用15L转瓶大规模生产腮腺炎疫苗的研究

用 15 L 转瓶大规模生产腮腺炎疫苗的研究刘孝民 ,张劲峰 ,陈景才 ,徐京辉 ,刘培生(北京生物制品研究所 ,北京100024)摘 要 :细胞与病毒同时接种于 33 培养 5 天 ,其病毒滴度平均为 6125 LogCCID50 / ml ,但细胞成片后再感染 ,其病毒滴度平均为 4185 LogCCID50 / ml 。在鸡胚细胞感染 2 . 3 10 - 3 病毒剂量时 ,滴度可达 615 LogCCID50 / ml ,病毒 高峰期于 100 小时和 120 小时分二次收获 ,其滴度分别达到 610 和 615 LogCCID50 / ml 。每瓶产疫苗量 4500 ml 和9000 ml ,病毒滴度没有影响 。液体疫苗于 28 保存 14 天 ,滴度由 5175 降至 4175 LogCCID50 / ml ,而将疫苗保存 在 - 18 至 18 周 ,其滴度由 6138 缓慢下降至 510 LogCCID50 / ml 。关键词 :腮腺炎疫苗 ;病毒滴度 ;细胞培养中图分类号 :37311 + 6文章编号 :100525673 (2001) 20120023206文献标识码 :AStudy on large2scale production of mumps vaccine with 15 L roll ig botlle L I U2X i ao2m i n , Z HA N G J i n2f eng , C H EN J i ng2cai , et al . ( N at ion al V acci ne & S er u m I nst i t ute , Beiji n g , 100024)Abstract :The op timal co nditio n of p reparatio n of mump s vaccine wit h 15 L rolling bot tle is reported. The mean titers were6 . 25 LogCCID50 / ml when t he cells and virus were simutaneously inoculated and incubated at 33 for five days. Af ter t he cell mo nolayer were formed ,which were infected by t he virus ,t he mean titer were 4 . 85 LogCCID50 / ml . The chick embryocells were infected wit h t he virus at multiplicit y of infectio n ( MO I) of 2 . 3 10 - 4 t he virus titer may reach to 6 . 5 LogC2CID50 / ml . The virus suspensio n were harvested t wo times at 100 h and 120 h at t he peak of virus titers ,t he titer of t hem were 6 . 00 and 6 . 50 LogCCID50 / ml respectively. The yield of t he vaccine were 4500 ml and 9000 ml per bot tle wit houtsignificant changes in t heir titers. The vaccine in liquid state were stored at 2210 for 14 days and t he titer had dropped- 18 and t he titer had slowly declined f ro m 6 . 38 tof ro m 5 . 75 to 4 . 75 LogCCID50 / ml . While t he vaccine was stored at5 . 00 LogCCID50 / ml .Key words :Mump s vaccine ; Titers ; Cell cult ure一般认为 ,腮腺炎疫苗生产难度很大 ,其主要原因是大转瓶生产的疫苗滴度偏低 ,多为边缘制品 ,而 用克氏瓶生产的疫苗又存在产量低 、染菌机会多的 情况 。其二是疫苗稳定性差 ,冻干后 37 保存一周 往往通不过检定 。我室有幸接收腮腺炎生产任务 , 并用 15 L 转瓶按生产规模对其工艺进行了研究 ,取得了一些数据 ,现总结于后 ,或许对同行有所裨益 。