选修三11《DNA重组技术的基本工具》

专题专题1. 基因工程基因工程 1.1 DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具 1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 基因工程的发展史基因工程的发展史 1.3 基因工程的应用基因工程的应用 1.4 蛋白质工程的崛起蛋白质工程的崛起 科技探索之路科技探索之路 基础理论和技术发展催生了基因工程基础理论和技术发展催生了基因工程 20世纪中叶，基础理论取得了重大突破世纪中叶，基础理论取得了重大突破 1）. DNA是生物遗传物质的证明是生物遗传物质的证明 1944年艾弗里年艾弗里(O.Avery)等进行了肺炎双球等进行了肺炎双球菌体外转化实验菌体外转化实验,证明了证明了DNA是生物的遗传物是生物的遗传物质质,并且证明了并且证明了DNA可以从一种生物个体可以从一种生物个体转移转移到另一种生物个体到另一种生物个体,成为基因工程的先导成为基因工程的先导 2）.DNA双螺旋结构和中心法则的确立双螺旋结构和中心法则的确立。 1953年沃森和克里克建立了年沃森和克里克建立了双螺旋结构模型双螺旋结构模型,使生使生物学进入物学进入分子水平分子水平。 1958年梅塞尔松和斯塔尔年梅塞尔松和斯塔尔,以大肠杆菌为实验材料以大肠杆菌为实验材料,运用同位素示踪技术运用同位素示踪技术,用实验证明了用实验证明了DNA的复制是的复制是以半保留方式进行的以半保留方式进行的. 3）.遗传密码的破译遗传密码的破译。 1963年尼伦伯格和马太做蛋白质体外合成实验年尼伦伯格和马太做蛋白质体外合成实验,破破译译编码氨基酸的编码氨基酸的遗传密码遗传密码. 1966年年，霍拉纳用实验证明了霍拉纳用实验证明了遗传密码的存在遗传密码的存在。 随后不久随后不久确立了中心法则确立了中心法则，揭开揭开DNA复制复制，转录转录和翻译过程之谜和翻译过程之谜。 1)基因转移载体的发现基因转移载体的发现 2) 工具酶的发现工具酶的发现 技术发明命使基因工程的实施成为可能：技术发明命使基因工程的实施成为可能： 1967年年，罗思和赫林斯基发现细菌拟核罗思和赫林斯基发现细菌拟核DNA之外之外的的质粒质粒有有自我复制能力自我复制能力,并可在细菌细胞间并可在细菌细胞间转移转移，为基因转移找到一种为基因转移找到一种运载工具运载工具. 1970年年，阿尔伯阿尔伯、内森斯内森斯、史密斯在细菌中史密斯在细菌中发现了第发现了第一个限制性内切酶一个限制性内切酶。 20世纪世纪70年代初相继发现了年代初相继发现了多种限制酶多种限制酶，转录酶转录酶，为为DNA的切割的切割，连接以及功能基因的获得连接以及功能基因的获得创造了条件创造了条件。 4) DNA体外重组的实现体外重组的实现 1972年伯格年伯格(P.Berg)首先在首先在体外体外进行了进行了DNA改造的改造的研究研究,成功地构建了成功地构建了第一个人工体外重组第一个人工体外重组DNA分子分子. 3)DNA3)DNA合成和测序技术的发明合成和测序技术的发明 1965年年，桑格发明了桑格发明了氨基酸序列分析技术氨基酸序列分析技术 1977年年，科学家又发明了科学家又发明了DNA序列分析方法序列分析方法 之后之后，DNA合成仪合成仪问世问世。 1973年博耶和科恩使年博耶和科恩使重组重组DNA转入大肠杆菌中转入大肠杆菌中,转录转录出相应的出相应的mRNA,并使并使外源基因外源基因可以在原核细胞中成可以在原核细胞中成功表达功表达,至此表明至此表明基因工程基因工程正式问世正式问世. 1973年称这“基因工程元年”，年称这“基因工程元年”， 科恩被称为基因工程发展史上的科恩被称为基因工程发展史上的创始人创始人 实验证明了实验证明了质粒质粒不仅可以作为基因工程的载不仅可以作为基因工程的载体，体，重组重组DNA还可以进入受体细胞，还可以进入受体细胞，外援基因外援基因可可以在原核细胞中成功表达。以在原核细胞中成功表达。 5)重组重组DNA表达实验的成功表达实验的成功 1980年第一个转基因小鼠问世年第一个转基因小鼠问世 1982年采用显微注射技术培养目出年采用显微注射技术培养目出”超级小鼠超级小鼠” 1983年培育出第一例转基因烟草年培育出第一例转基因烟草 1988年穆里斯年穆里斯发明了发明了PCR技术技术,使基因工程技术得使基因工程技术得到了进一步的发展和完善到了进一步的发展和完善.