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探討不同發酵策略對於Rhodotorula glutinis生長及累積油脂之影響研究生：張智勇指導老師：顏宏偉 教授摘要:Rhodotorula glutinis (BCRC 22360) 是一株可累積高脂質含量之油脂性酵母菌，其細胞生長迅速、可達高密度細胞培養，且油脂成分類似於植物油，因此具有相當高發展潛力，可作為生質柴油生產之替代性油料的來源之一。本研究主要探討利用不同發酵策略提升R. glutinis生長及累積油脂，進而提高整體油脂生產速率。由批次(改變起始葡萄糖濃度、溶氧量控制、兩階段溶氧與光強度控制條件)與饋料批次(改變葡萄糖濃度、兩階段溶氧控制與三盞LED光源)策略中，以發酵策略為兩階段溶氧搭配單次饋料與三盞LED光源搭配連續饋料能獲得較佳之結果。但從油脂生產速率與商業化角度來看，以三盞LED光源搭配連續饋料策略較有利於後續的研究與發展，其細胞生長速率高達0.88 g/l/hr且有不錯之平均油脂含量(54.5)，因此，可得較佳之油脂生產速率(0.39 g/l/hr)。 R. glutinis之油脂成分，主要以油酸(C18:1)占5060、棕櫚酸(C16:0)占2030兩者的比例最高。7一、緒論 人類能量需求小，相對天然資源又豐富，所以長久以來大量享受廉價的天然能源，而石油形成之過程需要幾千萬的時間才能完成，依照化石燃料可開採年數及人類使用的速率，顯而易見，石油的消耗量每十年增一倍，在西元1950年，世界石油儲藏量，幾乎可供100年使用。然而，自然資源有限，如果不能生生不息，終有耗盡的一天。依現今的估計，在各項初級能源中，石油可用40年、天然氣可用60年、煤炭可用200年、鈾可用70年。未雨綢繆，尋求資源的永續供給，並減少對環境的衝擊，尋找替代燃料(如生質柴油、生質酒精等)及再生能源(包括太陽能、地熱、風能、海洋能及生質能)乃成為目前的當務之急。 生質能是目前眾所矚目的新能源。有機物如農作物的殘渣、動物牲畜的排泄物、製糖副產物、城市垃圾、工業廢水等，經由自然或人為化學處理成液體、氣體或固體燃料，這種能源就是生質能源。 雖然生質柴油已被視為相當高開發價值的替代能源之一，但是高的原料成本及與民爭食等問題仍限制其發展，而對微生物油脂的研究，正巧提共了更佳穩定、不受四季影響且比起動植物細胞所榨取的油脂較為容易控制的原料來源。妥善利用細胞篩選的方式來挑出較高含油量的菌株，再透過遺傳與代謝工程(如DNA重組、定點突變等)，來提高總脂質的含量與改變脂質組成以適合生質柴油的生產，另外還可利用程序工程的概念，如選定不同的培養模式及策略，如批次發酵、半連續式發酵、連續式發酵等，來提高目標產物的產率、產量或油脂含量，加上有些微生物能利用工業或農業廢棄物當營養源，能有效降低成本，因此運用微生物來生產油脂，作為替代性原料的來源，將是未來發展的一大趨勢。 碳源種類二、文獻回顧2.1 菌種介紹 Rhodotorula glutinis屬於紅酵母菌的成員之一，也屬於腐生菌的一類，抗逆性較強，廣泛分布於各種生態環境中。從陸地到海洋、赤道到兩極均有紅酵母的存在。在陸地，紅酵母可以存在於各種底物上，如土壤、糞肥、動植物體及一些低等生物中；在海洋，紅酵母也是大量存在的酵母菌種類。此外，其他水域如江河、湖泊均有紅酵母存在。 Rhodotorula glutinis細胞的形態呈圓形或卵圓形，行無性多邊出芽繁殖，菌落為紅色，但無酒精發酵的能力，宜生長於2030偏酸性的環境中。根據文獻指出，R.glutinis能累積高達72以上的油脂，也是生產-carotene的菌株之一，其中-carotene具有抗癌與抗氧化等功效，能抑制人體和動物中單線氧的生成，是近年來相當熱門的健康食品。三、研究方法3.1 菌株 本實驗所採用的菌株R. glutinis，是購自生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center)，菌種編號:BCRC 22360，由國立虎尾科大生物科技系張耀南教授所提供。3.2 實驗架構圖Rhodotorula glutinis 5-L 發酵槽搖瓶批次程序&饋料批次程序批次程序裝液量&培養箱轉速起始碳氮源濃度溫度&光照強度光強度控制&饋料溶氧量控制&饋料碳源濃度控制起始碳源濃度圖3-2 實驗架構圖四、結果與討論4.1 搖瓶批次程序4.1.1 不同起始碳源濃度之影響 隨著起始葡萄糖濃度的增加，菌體濃度與油脂含量也會隨之增加，但是以起始葡萄糖為30 g/l各別與45 g/l、60 g/l作比較時，其菌體濃度之差異變得很不明顯，且油脂含量僅略有些微差距，這種現象的產生，推測是pH降太低所致。 圖4-1-1搖瓶批次程序之不同碳源之結果4.1.2 不同轉速之影響 隨著轉速的上升，將會增加發酵液之混合效果，進而提高溶氧量，在較高轉速(210 rpm)下，有較佳之菌體濃度，其殘糖濃度也較低；而較低轉速(60 rpm)下，則有較佳之油脂含量，其殘糖濃度較高，由此可知高DO環境將增加細胞的生長，而低DO環境則有助於油脂的累積。圖4-1-2搖瓶批次程序之不同轉速之結果4.1.3光照強度之影響 照光時能有較高之菌數量，且殘糖濃度較低，但油脂含量較低，反之，不照光時菌數量較低，且殘糖濃度較高，而有較高之油脂含量。因此，初步推測照光將有助於提高菌體的生長，但不利於油脂的累積。圖4-1-3搖瓶批次程序之光照強度之結果4.2 5-L發酵槽批次程序4.2.1改變起始碳源濃度之影響 以起始葡萄糖濃度為140 g/l批次培養下，並不會對菌體生長產生抑制現象，菌體濃度(g/l)、油脂含量()、最大油脂生產速率(g/l/hr)會隨著起始葡萄糖濃度的提高而增加，因此，建議於批次發酵策略下，以較高起始碳源濃度(起始葡萄糖濃度為140 g/l)來進行培養，將會是較佳的選項。圖4-2-1比較起始葡萄糖濃度為60 g/l、100 g/l、140 g/l之發酵結果4.2.2控制溶氧量之影響 在高DO操作下，能使細胞快速生長，最大菌數量達53.2 g/l，遠高於低DO之菌體濃度36.2 g/l；但其油脂含量528卻明顯少於低DO操作627，因此，即使在高DO操作下，可以提高R. glutinis細胞的生長，但油脂含量仍較低DO控制少，從而導致較低之油脂生產速率。 圖4-2-2比較溶氧量控制在2510與6010之發酵結果 4.2.3兩階段溶氧量控制之影響 兩階段溶氧操作下之最大菌數量為45.4 g/l，這明顯多於低DO之菌數量36.2 g/l，但明顯少於高DO之菌數量53.2 g/l；然而，這個策略在油脂累積上並不成功，油脂含量並沒有因為溶氧量的調整(從6010至2510)而得到明顯地改善。圖4-2-3兩階段溶氧量控制之發酵結果(72 hr以前:DO=6010；72 hr以後:DO=2510)4.2.4光強度之影響 光強度控制在3849.9 mole/s/m2下，有較佳之細胞生長速率約為0.87 g/l/hr，相對地平均葡萄糖消耗速率也較大約為2.69 g/l/hr，之後則依序為光強度控制在1283.32 mole/s/m2與不提供光源下所獲得之結果。 雖然在提供三盞LED光源(光強度為3849.9 mole/s/m2)下發酵時，能有較佳之細胞生長速率，且菌數量也能有所增加，但於96 hr之後，細胞幾乎停滯生長，推測可能原因是槽內有抑制菌體成長之物質存在或著是槽內缺乏菌體生長所需的營養物質(如氮源等)，整體上來看，以光強度控制在3849.9 mole/s/m2下，較有助於油脂生產，其油脂生產速率較高約為0.34 g/l/hr，相信能利用饋料的方式，去提高油脂含量，進而使油脂生產速率能再次上升。圖4-2-4比較不提供光源與提供二盞LED燈(光強度為2566.6 mole/s/m2)、三盞LED燈(光強度為3849.9 mole/s/m2)之發酵結果4.3 5-L發酵槽饋料批次程序4.3.1控制碳源濃度之影響 以葡萄糖維持在10 2 g/l、20 4 g/l時，有較佳之細胞生長速率，兩者皆為0.78 g/l/hr，且菌體濃度也較維持在30 5 g/l來得高，但平均油脂含量卻低於維持在30 5 g/l時，推測是菌體必須在較高碳源濃度之環境下，才能更有效地去累積油脂，整體上來看，是以饋料批次葡萄糖維持在20 4 g/l時，較有利於油脂的生產，其生產速率為0.27 g/l/hr。 4-3-1比較控制葡萄糖濃度在10 2 g/l、20 4 g/l、30 5 g/l之發酵結果 相較於以起始葡萄糖濃度為140 g/l之批次發酵策略來說，其油脂生產速率仍較低，但對於提升細胞生長速率來說，卻是有不錯之進展。4.3.2兩階段溶氧搭配饋料批次之影響 透過營造低溶氧且較高碳源濃度之環境，成功地改善兩階段溶氧操作下，後段碳源不足所造成油脂無法繼續累積等問題，使油脂含量能提高約28.6，獲得較佳之油脂濃度約為28.5 g/l。