按每瓶 2000 ml 分装于 15 L 瓶 , 置转鼓 上 33 培养 。3病毒接种方法病毒与细胞按不同比例 ( MO I) 混合后同时接种 于 15 L 瓶 33 旋转培养即为混种方法 ; 细胞长成 单层后再接种病毒为分种法 。4疫苗制备种毒后 72 h 弃原培养液 ,用 Earle 液冲洗细胞 ,并浸泡数小时后倾倒 ,换成含 015 %人血白蛋白的199 培养液 , 继续培养一定时间待细胞病变 ( CP E)达 7 8 时收获 ,混合保护剂后取检定样品 ,做病毒 滴定 、无菌试验 、P PL O 检测 、合格后分装冻干 。5病毒滴定用 Vero 细胞与十倍系列稀释的病毒样品等体 积混合 ,接种于 96 孔塑料板内 33 培养 7 d 初判 ,10 d 终判计算 Lo gCC ID50 。材料和方法1毒种采用上海生物制品研究所 S79 减毒株 ,按照 95版中国生物制品规程的要求检定 ,各项指标均合格 后使用 。2细胞北京生物制品研究所实验动物室提供的 910 日龄鸡胚 ,用 012 %胰蛋白酶热消化 20 min ,制成细 胞悬液并接种含 2 %小牛血清的乳蛋白 Earle 液中 ,到 6100 和 5163 Lo gCC ID50 / ml , 120 h 2 批 均 达 到6125 Lo gCC ID50 / ml 的 高 滴 度 ; 而 分 种 法 在 种 毒 后96 h 和 120 h 2 批滴度均无区别 。两种方法在 120 h 均达 到 了 各 自 的 最 高 滴 度 , 但 其 平 均 值 分 别 为6125 和 4185 Lo gCC ID50 / ml ,相差 114 Lo gCC ID50 /ml 。这一结果 说 明 , 混 种 法 明 显 优 于 分 种 法 , 而 且 操作简单 ,时间也短 ,适宜大规模生产采用 。2不同 MO I 对病毒滴度的影响制备一批细胞悬液 ,等量分装于 15 L 转瓶中 ,按几种比例分别加入病毒悬液 ( MO I) 在相同条件下 培养 ,同时取样滴定 ,结果列于表 2 和图 1 。结果1病毒与细胞混种和分种比较同一批细胞悬液一分为二 ,一组为混种法 ,另一 组为分种法 ,比较其滴度 ,结果列于表 1 。表 1 病毒与细胞混种与分种对病毒滴度的影响Table 1 Inflence o n virus titers for cells and virus inoculated si2mult aneo sly ( met ho d A) and separat ely ( met ho d B) . Harvest time(logCCID50 / ml)Sub2lotNO1Met hodCP E 96 h 120 h 1212216100516351825100416341816125612561255107416341856 76 7A表 2 不同 MOI 的病毒滴度Table 2 Virus titers of different MO IAMean Titers122222Mean TitersMO IHarvest time( h)CP ETiterslogCCID50 / ml6 76 7B213 10 - 312012012012076 76 765 . 136 . 3561505175B- 4416 10213 10 - 4213 10 - 5如表 1 所示 ,混种法培养 96 h ,2 批滴度分别达图 1 病毒繁殖曲线Fig. 1 Curve of virus growt h1从表 2 可以看出 ,种毒后 120 h , MO I 为 213 10 - 3 和 213 10 - 5 时 , 其 LogCC ID50 / ml 分 别 为5113 和 5175 , MO I 为 416 10 - 4 和 2 . 3 10 - 4 时 ,其滴度分别为 6138 和 615 Lo gCC ID50 / ml 。说明生产中若采用 416 10 - 4 或 213 10 - 4 MO I 时均能获得高质量的疫苗 。而从图 1 可以看出 ,相同条件 下 ,间隔 24 h 连续取样滴定的病毒繁殖曲线 , MO I 为 2 . 3 10 - 3 组 , 滴度 高 峰 出 现 在 种 毒 后 72 h , 为6113 Lo gCC ID50 / ml ,以后随培养时间的延长 , 滴度缓慢 下 降 , 直 至 144 h LogCC ID50 / ml 为 510 ; MO I为 2 . 3 10 - 4 组 滴 度 于 72 h 已 达 到 5113 Lo gC2C ID50/ ml ,96 h 达到高峰为 615 LogCC ID50 / ml ,高峰持 续 24 h 。