获获1993年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖 1993年中国农业科学院的科学成功之路地培育出抗年中国农业科学院的科学成功之路地培育出抗棉铃虫的转基因抗虫棉棉铃虫的转基因抗虫棉 6)第一例转基因动物问世第一例转基因动物问世 7)PCR技术的发明技术的发明 能否培养出具有抗虫能否培养出具有抗虫 性状的抗虫棉呢？性状的抗虫棉呢？ 胰岛素胰岛素是治疗糖尿病的特效药是治疗糖尿病的特效药, ,长期以来长期以来只能从猪、牛等动物的胰腺中提取，产量只能从猪、牛等动物的胰腺中提取，产量低成本高。低成本高。 而微生物生长迅速，容易控制。于是科学而微生物生长迅速，容易控制。于是科学家设想，若能将人的胰岛素基因导入微生家设想，若能将人的胰岛素基因导入微生物体内，并得以表达，就不仅能解决产量物体内，并得以表达，就不仅能解决产量问题，还能大大降低生产成本，使药品价问题，还能大大降低生产成本，使药品价格大幅下降。格大幅下降。 能否让微生物产生出适合能否让微生物产生出适合人的胰岛素等珍贵药物？人的胰岛素等珍贵药物？ 这些定向改造基因 的设想能实现吗？ 经过多年的努力，科学家经过多年的努力，科学家终于终于在在2020世纪世纪7070年代创立了年代创立了可以可以定向改造定向改造生物的新技术生物的新技术 基因工程基因工程 基因工程的产物基因工程的产物 基因工程的概念：基因工程的概念： 基因工程是指按照人们的愿望，进基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过行严格的设计，并通过体外体外DNA重重组和转基因等技术，赋予生物以新的组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在基因工程是在DNA分子水平上分子水平上进行进行设计和施工的，因此又叫做设计和施工的，因此又叫做DNA重重组技术组技术或或基因拼接技术。基因拼接技术。 基因工程的别名基因工程的别名 操作环境操作环境 操作对象操作对象 操作水平操作水平 基本过程基本过程 实质实质 结果结果 基因拼接技术或基因拼接技术或DNADNA重组技术重组技术 生物体外生物体外 基因基因 DNADNA分子水平分子水平 剪切剪切 拼接拼接 导入导入 表达表达 基因重组基因重组 基因工程的概念基因工程的概念 定向地改造生物的遗传性状，定向地改造生物的遗传性状，获得人类所需要的品种。获得人类所需要的品种。 普通棉花普通棉花 抗虫棉抗虫棉 基因工程培育抗虫棉的简要过程：基因工程培育抗虫棉的简要过程： 普通棉花普通棉花( (无抗虫特性无抗虫特性) ) 苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌 提取提取 抗虫基因抗虫基因 与运载体与运载体DNA拼接拼接 导入导入 棉花细胞棉花细胞( (含抗虫基因含抗虫基因) ) 转基因棉花植株转基因棉花植株(有抗虫特性有抗虫特性) 上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？ 解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？ “分子手术刀”分子手术刀” 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 关键步骤一：关键步骤一： 从苏云金芽孢杆菌细胞内提从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来抗虫基因取出来抗虫基因 关键步骤二：关键步骤二： 抗虫基因与棉花抗虫基因与棉花DNA“缝合”缝合” 关键步骤三：关键步骤三： 抗虫基因进入棉花细胞抗虫基因进入棉花细胞 “分子缝合针”分子缝合针” DNADNA连接酶连接酶 “分子运输车”分子运输车” 运载体运载体 1 .1、DNADNA重组技术重组技术的基本工具的基本工具 “分子手术刀”分子手术刀”- “分子缝合针”分子缝合针”- “分子运输车”分子运输车”- 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 DNADNA连接酶连接酶 运运载体载体 专一性，专一性，识别双链识别双链DNA 分子的某种分子的某种特定特定的核苷酸序列的核苷酸序列，并且使每一条链中，并且使每一条链中特定特定部部位的两个核苷酸之间的位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键磷酸二酯键断开。