浅析疯牛病的研究进展

黑龙江农垦科技职业学院毕业论文 学号：浅析疯牛病的研究进展 学生姓名： 所学专业：畜牧兽医 指导教师： 研究方向：疯牛病研究 黑龙江农垦科技职业学院 2012年 6 月 29 日黑龙江农垦科技职业学院毕业论文（设计）申请表学生姓名学号所学专业畜牧兽医所在系部动物科学系毕业论文（设计）选择题目编号：题目：浅析疯牛病的研究进展系部审批：年月日黑龙江农垦科技职业学院 毕业论文（设计）任务书论文题目 浅析疯牛病的研究进展毕业论文（设计）的要求： 1、在论文(设计)撰写过程中，应体现勤于思考，善于探索，勇于创新的科学精神，要运用所学的理论知识去解释、解决社会现实生活或生产活动中，或个人工作中的实际问题。2、毕业设计应有设计图纸的要求，需要进行试验的，要有试验内容的设计方案，试验数据的采集、整理、分析。3、不可将毕业论文(设计)写成“调查报告”、“工作总结”或主要反映实际现状与问题，缺乏理论深度，与所学专业知识缺乏有机联系的文章形式。4、文字表述。5、除要求签字的地方和论文评语用手写体外，论文其他部分都必须用电子稿件。6、规格主要参与资料：1郑海光，周治江，徐克成，等。疯牛病与人的食肉安全J，肉品安全，1996，(11)：27-282邵翠丽，陈昌海，高式伟，等。疯牛病研究概况J，畜牧与兽医，1996，28(4)：178-1793陈震林，从英国疯牛病中吸取教训，我国的黄牛猝死症应引起政府和社会严重关注J，草与畜杂志，1997，(3)：1-24S Breher，J Novakof ski，疯牛病J，毛玉胜译，黄牛杂志，1997，23(3)：76学 生 （签名） 年 月 日指导教师 （签名） 年 月 日摘要自20世纪80年代中后期英国第1次大规模暴发的疯牛病以来，随后在多个国家也相继出现疯牛病病例，疯牛病严重影响着各国经济贸易的发展，并且严重威胁着人类的生活健康。分析疯牛病的临床特征、病原学、发病机理，以为疯牛病的防治提供参考。 关键词：疯牛病；病原学；发病机理目 录1前 言12 疯牛病的发展历史13 临床表现24病原学及其致病机理24.1朊蛋白的基因结24.2朊蛋白(PrPC)与朊毒体(PrPSC)的比较24.3PrP的多态性34.4PrPSC的神经毒性研究44.5异常朊蛋白(PrPSC)的形成和增殖5参考文献6致 谢7101前 言 疯牛病(BSE)是一种传染性海绵状脑病(Transmissible spongiform encephalopathies，TSE)，是由正常朊蛋白(PrPC)异构为异常朊蛋白(PrPSC)而引起的发生于一些哺乳动物的一种致死性神经退行性疾病。羊痒病(SC)是第1个被认识的朊毒体病，之后人们在动物上相继发现了牛海绵状脑病(即疯牛病)(BSE)、传染性水貂病(TME)、杂种鹿和驼鹿的慢性消瘦病(CWD)和猫海绵状脑病(FSE)。现已发现的人类朊毒体病有克雅氏病(CJD)、新克雅氏病(NCJD)、库鲁病(Kuru-Disease)、格斯特曼综合症(GSS)和致死的家族性失眠症(FFI)。 2 疯牛病的发展历史 动物的海绵状脑病在很早就有记载，18世纪中叶羊痒病(Scrapie)在欧洲被观察到。1986年，疯牛病最先在英国暴发。据OIE官方统计，至2008年9月，英国共确诊BSE病牛达184575头，在1993年达到最高峰1。尽管目前疯牛病发病机理尚未完全清楚，但人们普遍认为是牛食用染有羊痒病毒的肉骨粉饲料而引发疯牛病。随着肉骨粉在养殖业的停止使用，现在每年的暴发数量呈下降趋势。由于很多国家，特别是欧盟国家都曾从英国进口活牛或肉骨粉等饲料产品，这就使疯牛病不仅仅只在英国暴发。1989年，疯牛病第1次出现在英格兰以外的国家冰岛。尽管疯牛病在这些国家的传播速度远逊于英国，但到2008年时，欧洲共21个国家出现疯牛病(包括英国)，美洲的美国和加拿大也出现。2001年，疯牛病第1次出现在非欧美洲国家日本。尽管各国均采取强有力的政策措施控制疯牛病的传播。但目前,欧洲、北美洲、亚洲都不同程度上出现疯牛病,疯牛病的暴发风险并没有完全消失23 临床表现医学家们发现BSE的病程一般为1490d，潜伏期长达46年。这种病多发生在4岁左右的成年牛身上。