当 培 养 到 144 h , 其 滴 度 仍 在 5125LogCC ID50/ ml 。说明 MO I 不 同 , 病 毒 高 峰 出 现 的时间亦不同 。生产中应选择合适的 MO I 与收获时 间 ,才能获得高滴度疫苗 。与此同时 ,还可以说明 , 两种 MO I 于 72 h 其滴度均能达到高水平 ,且可以 持续到 144 h ,在此期间内可多次收获病毒液来提高 单胚产量 ,降低疫苗成本 。3 二次收获疫苗对病毒滴度的影响用混种方法同时制备 10 批疫苗 ,前 5 批于种毒 后 120 h 只收获一次 ,而后 5 批于种毒后 100 h 收获 一次 ,加入新鲜维持液后再继续培养 20 h ,于 120 h再收获一次 ,各做病毒滴定 ,结果列于表 3 。从表 3 可以看出 ,120 h 只收获一次者 ,病毒平 均滴度为 5193 Lo gCC ID50 / ml , 收获二次者 , 于 100 h 收获的病毒滴度平均为 5148 LogCC ID50 / ml , 120 h 收获其平均滴度为 5190 LogCC ID50 / ml ,两者有轻微差异 ;而 120 h 只收获一次者共 5 批 ,5 批平均滴 度为 5193 Lo gCC ID50 / ml 。经统计学检查 ,120 h 收 获的病毒液 ,其滴度无显著差异 ( P 0105) ;而 100 h 与 120 h 收获的病毒液 ,其滴度虽有显著差异 ( P 0105) ,但 100 h 各批的 Lo gCC ID50 / ml 均高于合格指标 。说明在病毒复制高峰期 ,收获二次病毒液 其质量不受影响 。4 单瓶疫苗维持液加量不同对疫苗滴度的影响在生产 中 比 较 了 两 种 维 持 液 加 量 , 9000 ml/ 瓶 者 100 亚批 ,4500 ml/ 瓶 42 亚批 ,结果如表 4 所示 。表 3 一次收获与二次收获病毒悬液的滴度比较Table 3 Titers of virus suspensio n harvested o ne and t wo timesOnly harvest 1 (Lo gCCID50 / ml)Harvest times (LogCCID50 / ml)Sub2lot No .Titers(120 h)Sub2lot No .1st(100 h)2nd(120 h)951901951902951903610051755188610061005193951910951911951912517551385125516351385148610051885175518861005190951904951913951905951914Mean titers表 4 不同维持液加量对病毒滴度的影响Table 4 Influence o n virus titers wit h different volume of maintenance mediumVolume of totalmaintenance medium per bot tleof vaccine ( ml)Dist ributio n of virus titer (LogCCID50 / m)Per chickembryo yieldSub2lotNo1Meantiter41541995105149515051996106149615sub2lotsub2lotsub2lot %sub2lot %sub2lot%51939000100114429 2966 6600525417612 2815926 611904176610445004200222929000ml/ bot tle : The virus was incubated by added maintenance medium 4500 ml when virus suspensio n was harvestedto supply wit h 4500 ml f resh medium again.4500ml/ bot tle : The virus was incubated by added maintenance medium 2500 ml when virus suspensio n was harvested to supply wit h 2000 ml f resh medium again.明显差别 ; 但单胚产量由 292 ml 提高到 505 ml ,相差 213 ml ,说明在生产中适当增加维持液加量可提 高疫苗产量 ,并不影响疫苗滴度 。