断开。 主要是从主要是从原核生物原核生物中分离纯化出来的一中分离纯化出来的一种酶。种酶。 约约4000种。种。 1、来源：、来源： 2、种类：、种类： 3、特点：、特点： 5、结果：、结果： 形成两种末端形成两种末端 一、一、 “分子手术刀”“分子手术刀” 限制性核酸内切限制性核酸内切酶酶 粘性末端粘性末端 平末端平末端 切割切割DNA 4、作用：、作用： 原核生物易受自然界外源原核生物易受自然界外源DNA的入侵的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限限制酶制酶就是细菌的一种就是细菌的一种防御性工具防御性工具，当外源，当外源DNA侵入时，会利用限制酶侵入时，会利用限制酶将外源将外源DNA切割切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到核生物中主要起到切割外源切割外源DNA、使之失效使之失效，从而达到从而达到保护自身保护自身的目的的目的。 限制酶在原核生物中的作用：限制酶在原核生物中的作用： 寻根问底寻根问底(P4) 你能推测限制酶存在于原核你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是是什么吗？生物中的作用是是什么吗？ 限制酶的识别特点限制酶的识别特点 以中轴线双侧的以中轴线双侧的DNA上碱基呈上碱基呈反向对称反向对称， 重复排列重复排列 如：如：GAA TTC CCC GGG CTT AAG GGG CCC EcoR （在（在G与与A之间切割）之间切割） Sma （在（在G与与C之间切割）之间切割） Hind （在（在A与与A之间切割）之间切割） G A A T T C C T T A A G C C C G G G G G G C C C A A G C T T T T C G A A 中轴线中轴线 （专一性）（专一性） 大肠杆菌的一种限制酶（大肠杆菌的一种限制酶（EcoREcoR)能识别能识别GAATTCGAATTC序列，并在序列，并在G G和和A A之间之间切开形成黏性末端。切开形成黏性末端。 SmaSma能识别能识别CCCGGGCCCGGG序列，并序列，并在在C C和和G G之间切割形成平末端之间切割形成平末端 。 EcoR 黏性末端黏性末端 黏性末端黏性末端 什么叫黏性末端？什么叫黏性末端？ 被限制酶切开的被限制酶切开的DNA两条单链的切口，两条单链的切口，带有几个带有几个伸出的核苷酸伸出的核苷酸，它们之间正好，它们之间正好互互补配对补配对，这样的切口叫，这样的切口叫黏性末端黏性末端。 Sma 平末端平末端 平末端平末端 什么叫平末端？什么叫平末端？ 当限制酶当限制酶从识别序列的从识别序列的中心轴线处中心轴线处切开时，切开时，切开的切开的DNADNA两条单链的切口，是两条单链的切口，是平整的平整的，这样的切口叫，这样的切口叫平末端平末端。 思考与探究思考与探究 P7 为什么限制酶不剪切细菌本身的为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？ 通过长期的进化，含有某种限制酶的通过长期的进化，含有某种限制酶的细胞，其细胞，其DNADNA分子中或者分子中或者不具备不具备这种限制这种限制酶的酶的识别切割序列识别切割序列，或者通过甲基化酶，或者通过甲基化酶将将甲基转移甲基转移到所到所识别序列识别序列的碱基上，使的碱基上，使限制限制酶不能将其切开酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的某种限制酶也不会使自身的DNADNA被切断，被切断，并且可以防止外源并且可以防止外源DNADNA的入侵。的入侵。 3、特点、特点: 4、作用：、作用： 5、结果：、结果： 1、简称：、简称： 2、分布：、分布： 工具工具1：限制性核酸内切酶：限制性核酸内切酶 主要在主要在原核生物原核生物中中 限制酶限制酶 识别特定核苷酸列识别特定核苷酸列, 切割特定切点切割特定切点 （专一性）（专一性） 切割切割DNA 产生黏性未端或平末端产生黏性未端或平末端 要想获得某个特定性状的基因必须要用限制要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性酶切几个切口？可产生几个黏性(平平)末端？末端？ 要切要切两个两个切口，产生切口，产生四个四个黏性黏性(平平)末端。末端。 如果把两种来源不同的如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶用同一种限制酶来切割，会怎样呢？来切割，会怎样呢？ 会产生会产生相同的黏性相同的黏性(平平)末端末端，然后让两，然后让两者的黏性者的黏性(平平)末端末端黏合黏合起来，就似乎可以合起来，就似乎可以合成重组的成重组的DNA分子了。分子了。 思考思考? ? Go back GAATTCGAATTC CTTAAGCTTAAG GAATTCGAATTC CTTAAGCTTAAG EcoR G GAATTCAATTC CTTAACTTAAG G G GAATTCAATTC CTTAACTTAAG G 不同来源的不同来源的DNA片段混合片段混合 将不同种来源的将不同种来源的DNA片段连接起来片段连接起来 生物生物A基因片段基因片段 生物生物B基因片段基因片段 G G AATTCAATTC CTTAACTTAA G G G G AATTCAATTC CTTAACTTAA G G 酶切酶切 基因的针线：基因的针线：DNA连接酶连接酶 G A A T T C C T T A A G G A A T T C C T T A A G G C T T A A A A T T C G G C T T A A A A T T C G G C T T A A A A T T C G 用同种限制酶切割用同种限制酶切割 二、二、 “分子缝合针”“分子缝合针” DNA连接酶连接酶 作用作用把把2个个DNA片段末端之间的片段末端之间的 缝隙“缝合”起来。缝隙“缝合”起来。 G A A T T C C T T A A G 即脱氧核糖、即脱氧核糖、 磷酸基之间的连接磷酸基之间的连接 G P A P 限制酶切割后有两种不同的结果，一限制酶切割后有两种不同的结果，一种产生黏性末端，一种产生平末端。那么种产生黏性末端，一种产生平末端。那么恢复它们的连接时，所用恢复它们的连接时，所用DNA连接酶是否连接酶是否一样呢？一样呢？ DNA连接酶的种类：连接酶的种类： E.coliDNAE.coliDNA连接酶：连接酶：只连接黏性末端只连接黏性末端 T T4 4DNADNA连接酶：连接酶：连接黏性末端和平末端连接黏性末端和平末端 大肠杆菌大肠杆菌 T4噬菌体噬菌体 可把黏性末端之间的可把黏性末端之间的缝隙“缝合”缝隙“缝合”起来，起来， 即即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 E coliDNA连接酶连接酶 T T4 4DNADNA连接酶连接酶 DNADNA聚合酶聚合酶 DNADNA连接酶连接酶 用途用途 寻根问底寻根问底 (P6) DNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶聚合酶是一回事吗是一回事吗?为什么为什么? 将将单个核苷酸单个核苷酸连接到连接到已有的核酸片段上，已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键 在在两个两个DNADNA片段之片段之间间形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键 作用作用 对象对象 DNA复制复制 基因重租基因重租 DNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶比较：聚合酶比较： 链条数链条数 单链单链 双链双链 3、类型类型 E coli DNA 连接酶连接酶 来源：大肠杆菌来源：大肠杆菌 作用特点：只连接作用特点：只连接黏性末端黏性末端 T 4 DNA 连接酶连接酶 来源：来源： T 4 噬菌体噬菌体 作用特点：连接作用特点：连接黏性末端和平末端黏性末端和平末端 2、作用原理：、作用原理： 催化催化磷酸二酯键磷酸二酯键形成形成 1、作用、作用: ： 工具工具2： DNA连接酶连接酶 把把DNA片段片段拼接成新的拼接成新的DNA， 4、 DNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶比较聚合酶比较 例例.