其症状不尽相同，多数病牛中枢神经系统出现变化，行为反常，烦躁不安，对声音和触摸尤其是对头部触摸过分敏感，步态不稳，经常乱踢以致摔倒、抽搐。发病初期无上述症状，后期出现强直性痉挛，粪便坚硬，两耳对称，性活动困难，心搏缓慢(平均50次/min)，呼吸频率增快，体重下降，极度消瘦，以致死亡。经解剖发现，病牛中枢神经系统的脑灰质部分形成海绵状空泡，脑干灰质两侧呈对称性病变，神经纤维网有中等数量、不连续的卵形和球形空洞，神经细胞肿胀成气球状，细胞质变窄3。另外，还有明显的神经细胞变性及坏死。 4病原学及其致病机理4.1朊蛋白的基因结正常朊蛋白主要分布在动物神经元细胞表面，是机体正常表达的一种铜结合糖蛋白，由单拷贝染色体基因的单一外显子编码4。人类、小鼠和牛编码的PrP基因分别位于第20、2、13 号染色体上。研究发现，朊蛋白的作用可能与神经系统的维持有关。PrPC敲除试验表明,除去PrPC的动物，可导致与昼夜节律有关的行为异常。另外，已发现PrPC具有类似Cu/Zn-SOD的活性，可清除超氧自由基；PrPC可调节胞内钙平衡，PrPSC侵染的细胞内可发生钙紊乱。另外，朊病毒的神经毒性片段106126可与细胞膜上特定的离子通道相互作用,引发膜内外电位变化，从而打破胞内外钙离子浓度的平衡。4.2朊蛋白(PrPC)与朊毒体(PrPSC)的比较正常表达的朊蛋白(PrPC)构象的二级结构中螺旋占42%、折叠占3%；而异常构象朊蛋白的螺旋占3%、折叠占43%，具有强致病性。PrPC和PrPSC的一级结构没有差别，正常动物脑中只有PrPC没有PrPSC，PrPC和PrPSC间由螺旋向折叠的转变即朊病毒蛋白的形成过程。致病性朊粒对一些理化因素的抵抗力非常强，大大高于已知的各类微生物和寄生虫，加热到360仍有感染力，植物油的沸点为160170，不足以灭活病原，患病牛的脑组织匀浆，经134138高温维持1h后，动物实验仍有感染力。且还耐甲醛、耐强碱，患病牛的脑组织能耐受1.2 mol/L的氢氧化钠达2 h。正常朊蛋白可以被蛋白酶K分解，但患病牛大脑中的这种蛋白结构发生改变，并聚集成淀粉样的纤维杆状结构，因而不能被蛋白酶分解。变构异常蛋白会凝聚在一起，沉积在大脑中，引起神经细胞退行性病变5。4.3PrP的多态性 研究发现一些朊病毒基因突变与朊病毒疾病的自发性、潜伏期长短及抵抗性有关。特别是在人类中，虽然大部分朊病毒疾病是散发性的，但大约有10%是与朊病毒基因突变有关的家族性朊病毒疾病，如GSS病、致死性家族失眠症、家族性克雅氏症等。 人的遗传性朊病毒病和PrP基因的点突变有关。PrP102位ProLeu突变是第1个被确定与GSS自发产生有关的突变，后来又相继发现一些突变，如105位ProLeu突变，117位AlaVal突变，198位PheSer突变，217位GlnArg突变，这些突变与GSS的自发产生并形成遗传性有关。145位密码子突变成终止密码子，这一琥珀型突变导致合成一个截短型的PrP分子，这和非典型形式的GSS相关，这种GSS临床过程像阿尔兹海默症（Alzheimer），200位GluLys突变，210位ValIle突变，232位MetArg突变与散发性和家族性克雅氏症形成有关；178位AspAsn突变与致死性家族失眠症形成有关；而129位MetVal突变是一个多态性位点,本身并不引发疾病,只是协同178位AspAsn突变引发疾病。 绵羊PrP开放阅读框的几个多态性和朊病毒病的表现型差异相关，如潜伏期、病理和临床症状。绵羊PrP氨基酸的多态性位于112(MetThr)、136(AlaVal)、137(MetThr)、138(Ser Asn)、141(LeuPhe)、151(ArgCys)、154(ArgHis)、171(GlnHis或GlnArg)和211(ArgGln)。山羊PrP氨基酸在密码子142(IleMet)、143(HisArg)240(SerPro)具有二态性。只有密码子142(IleMet)和疾病的潜伏期有关。绵羊PrP在171位的Arg/Glu多态性可能与羊痒病潜伏期调控相关。而基因型AA136、RR154、RR171对自然、实验感染痒病及BSE具有抗性。 人的遗传性朊病毒病也和插入性突变有关。