528 冷释放病毒滴度的影响按照 95 版中国生物制品规程的要求 ,将带“ 7 ” 病变的细胞瓶放入 28 冷释放病毒 ,我们试验了 5批疫苗 ,每隔 24 h 取样滴定 ,结果列于表 5 。期及时收获病毒 ,才能制备高滴度疫苗 。6 疫苗的稳定性611 疫苗保存在不同温度下的滴度试验制备的 3 批疫苗 ,收获后立即混合保护剂 ,然后分别储存于 28 ,37 , - 18 ,结果列于图2 ,图 3 。可以看 出 , 疫 苗 在 2 8 保 存 2 周 , 滴 度 由5175 降到 4175 Lo gCC ID50 / ml ,变化平缓 ,但仍在合 格标准之上 ; 而在 37 保存二天滴度即从 5175 下 降至 215 Lo gCC ID50 / ml 。说 明 腮 腺 炎 疫 苗 在 2 8 二周比较稳定 ,但不宜再延长时间 ; 而在 37 高 温条件下 , 滴 度 呈 直 线 下 降 , 仅 两 天 已 下 降 至 215Lo gCC ID50/ ml ,这说明 ,在培养病毒过程中 ,病毒一旦由细胞释放出来 ,脱离了细胞保护 ,易被温度灭活。这提示我们要把握好收获病 毒 的 时 间 与 存 放 条 件 ,才能保证疫苗的高质量 。图 3 所示 ,在 - 18 保存的疫苗其滴度由原始的 6138 LogCC ID50 / ml 至 18 周 时 逐 渐 降 到 510Lo gCC ID50/ ml ,这 一 结 果 表 明 , 疫 苗 在 - 18 至 少 保存 18 周 ,这为疫苗不能及时干燥时采取临时冻存 的方法提供了依据 。612 疫苗冻干前后的滴度变化同时制备一批疫苗 ,一组为种毒后 120 h 一次 性收获 ,另一组为种毒后 100 h 和 120 h 各收获一表 5 28 冷释放病毒滴度的变化Table 5 Influence o n virus titers of virus cold2release f ro m cells at 28 Sub2lotNo .Primary(LogCCID50/ ml)24 h48h(LogCCID50/ ml) (LogCCID50/ ml)1610051506125510741882-36125-6100611361004-571506188-从表 5 可以看出 ,试验的 5 个亚批疫苗中 ,除第一批 48 h 滴 度 未 下 降 以 外 , 其 余 几 批 滴 度 均 有 下 降 。说明 28 冷释放不能提高病毒滴度 ,相反病 毒滴度有下降趋势 ,提示生产中应在病毒繁殖高峰次 ,比较冻干前后及 37 一周后的滴度变化 。表 6 。图 2 液体疫苗储存在 28 和 37 的滴度变化Fig. 2 Stability of liquid vaccine at 28 and 37 图 3 疫苗冻存在 - 18 的滴度变化Fig. 3 Change of t he vaccine titers stored at - 18 表 6 疫苗冻干前后及 37 一周的滴度变化Table 6 . Changes of t he vaccine titers before and af ter f reeze2dried and at 37 for 1 weekOnly harvest 1 time (LogCCID50 / ml)Harvest t wo times (LogCCID50 / ml) 120 h 100 h ( 1st ) 120 h ( 2 nd) Sub2lotBeforeAf ter37 Sub2lotBeforeAf ter37 BeforeAf ter37 No1 dried dried 1week No1 dried dried 1week dried dried 1week 9519016 . 005 . 004 . 54 . 54 . 254 . 384 . 3895190115 . 754 . 463 . 506 . 005 . 134 . 259519029519039519049519055 . 755 . 886 . 006 . 005 . 134 . 885 . 135 . 2595190129519013951901495190155 . 385 . 255 . 635 . 385 . 134 . 964 . 464 . 504 . 134 . 133 . 844 . 005 . 885 . 755 . 886 . 005 . 135 . 134 . 255 . 004 . 254 . 254154 . 25Mean titers5 . 915 . 084 . 40Mean titers5 . 484 . 703 . 925 . 904 . 934 . 