实时定量PCR实验故障排除.

实时定量PCR实验故障排除扩增曲线原始数据Spectra：各波长的原始信号没有标准曲线没有标准曲线没有扩增曲线原始数据只有1个循环Spectra只有1个循环的数据原因：1.收集数据的步骤只有一个循环，只收集了一个数据点2.电脑为了节省电源而休眠，通讯中断，1个循环后的数据丢失原因1：PCR参数设置错误原因2：硬盘休眠从原始数据找原因从第1-第9个循环，ROX的信号升高并逐渐下降。在所设定的4-13基线范围内，ROX信号值是变化的，而FAM的信号值基本上是固定的，经过FAM/ROX的校正后，比值自然不相等，所以基线不是水平的直线，而有下滑部分。ROX的信号变化与所用试剂的质量有关。应该取10-20为合理的基线范围。解决方法修改基线范围为10-20，重新分析。重新分析的结果基线范围取10-20，重新分析后的图谱。第1-9循环的信号为负数，由于试剂质量引起。增曲线分成两段扩增曲线断裂原因：基线的终点大于CT值，通常是因为模板DNA浓度偏高，CT值 15，而基线仍然取3-15，其中包含部分扩增信号，导致标准偏差偏大，阈值过高解决方法：减小基线终点，至CT值前4个循环，重新分析数据样品浓度跨度太大直线扩增曲线原因：探针部分降解V形扩增曲线V形扩增曲线V形扩增曲线扩增微弱或者信号很弱ROX信号不稳定扩增曲线不光滑原因：信号太弱解决方法使用高质量的探针补救方法：1.7000的SDS软件升级到v1.12.关闭ROX校正，重新分析数据关闭ROX校正的效果ROX帮助故障诊断(1)现象：重复性很差正常的原始数据原因：盖子未盖紧，溶液蒸发排除蒸发的数据后ROX帮助故障诊断(2)现象：山坡形扩增曲线原始数据显示有蒸发引物二聚体SYBR Green I化学，Dissociation curve试验推荐措施：提高引物设计质量，避免形成引物二聚体补救措施：优化引物浓度和退火温度也许：专设80度步骤收集信号？书是我们时代的生命别林斯基书籍是巨大的力量列宁书是人类进步的阶梯高尔基书籍是人类知识的总统莎士比亚书籍是人类思想的宝库乌申斯基书籍举世之宝梭罗好的书籍是最贵重的珍宝别林斯基书是唯一不死的东西丘特书籍使人们成为宇宙的主人巴甫连柯书中横卧着整个过去的灵魂卡莱尔人的影响短暂而微弱，书的影响则广泛而深远普希金人离开了书，如同离开空气一样不能生活科洛廖夫书不仅是生活，而且是现在、过去和未来文化生活的源泉 库法耶夫书籍把我们引入最美好的社会，使我们认识各个时代的伟大智者史美尔斯书籍便是这种改造灵魂的工具。人类所需要的，是富有启发性的养料。而阅读，则正是这种养料雨果