PrP基因插入突变由1到9个，但没有插入3个的，额外的八肽(octapeptide)重复序列，插入位置在PrP基因的5191密码子之间。正常的这个区域由1个九肽(nonapeptide)(R1)接着4个八肽(R2,R2,R3,R4)组成：pqggggwgqphgggwgqphgggwgqphgggwgqphgggwgq，它们有相似的氨基酸序列，但可从DNA序列的变异来区分。有报道称519个额外的八肽重复意味着朊病毒病常染色体的显性遗传方式和很多的不同表型。相反，1、2或4个的额外插入通常表现为典型的CJD。这种类型突变的患者通常没有神经失调的家族病史。PrP基因14个额外的八肽重复序列的插入突变引起的CJD，主要在60岁后发病，病程发展迅速，最后在几个月内死亡。对于羊言，PrP的八肽重复仅有3个而不是通常的5个的变异，这和绵羊、山羊痒病的潜伏期变长有关。牛PrP基因包含5或6个短的，富含GC的序列编码八肽PHGGGWG或更长的变式：PQ/HGGGGWG重复序列。在Goldmann报道的12头牛中，有8头富含Gly八肽的6拷贝纯合基因(66)，4头杂合子(65)。有2例BSE是纯合子(66)形式。Goldmann等报道的山羊PrP八肽基因只有3个重复，它们编码短肽复为：ProGln/HisGlyGlyGly(Gly)Trp/GlyGln，并在102位密码子，由编码Gly的密码子置换成Trp的密码子。这些山羊至少在4年内未见有疾病症状。小鼠和仓鼠的PrP基因也都含有多个拷贝的GC重复序列，且都缺乏TATA框。这些GC九聚体作为一个模体,可能是转录因子SP1的结合位点6。4.4PrPSC的神经毒性研究TSE的共同病理学特征是神经纤维网的空泡化，严重的神经胶质过多症，神经元变性。通常在患传染性海绵状脑病的动物脑部都可以看到正常细胞PrPC的异构体PrPSC的大量积聚。PrPC是一个广泛的膜蛋白，其高度集中在中枢神经系统的神经元和神经胶质细胞上，但对其功能了解的还不是很清楚。PrPC病理异构体PrPSC仅能被蛋白酶部分地降解，产生一个蛋白酶抗性、27-30Kda大小(PrP27-30)的核心肽段，PrP27-30聚合成棒状纤维并聚集于神经组织，通过引发激活凋亡程序和星形胶质细胞增生，导致神经元死亡。虽然PrPSC被认为是TSE传染和致病因PC素，但是那些缺乏PrPSC积聚的自然病例和实验病例的现象表明，PrPSC在大脑中的沉积不是神经变性所必需的因素，而且将PrPSC制备物注射到PrP基因敲除鼠大脑内不引起该鼠致病和神经元的损害，这些试验结果揭示PrPSC无直接的毒性，并支持TSE的病理发展需要PrPC和PrPSC 2皮质神经细胞和小脑神经细胞凋亡以及对胶质神经细胞发挥营养作用，特别是和P种蛋白构象存在的说法。尽管对PrPSC神经毒性已进行很多方面的研究，但其致病机理还没有完全弄清。但近年来，利用PrP106-12PrP118-135作为模型对PrPSC神经毒性机制的研究已取得一些成效。 PrP106-126相应于人Pr序列106-126残基KTNMK HMAGAAAAGAVVGGLG，这是一段高度保守和无结构区域7。PrP106-126被认为是主要负责PrPC的纤维状结构转变的区段。这个肽段已被证明是揭示PrPSC毒性机制的合适工具，因为其在体外具备PrPSC的大部分病理特征，PrP106-126在体外倾向于聚集成-折叠结构，形成淀粉样纤维，并具有部分的蛋白酶抗性。而且有报道称，该肽能诱导原代培养的海马神经元、rPSC一样通过调控电压敏感性钙离子通道，Caspase(半胱氨酸天冬氨酸裂解酶，Cysteinerequiring Aspartate protease)和P38有丝分裂原激活蛋白(mitogenactivated protein，MAP)激酶活性导致凋亡细胞死亡。而且神经细胞和胶质细胞能吸收该肽，以及PrP106-126对不表达细胞PrP来源的神经元没有毒性，这说明该肽段的毒性能够反映TSE PrPSC的致病机制，这样PrP106-126成为研究朊蛋白依赖性神经细胞毒性的合适模型。 PrP106-126活性由其疏水域调控。当其疏水端变异后，PrP106-126变异体的-折叠含量和细胞毒性均有显著的下降。