限制酶在限制酶在DNA的任何部位都能将的任何部位都能将DNA切开吗？以切开吗？以下是四种不同限制酶切割形成的下是四种不同限制酶切割形成的DNA片段片段:你是否能用你是否能用DNA连接酶将它们连接起来？连接酶将它们连接起来？ CTGCA G AC TG CG GC G CTTAA G ACGTC GC CG GT CA AATTC G 和能连接形成和能连接形成 AC TG GT CA 和能连接形成和能连接形成 G CTTAA AATTC G CG GC GC CG 和能连接形成和能连接形成 和能连接形成和能连接形成 CTGCA G G ACGTC 反向对称反向对称 DNA连接酶有连接单链连接酶有连接单链DNA的本领吗？的本领吗？ 迄今为止，所发现的迄今为止，所发现的DNA连接酶连接酶都都不具有不具有连接单链连接单链DNA的能力，至于的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链现可以连接单链DNA的酶。的酶。 思考与探究思考与探究 P7 要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表达，首先得将这个基因送乙生物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞内去！到乙生物的细胞内去！能将外源基因送入受能将外源基因送入受体细胞的工具体细胞的工具就是就是载体载体。 基因工程的载体来源基因工程的载体来源： 作为基因工程的载体需要怎样的条件呢？作为基因工程的载体需要怎样的条件呢？ 质粒质粒、噬菌体噬菌体、动植物病毒动植物病毒 作用：作用：将重组基因导入受体细胞将重组基因导入受体细胞 三、三、 “分子运输车分子运输车” 基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体 议一议议一议 2 2、能否用、能否用SARSSARS病毒作为基因载体？病毒作为基因载体？ 3 3、作为载体，若没有切割位点将怎样？、作为载体，若没有切割位点将怎样？ 4、携带目的基因的载体是否进入了受体细胞，、携带目的基因的载体是否进入了受体细胞，如何鉴定？如何鉴定？ 5、假如目的基因导入受体细胞后不能复制，假如目的基因导入受体细胞后不能复制，将怎样？将怎样？ 1、从化学组成来看，载体应含有什么成分？、从化学组成来看，载体应含有什么成分？ 双链双链DNADNA 不能不能 不能进行不能进行DNADNA的重组的重组 载体上应有标记基因载体上应有标记基因 可能造成基因丢失可能造成基因丢失 1、载体必须具备的条件：载体必须具备的条件： 能够在宿主细胞中能够在宿主细胞中复制并稳定地保存复制并稳定地保存； 具有一至多个具有一至多个限制酶切点限制酶切点，以便与，以便与 外源基因连接外源基因连接 具有某些具有某些标记基因标记基因，便于进行筛选。，便于进行筛选。 如：抗菌素的如：抗菌素的抗性抗性基因、基因、 产物具有产物具有颜色反应颜色反应的基因等。的基因等。 对受体细胞对受体细胞无害无害 2、常用的载体：、常用的载体： 质粒，质粒， 噬菌体的衍生物，噬菌体的衍生物， 动植物病毒等动植物病毒等 认识常用的载体认识常用的载体质粒 质粒是基因工程常用的载体，一种裸露的、结构简单、独立于染色体或细菌拟核之外，能自我复制的小型环状双链DNADNA分子，对宿主细胞没有影响，主要存在于细菌和酵母菌体内。其中最常用的是大肠杆菌质粒。 能能复制复制并带着并带着插入的目的基插入的目的基因一起复制因一起复制 有有切割位点切割位点 有有标记基因标记基因 3、质粒、质粒 本质：本质：小型小型环状环状DNADNA分子分子。 分布：分布：许多细菌、许多细菌、 酵母菌等生物酵母菌等生物 质粒的特点：质粒的特点： 1 1、细胞染色体细胞染色体（或拟核或拟核DNADNA分子分子）外能外能自主复制的自主复制的小型环状小型环状DNADNA分子；分子； 2 2、质粒的存在对宿主细胞无影响；质粒的存在对宿主细胞无影响； 3 3、质粒的复制只能在宿主细胞内完成质粒的复制只能在宿主细胞内完成。 1 1、能自我复制、能自我复制 2 2、具有一个或多个限制酶切点、具有一个或多个限制酶切点 3 3、具有遗传标记基因、具有遗传标记基因 4 4、对受体细胞无害、易分离、对受体细胞无害、易分离 5 5、大小适合，便于操作、大小适合，便于操作 质粒作为运载体的条件质粒作为运载体的条件： 在进行基因工程操作中在进行基因工程操作中,真正被用作载真正被用作载体的质粒都是在体的质粒都是在天然质粒的基础上天然质粒的基础上进行过进行过人工改造人工改造的。的。 工具工具3 3：运载体：运载体 1 1、需要的条件、需要的条件： 有1多个限制酶切点 能在受体细胞中自我复制，或整合到受体细胞的 染色体DNA上复制 有某些标记基因，便于筛选 对受体细胞无害 2 2、常用运载体、常用运载体： 质粒、噬菌体的衍生物噬菌体的衍生物或某些动植物病毒 3、质粒：小型小型环状环状DNA分子分子。 天然的天然的DNA分子可以直接用做分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？基因工程载体吗？为什么？ 不可以，作为基因工程使用的载体不可以，作为基因工程使用的载体必需满足一定条件必需满足一定条件,且且都都要进行人工要进行人工改改造后造后才能用于基因工程操作。才能用于基因工程操作。 思考与探究思考与探究 P7 原核生物很容易受到自然界中外源原核生物很容易受到自然界中外源DNADNA的入侵，的入侵， 但是长期的进化过程中，这些原核生物却没有因为但是长期的进化过程中，这些原核生物却没有因为 外源外源DNADNA的入侵而灭绝。的入侵而灭绝。 根据我们刚刚掌握的知识，你能推测这其中的根据我们刚刚掌握的知识，你能推测这其中的 原因吗？原因吗？ 原核生物细胞中的原核生物细胞中的限制酶会将外源限制酶会将外源DNADNA切割掉切割掉，使之失效，以保证自身的安全，使之失效，以保证自身的安全，但是不会切割自身但是不会切割自身的的DNADNA，这是原核生物在长期进化过程中形成的一，这是原核生物在长期进化过程中形成的一套防御机制。套防御机制。 寻根问底寻根问底： 课本知识回顾课本知识回顾 基因工程又叫做基因工程又叫做 或或 。通俗地说，就。通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物是按照人们的意愿，把一种生物的某种的某种 提取出来，加提取出来，加以以 ， 然后放到另一种生物的细胞里，然后放到另一种生物的细胞里， 改造生物的遗传性状。改造生物的遗传性状。 基因拼接技术基因拼接技术 DNA重组技术重组技术 基因基因 修饰改造修饰改造 定向地定向地 DNA 重组技术的基本工具重组技术的基本工具 “分子手术刀”分子手术刀” “分子缝合针”分子缝合针” “分子运输车”分子运输车” 限制（性核酸内切）酶限制（性核酸内切）酶 DNA连接酶连接酶 基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 主要是从主要是从 的一种酶。的一种酶。 识别双链识别双链DNA 分子的某种分子的某种 ，并且使每一条链中并且使每一条链中特定部位特定部位的两个核苷酸之间的两个核苷酸之间的的 断开。断开。 