4-3-2比較兩階段溶氧與兩階段溶氧搭配饋料批次之發酵結果4.3.3提供三盞LED光源搭配饋料批次之影響 經由連續饋料來維持碳源(葡萄糖)濃度下，油脂含量能從無饋料時之49.5上升至58.6，大約提高了18.4，而總油脂濃度從無饋料時之21.3 g/l上升至24.6 g/l；最大油脂生產速率也從無饋料之0.34 g/l/hr上升至0.39 g/l/hr。綜合本次實驗與批次光強度控制之實驗結果得知，倘若能改善72小時之後，細胞停止生長的狀況，並探討出最佳饋料之碳源濃度與最佳饋料之時間點，相信油脂生產速率將會再有所提升。4-3-2比較提供三盞LED燈(光強度為3849.9 mole/s/m2)之批次發酵策略與三盞LED燈(光強度為3849.9 mole/s/m2)搭配連續饋料批次控制葡萄糖濃度在30 2 g/l之發酵結果五、結論 以發酵策略為兩階段溶氧搭配單次饋料與三盞LED光源搭配連續饋料能獲得較佳之結果。 而從油脂生產速率與商業化角度來看，以三盞LED光源搭配連續饋料策略較兩階段溶氧搭配單次饋料策略能利於後續的發展與研究，其原因為三盞LED光源搭配連續饋料策略，除了在控制上較簡單外，最主要就是此策略能以照光的形式代替高溶氧環境，來提高細胞生長速率，因此，對純氧的需求相較於兩階段溶氧搭配單次饋料策略少了許多，大幅降低成本。 在各發酵策略中，其油脂成分差異不大，其中以油酸(C18:1)與棕梠酸(C16:0)兩者所占的比例最大，分別為5060與2030。表5-1 各實驗之動力學參數整理 FermentationStrategyMax. biomass (g/l)Max. specific growth rate (g/l/hr)Average lipid content (, w/w)Max. total lipids (g/l)Yield* (g/g)Max. lipid productivity(g/l/hr)Batch-60 g/l29.80.6939.0 311.60.200.27Batch-100 g/l32.90.6849.0 216.10.170.29Batch-140 g/l36.20.5762.0 722.40.210.35Batch-25 1036.20.5762.0 722.40.210.35Batch-60 1053.20.7252.0 827.70.230.24Batch-Two stage45.40.7442.0 319.10.180.28Batch- No light 39.40.4362.1 424.50.200.19Batch- 2-LED 41.20.5548.8 220.10.170.20Batch- 3-LED44.30.8749.5 321.90.180.34Fed-batch at10 g/l36.00.7836.3 513.10.160.20Fed-batch at20 g/l41.00.7853.0 621.70.230.27Fed-batch at30 g/l32.80.7156.0 518.40.210.24Batch-Two stage 45.40.7442.0 319.10.180.28Fed-batch Two-stage 52.80.7454.0 228.50.210.35Batch-3-LED 44.30.8749.5 321.90.180.34Fed-batch 3-LED at 30 g/l45.10.8854.5 224.60.190.39*Lipid produced per glucose consumed.六、參考文獻Pan JG, Kwak MY, Rhee JS. (1986). High density cell culture of Rhodotorula glutinis using oxygen-enriched air. Biotechnology Letters, 8:715-718. Hideyuki Sakaki., Tatsuya Nakanishi., Aki Tada., Sadao Komemushi., and Wataru Miki.(2001). Activation of torularhodin production by Rhodotorula glutinis using weak white light irradiation. Bioscience and Bioengineering, 92:294-297.
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