PrP106-126序列的114和119位置的甘氨酸是该肽微纤维生成的主要决定因素。Gly114和Gly119被丙氨酸取代(PrP106-126AA)后，该肽的灵活性降低，导致可溶性结构肽的形成，而且PrP106-126AA片段在与成神经瘤细胞一起孵育时,会像野生型PrP106-126神经毒性原纤维中间体一样具有很高的神经毒性8。4.5异常朊蛋白(PrPSC)的形成和增殖1997年Stanley Prusiner在疯牛病的研究中提出疯牛病的传染完全是朊蛋白的作用而没有其他基于RNA或DNA的作用,提出“蛋白质唯一论”,显然这与通过DNA或RNA的作用实现传染的传统概念截然不同。“蛋白质唯一论”的实质就是疯牛病的传染是通过信息从异常朊蛋白流向正常蛋白的过程。 目前有2种模式来解释PrPSC生成过程9:一是模板介导的转换过程，即重折式:PrPC变成PrPSC的过程是一个解折叠与重折叠的过程，需要很高的能量,通常是不会发生。PrPC发生某些变异后，能以极低的频率(1/106)转变成PrPSC，这就是家族性CJD发生的原因。外源性PrPSC能促进PrPC向PrPSC的转变，并在此过程中充当模板，此外还需要一种酶或称伴侣蛋白的参与，以降低能量需要。二是核依赖的聚合过程即种子模型或结籽模PrPSC与PrPSC存在一种不对称的平衡状态，强烈偏向PrPC方向；只有当PrPSC结合到多聚PrPSC形成的晶体“种子”上，才具有稳定性。自然条件下“种子”的形成是小概率事件，然而一旦出现，就会加快单体PrPSC的凝聚(表面积加大的原因)。大量外源性PrPSC的进入，有利于种子的形成，从而促进大量内源性PrPSC的产生与聚集，甚至形成不同的淀粉样纤丝。 PrPSC生成的前提条件是存在PrPC与PrPSC之间的相互作用。在体外转换试验中，PrPSC可诱导35S标记的PrPC向类似PrPSC的结构变化。转换效率依赖于加入PrPSC的浓度、时间等。重组朊蛋白PrPC的解折叠和再折叠过程也为PrPSC生成提供有益的信息。中性条件下，PrPC折叠符合双态折叠模式。但在酸性条件下,检测到含-折叠的中间体。在另一方面，发现在酸性和还原条件下可形成富含-折叠、对蛋白酶消化具有抵抗能力的单体形式。 关于朊毒体的增殖,比较合理的解释就是“晶种学说”10，基本内容就是PrPSC可以与PrPC形成一种聚合体,由于结合导致PrPC的空间结构发生改变，导致其螺旋减少,更多的变成-折叠，然后聚合体一分为二，变成2个PrPSC。这种反应具有厄尔尼诺效应，已发生转变的分子又可使其他正常分子发生转变。虽然起初随机反应可能达不到致病作用，一旦出现此类转变之后，会发生自动催化反应,使PrPSC呈指数形式剧增，最后使动物体发病。参考文献1郑海光，周治江，徐克成，等。疯牛病与人的食肉安全J，肉品安全，1996，(11)：27-282邵翠丽，陈昌海，高式伟，等。疯牛病研究概况J，畜牧与兽医，1996，28(4)：178-1793陈震林，从英国疯牛病中吸取教训，我国的黄牛猝死症应引起政府和社会严重关注J，草与畜杂志，1997，(3)：1-24 方元，朊病毒及朊病毒的研究进展(一) J，中国兽医科技，2000，30(1)：17-20 5 刘健平，尹畅，尹革芬，阮病毒研究进展J，动医学研究进展，2000，21(3)：14-176 张春杨，赵宏坤，牛海绵状脑病J，预防兽医学进展，2001，3(1)：34-367桑田俊，浅议疯牛病J，黄牛杂志，1997，23(1)，68-698S Breher,J Novakof ski，疯牛病J，毛玉胜译，黄牛杂志，1997，23(3)：769沈咏舟，夏春珍，刘荣芝，等。疯牛病及相关疾病的研究进展J10康文彪，李元新，董碧兰，等。牛海绵状脑病研究概况J11盘宝进，牛海绵状脑病近况简介J，贵州畜牧兽医1997，21(2)：18-19致 谢在此，衷心感谢动物科学系的领导和老师的关怀与帮助，感谢黑龙江农垦科技职业学院对我的培养和支持。 在此论文完稿之际，再次向我的导师和所有关心帮助过我的老师、同学和朋友们表示最诚挚的谢意！黑龙江农垦科技职业学院毕业论文（设计）评语论文题目浅析疯牛病的研究发展指导教师评语:指导教师签字:年 月 日评审委员会评语: 评审委员会专家签字:年 月 日最后成绩: