获得）。1.2 实验步骤60首先，参照 Hummers 方法16合成一批固体氧化石墨烯，将得到深褐色粉末状的氧化石 墨烯超声剥离并分散于超纯水中，随后将未分散在水中的 GO 通过离心的方法去除，这样可 制得单层氧化石墨烯储存液（0.5 mg/mL）以备用。HEPES 缓冲液中检测 Cys 的方法：将 150 L 1 M 的 Ag+溶液与 20 L 500 nM FAM-ssDNA 溶液在 30 下孵育 0.5 h，再加入 15 L GO 分散液(0.5 mg/mL)并反应 10 min，65随后将不同体积（0-200L）的 1 M Cys 溶液与以上体系混合并反应 2 h 以上，最后在各个 反应液中加入适当体积的 HEPES 缓冲液使得各个样品的最终体积到达 1 mL，随后在室温下（25）测量各个样品的荧光发射光谱，最佳荧光激发波长为 493 nm。在评判该方法对半 胱氨酸的选择性时，基本步骤与以上步骤一样，不同的是利用高达 1M 的其他干扰物质的 储存浓度来代替 150 nM Cys 与所制备的传感器进行反应，并比较不同样品之间的信号强度70的差异用以判断该传感器对半胱氨酸的选择性。精品论文血清中检测 Cys 的步骤：其具体步骤与缓冲液中检测 Cys 的步骤基本一样，但在加入Cys 标准液之前先引入 10 L 人血清使得血清在体系中的最终浓度稀释了 100 倍。2结果与讨论2.1 FAM-ssDNA 与 GO 之间的 FRET 效应的探讨75GO，是一种具有广阔的二维平面和较好的水溶性的新型的碳纳米材料。在 FAM-ssDNA 与 GO 之间的 FRET 效应中，修饰在 ssDNA 末端的 FAM 分子是荧光供体，GO 是荧光受体， 供体与受体之间的 FRET 效应强烈依赖它们之间的距离17。由于 ssDNA 的核苷酸碱基富含 电子，部分未被氧化的 GO 骨架也富含 电子，它们之间存在着较强 - 堆积作用，这样ssDNA 一旦靠近 GO 就能迅速被吸附在 GO 表面，此时修饰在 ssDNA 末端的 FAM 分子与80GO 之间的距离拉近，即荧光供体与受体之间的距离变短，FRET 效应出现，FAM 荧光有效 猝灭；而一旦 ssDNA 与其互补的 DNA 配对成为 dsDNA 后，两边磷酸骨架外露，亲水作用 力强于 - 堆积的疏水作用力，这样 FAM-DNA 脱离 GO 表面，荧光供体 FAM 与受体 GO 之间的距离变长，FRET 效应消失。本实验中设计的 Cys 传感器就是基于这样的原理设计。 实验现象如图 2 所示：10 nM FAM-ssDNA 与 7.5g/mL GO 分散液混合后，与它本身的荧光85强度相比，猝灭了 90%以上（图 2A 曲线 b），该实验现象证实了所合成的 GO 高效的荧光 猝灭特性；实验中所使用的 FAM-ssDNA 富含 C 碱基，两个错配的 C 碱基能与 Ag+结合形 成一种特殊的碱基对“C-Ag+-C，这样，引入 100 nM Ag+诱导 FAM-ssDNA 参与自我互补配 对，自由卷曲的 ssDNA 变成僵硬的 dsDNA 阻碍 FAM 与 GO 之间 FRET 效应的产生，荧光 恢复（图 2A 曲线 c）；依据这样的原理，Ag+在传感器中充当媒介物，首先利用 150 nM Ag+90获得较大程度的荧光恢复（图 2B 曲线 a），而引入 150 nM Cys 能利用它本身的活性巯基特 异性地络合 Ag+，使得 Ag+从 FAM-dsDNA 中移除18，FAM-dsDNA 再次变成 FAM-ssDNA 被 GO 吸附，荧光再次猝灭（图 2B 曲线 b），这次的荧光猝灭程度与 Cys 的量相关。为了 证明 Cys 本身并不影响荧光，而是通过与 Ag+的作用间接影响荧光，我们做了一个对照实验（图 2B 曲线 c），即在 GO 加入后，并未加入 Ag+就加入 150 nM Cys，发现单一的 Cys 并95不引起体系荧光的变化，由此可知，Ag+在该传感器中起着不可替代的调控作用。100105图 2 FAM-ssDNA 与 GO 之间 FRET 效应的实验现象（A）10 nM 的 DNA 被 7.5 g/mL GO 猝灭荧光前（曲线 a）后（曲线 b）的变化，以及 100 nM Ag+引入对 DNA/GO（10 nM/7.5g mL-1）体系引起的荧光变化（曲 线 c）；（B）150 nM Cys 对 DNA/GO/Ag+（10 nM/ 7.5g mL-1/150 nM）体系（曲线 a）所引起的荧光变化（曲线 b），以及 150 nM Cys 对 DNA/GO（10 nM/7.5g mL-1）体系产生的影响（曲线 c）。图中光谱均已 归一化，ex = 493 nm。Fig.2 FRET effect phenomena from FAM-ssDNA and GO(A) The fluorescence change of 10 nM DNA before(curve a) and after (curve b) being quenched by 7.5 g/mL GO, and the change of fluorescence of DNA/GO(10 nM/7.5g mL-1) by introduction 100 nM Ag+ (curve c); (B) The fluorescence change of DNA/GO/Ag+ （10 nM/7.5g mL-1/150 nM）(curve a) by addition of 150 nM Cys (curve b), and the influence of 150 nM Cys on DNA/GO (10 nM/7.5g mL-1) (curve c). The fluorescence spectra are all normalized, ex=493 nm.2.2 HEPES 缓冲液中定量 Cys110图 3 Cys 的荧光检测（A）HEPE 缓冲液中检测 Cys 的归一化荧光光谱图；（B）缓冲液中检测 Cys 的标准曲线图Fig. 