形成两种末端形成两种末端 原核生物中分离纯化出来原核生物中分离纯化出来 特定的核苷酸序列特定的核苷酸序列 磷酸二酯键磷酸二酯键 粘性末端粘性末端 平末端平末端 “分子缝合针”分子缝合针” DNA连接酶连接酶 1、种类：、种类： 2、作用部位：、作用部位： 两类两类 连接黏性末端连接黏性末端 E coli DNA连接酶连接酶 T4 DNA连接酶连接酶 磷酸二酯键磷酸二酯键 连接黏性末端和平末端连接黏性末端和平末端 基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体 通常有三种通常有三种: 作为载体的条件：作为载体的条件： 在进行基因工程操作中在进行基因工程操作中,真正被用作载体的质粒都是真正被用作载体的质粒都是在在 质粒质粒 噬菌体衍生物噬菌体衍生物 动植物病毒动植物病毒 天然质粒天然质粒 人工改造人工改造 的的 能自我复制；有切割位点；能自我复制；有切割位点； 有遗传标记基因；对受体细胞无害、易分离有遗传标记基因；对受体细胞无害、易分离 基础上进行过基础上进行过 2和7能连接形成ACGT TGCA； 4和8能连接形成GAATTC CTTAAG； 3和6能连接形成GCGC CGCG； 1和5能连接形成CTGCAG GACGTC。 教材教材P7思考与探究思考与探究 1 1、在基因工程中，切割运载体和含有、在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的目的基因的DNA片段，需使用（片段，需使用（ ） A. 同种限制酶同种限制酶 B. B. 两种限制酶两种限制酶 C. 同种连接酶同种连接酶 D. D. 两种连接酶两种连接酶 反馈练习：反馈练习： 2、不属于质粒被选为基因运载体的理由是不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制能复制 （ ） B、有多个限制酶切点有多个限制酶切点 C、具有标记基因具有标记基因 D、它是环状它是环状DNA 3 3、下列不适合用于基因工程的运载体、下列不适合用于基因工程的运载体 是（是（ ） A A、质粒、质粒 B B、噬菌体、噬菌体 C C、细菌、细菌 D D、病毒、病毒 4、下列说法正确的是、下列说法正确的是：（：（ ） A、限制酶的切口一定是、限制酶的切口一定是GAATTC碱基碱基序列序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、重组技术所用的工具酶是限制酶、重组技术所用的工具酶是限制酶、 连接酶、运载体连接酶、运载体 D、利用运载体在宿主细胞内对目的基、利用运载体在宿主细胞内对目的基因进行大量复制的过程可称为“克隆”因进行大量复制的过程可称为“克隆” 5. 基因工程是在基因工程是在DNA分子水平上进行设计施分子水平上进行设计施工的工的。在基因操作的基本步骤中在基因操作的基本步骤中，不进行碱不进行碱基互补配对的步骤是基互补配对的步骤是 （ ） A、人工合成目的基因人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达目的基因的检测和表达 6 6、关于限制酶的说法中，正确的（、关于限制酶的说法中，正确的（ ） A A、限制酶是一种酶，只识别、限制酶是一种酶，只识别GAATTCGAATTC碱基碱基序列序列 B B、EcoRIEcoRI切割的是切割的是G GA A之间的氢键之间的氢键 C C限制酶一般不切割自身的限制酶一般不切割自身的DNADNA分子，只分子，只切割外源切割外源DNADNA D D限制酶只存在于原核生物中限制酶只存在于原核生物中 7. （多选）（多选）有关基因工程的叙述中，错误的有关基因工程的叙述中，错误的是（是（ ） A A、基因工程技术能定向地改造生物的遗、基因工程技术能定向地改造生物的遗传传 性状，培育生物新品种性状，培育生物新品种 B B、重组、重组DNADNA的形成在细胞内完成的形成在细胞内完成 C C、目的基因须由运载体导入受体细胞、目的基因须由运载体导入受体细胞 D D、质粒都可作为运载体、质粒都可作为运载体 BD 8.下列四条下列四条DNA分子，彼此间具有粘性末端的分子，彼此间具有粘性末端的一组是（一组是（ ） A B C D 9、以下是两种限制酶切割后形成的、以下是两种限制酶切割后形成的DNA片段，试分析：片段，试分析： GC AATTC GC CTTAA CG G CG G (1)其中和其中和 是由一种限制酶切割形成的是由一种限制酶切割形成的 末端，两者要重组成一个末端，两者要重组成一个DNA 分子，所用分子，所用DNA连接连接酶通常是酶通常是 。 （2） 和和 是由另一种限制酶切割形成的是由另一种限制酶切割形成的 末端，两者要形成重组末端，两者要形成重组DNA片段，所用的连接酶通常片段，所用的连接酶通常是是 。 反馈练习：反馈练习：