30由表 6 可以看出 ,第一次收获的疫苗与第二次收获的 疫 苗 冻 干 后 平 均 滴 度 分 别 为 4170 和 4193LogCC ID50/ ml , 37 一 周 后 分 别 为 3192 和 4130LogCC ID50/ ml ,均在 合 格 标 准 之 上 , 且 第 二 次 收 获 的疫苗的平均滴度略高于第一次收获的疫苗 ; 而仅 收获一次的疫苗冻干后与 37 一周后的平均滴度 分别为 5108 和平均滴度略高于 第一次 收获的疫 苗 ;而仅收获一次的疫苗冻干后与 37 一周后的平 均滴度分别为 5108 和 4140 Lo gCC ID50 / ml ,高于一很小 。说明在病毒繁殖高峰期 ,二次收获的疫苗冻干前后及 37 一周滴度的变化与热稳定性均符合规程的要求 ,最终滴度与热稳性明显高于合格标准 。7检定所抽查结果1996 年检定所对我们生产的腮腺炎疫苗随机抽取 了 7 批进行了 7 个有关项目的检测 ,结果列于表 7 。表 7 所示 ,抽查 7 批的 7 个检测项目全部合格 , 由此为北京生物制品研究所取得了正式生产文号 , 说明我们采用的方法用于转瓶大规模生产腮腺炎疫 苗是可行的 。表 7 检定所抽检结果Table 7 Rando m detectio n of vaccine by natio nal co nt rol laboratory960632239606332496063423960635229606362396063824960631022Physical examinatio nmeasure of residualMoist ure ( g/ g)Residual p rotein of calf serum ( ng/ ml)pass2 . 7312 . 50pass3 . 096 . 25pass1 . 656 . 25pass3 . 0412 . 50pass2 . 536 . 25pass2 . 046 . 25pass2 . 5712 . 5Titers of vaccine(logCCID50 / ml)6 . 005 . 385 . 885 . 255 . 385 . 135 . 50Heat stability test5 . 134 . 884 . 885 . 255 . 254 . 754 . 88Sterilit y test-Safet y testpasspasspasspasspasspasspass70120 h 收获 ( 12 次) ; 收获的病毒液立即与保护剂混合 ; 2 8 保存 10 d 或 - 18 保存 18周等是制备流腮疫苗的最适宜的条件 。此生产工艺讨论流行性腮腺炎是危害儿童和青年的急性传染病 ,除感染 腮 腺 外 , 偶 尔 侵 犯 其 他 腺 体 , 引 起 睾 丸 炎 ,胰腺炎 ,乳腺炎 ,卵巢炎 ,甲状腺炎和脑膜炎1。用活疫苗进行预防接种是控制此病的主要手段 。在 美国 ,1966 年已获得 J ery1 L ynn 减毒株 ,并用原代 鸡胚细胞制备减毒活疫苗2,1968 年开始有计划的 使用 。国内 1962 年3和 1975 年用 M E 和 M561 减 毒株感染鸡胚 ,制得尿液疫苗 ,在幼儿园和新兵营中试验使用获 得 了 非 常 满 意 的 结 果4。但 国 内 外 至 今尚未见到用 15 L 大转瓶培养原代细胞正式生产 流腮疫苗的报告 。我们研究以生产规模来制备流腮 疫苗 ,获得了非常满意的结果 ,各项技术指标均超过 了现行技术标准 。我们认为 , 病毒与细胞同时接种 ; 213 10 - 3或 2 . 3 10 - 4 MO I 于 33 培养 ; 具有合理 、简便 ,用于生产疫苗具有质量好 、产量高 、物耗低等优点 。参考文献 :1 卢锦汉 1 等 1 主编 :医学生物制品学M1 第 1 版 1 北京 :人民 卫生出版社 ,1995 年 ,60661712 E. B. Buynal and M . R. Hileman . Live At tenuated Mumpas VirusVaccine 1 . Vaccine Develop mentJ . Proc Soc Exp Biol and Med ,1996 ,123 :768775 .3 王太江 ,孙望楚 ,林南靖 ,等 1 流行性腮腺炎鸡胚活毒疫苗免疫 性和反应性的研究J 1 中华医学杂志 1962 ,48 :66814 北京生物制品研究所 ,中国人民解放军 302 医院腮腺炎疫苗协作组 1 流行性腮腺炎活疫苗喷鼻和气雾免疫的血清学反应J 1 微生物学报 1978 ,18 ( 1) :76801( 收稿 2000206228 修回 2000211228)