3 Fluorescence detection of Cys. (A) The normalized fluorescence spectra of determination of Cys in HEPESbuffer; (B) The standard curve for detection of Cys in buffer.115120125HEPES 缓冲液中的 Cys 定量结果如图 3 所示，当 Ag+浓度为 150 nM，其他实验条件都 在最佳的情况下，Cys 浓度在 2-200 nM 范围内，荧光信号强度随着 Cys 浓度增大而逐渐变 小，并出现了线性相关性。如图 3B 所示，当 Cys 在 2-10 nM 时，荧光强度变化迅速，传感 器非常灵敏，荧光强度与 Cys 浓度线性相关性好（R1=0.997)；当 Cys 在 10-200 nM 时，荧 光强度变化较缓慢，信号与 Cys 浓度出现了另一种线性相关性（R2=0.995）。Cys 传感器成 功地响应了浓度低至 2 nM 的 Cys，这比现有大部分文献报道的其他 Cys 传感器2-9检出限都 要更低。2.3 基于氧化石墨烯 Cys 传感器的选择性为了测定该传感器对目标物 Cys 的专一性，我们对其它 19 种常见氨基酸等干扰物质的 影响做了仔细的评估。在最佳实验条件下，基本实验步骤与缓冲液中检测 Cys 一样，不同的 是，利用浓度高达 1M 其他干扰物质分别代替 150 nM Cys 与所制得的传感器进行反应，并 最后与 150 nM Cys 的响应信号对比，实验结果如图 4 所示：以不含有任何氨基酸的空白体 系为参照，Cys 传感器对其他干扰物质几乎都没响应，而 150 nM 的 Cys 却能使信号很明显 地变小。这些结果表明，只有 Cys 能够络合 Ag+后将其从“C-Ag+-C”结构中移除，同样证实 了 Ag+调控的基于氧化石墨烯的 Cys 传感器具有良好的专一性。130135图 4 基于氧化石墨烯的 Cys 传感器的选择性Fig. 4 The selectivity of GO-based Cys sensor2.4 在复杂基质血清中检测 Cys如图 5 所示，基于氧化石墨烯的 Cys 传感器在更加复杂的基质人血清中也显示了它优越 的分析效能。当体系中加入一定的 100 倍稀释人血清后，荧光信号随着 Cys 浓度的增大而相 应变小，Cys 检出浓度低至 5 nM，并当 Cys 在 5-200 nM 范围内，信号与 Cys 浓度有着非常 好的线性相关性（R=0.992）。人血清中含有多种不同的蛋白质，使得反应体系变得更加复 杂，这些复杂的基质一方面从某种程度上能使荧光信号更加稳定，另一方面参与 GO 表面的 非特异性吸附竞争，最终使得荧光信号随着 Cys 浓度非常均匀地变化。在稀释血清中定量 Cys 的结果表明，该新型的高灵敏 Cys 传感器极具应用于检测生物样品中 Cys 的潜能。140图 5 稀释 100 倍的人血清中检测 Cys （A）稀释 100 倍人血清中检测 Cys 的归一化的荧光光谱图；（B）稀释 100 倍的人血清中检测 Cys 的标准曲线图。Fig. 5 The detection of Cys in 100-fold diluted human serum. (A) The normalized fluorescence spectra of determaination of Cys in 100-fold diluted human serum; (B) The standard curve for detection of Cys in 100-fold diluted human serum.1451501553结论在本文中，基于 GO 与 FAM-ssDNA 之间的 FRET 效应，设计出了一种检测 Cys 的新平 台GO，一种新型的高灵敏高选择性的 Cys 传感器也随之产生。在我们所设计的体系中， 当无 Cys 存在的情况下，FAM 标记的单链 DNA 在一定量 Ag+诱导下因形成特殊碱基对“C-Ag+-C”而自我互补配对形成双链 DNA，此时阻碍了 GO 与 FAM 之间 FRET 效应的产生， 荧光维持在较高的强度；当体系引物目标物 Cys 时，Cys 通过活性巯基络合 Ag+并将其从特 殊碱基对“C-Ag+-C”中移除使得 FAM 标记的 DNA 重新变成自由卷曲的单链状态，单链 DNA 通过与 GO 之间的 - 堆积作用力而被吸附在 GO 表面，FAM 与 GO 之间的 FRET 产生，荧 光猝灭。利用 Ag+调控的 Cys 传感器不仅实现了缓冲液中 Cys 高灵敏性高选择性的检测，还 实现了复杂基质人血清中 Cys 的定量检测。更加可贵的是，该基于氧化石墨烯的 Cys 传感 器实现了缓冲液中 2 nM Cys 可检测，100 倍稀释血清中 5 nM 可检测，无论是在缓冲液中还 是在血清中，该 Cys 传感器比以往各式各样的 Cys 传感器都要灵敏。由此可见，该新型 Cys 传感器可能在 Cys 相关的研究和医疗诊断方面有着潜在的应用前景。参考文献 (References)1601651701751801851901 Shahrokhian S. Lead phthalocyanine as a selective carrier for preparation of a cysteine-selective electrode J. Anal Chem, 2001, 73(24): 5972-5978.2 Chwatko G, Bald E. 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