第21章基因治疗

,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,2024/12/3,1,基因治疗,第二十一章,2,2024/12/3,第一节 基因治疗的策略和基本程序,第二节 基因治疗中的病毒载体,第三节 基因治疗的临床应用,第四节 基因治疗的现状,3,2024/12/3,基因治疗（,gene therapy,）,通过一定方式将人正常或野生型（,wild type,）基因或有治疗作用的,DNA,片段导入人体靶细胞以矫正或置换致病基因的治疗方法,4,2024/12/3,第一节 基因治疗的策略和基本程序,一、,基因治疗的策略,二、,基因治疗的一般程序,三、,基因治疗中基因导入的方法,5,2024/12/3,一、基因治疗的策略,1,.,致病基因的原位置换,用正常的基因置换染色体上的致病基因。但目前基因定向同源重组的技术还不能达到理想的效果。,6,2024/12/3,2,.,基因的异位替代,在体外将正常基因转移到患者的宿主细胞，只要求治疗基因能够替代致病基因在体内表达出功能正常的蛋白质。是目前基因治疗的主要策略。,3,.,直接抑制有害基因的表达,已知某一疾病基因，可向患者体内导入某一抑制该基因的基因或有抑制该基因作用的核酸。或借助生物技术（反义,RNA,、,siRNA,、核酶等）抑制或封闭该疾病基因的,mRNA,的功能。,7,2024/12/3,4,.,增强机体免疫能力的基因治疗,将抗体或细胞因子的基因导入肿瘤细胞以激活体内免疫细胞的活力。,8,2024/12/3,二、基因治疗的一般程序,1.,治疗基因的选择,细胞内的基因在理论上均可用于基因治疗。可有针对性地进行选择。,9,2024/12/3,2,.,将治疗性基因转入细胞内,基因转移系统,基因转移的非病毒方法,(,物理方法和化学方法,),。,基因转移的病毒方法。,10,2024/12/3,3,.,基因治疗的靶细胞,体细胞,包括：,病变组织细胞,正常的免疫功能细胞,1,）（,hematopoietic stem cells,）,骨髓中具有高度自我更新能力的、能永久重建造血的细胞，同时它能进一步分化为其他血细胞，并能保持基因组,DNA,的稳定,造血干细胞,2,）肌细胞,胞内的溶酶体和,DNA,酶含量也很低，质粒,DNA,以环状形式在胞浆中存在不整合入基因组,DNA,，能在肌细胞内较长时间保留,11,2024/12/3,成功用于基因治疗的靶细胞,靶 细 胞,优 点,缺 点,造血干细胞,自我更新能力和分化能力。最有前途的靶细胞之一。,骨髓中含量低，难以获得足够的量,皮肤成纤维细胞,来源广，易扩增培养，易于移植,。,可以稳定表达一段时间,肌细胞,易于吸收，肌细胞内的溶酶体和,DNA,酶含量很低。适合,DNA,疫苗治疗。,12,2024/12/3,三、基因治疗中基因导入的方法,(,一,),非病毒导入法,直接注射法,脂质体转染法,优点,不会整合入靶细胞的基因组中,缺点,易在靶细胞中降解,13,2024/12/3,1,.,直接注射法,将含有裸,DNA,（质粒）的溶液直接注射入肌肉组织,优点,可持续表达几个月至一年,缺点,仅限于在肌肉组织,需要注射大量的,DNA,转入效率低,14,2024/12/3,2,.,电穿孔法,用高压脉冲电场在细胞膜上打孔将,DNA,导入靶细胞。,影响转染效率的主要因素,电脉冲强度,持续时间,15,2024/12/3,3.,脂质体法,(liposome,）,脂质体与,DNA,形成复合物通过内吞作用进,入细胞,4.,阳离子多聚体,阳离子聚胺与阴离子,DNA,形成复合物，与细胞表面带负电荷的受体结合，通过内吞作用进入细胞,16,2024/12/3,（二）,病毒载体导入法,病毒的特点,靶细胞定向感染性,宿主细胞寄生性,野生型病毒改造的原则,保留感染性,去除致病性,17,2024/12/3,第二节 基因治疗中的病毒载体,一、逆转录病毒载体,二、腺病毒载体,三、,主要病毒载体的特点比较,四、存在的主要缺点,18,2024/12/3,一、逆转录病毒载体（,retrovirus,）,1,.,基因组,19,2024/12/3,2,.,特点,来源,莫罗尼氏鼠白血病病毒（,MoMuLV,),感染范围,鼠、人和其它动物细胞,感染方式,通过外膜蛋白与靶细胞表面的磷酸,转运载体结合,而感染进入细胞,20,2024/12/3,专一性,取决于病毒颗粒膜糖蛋白,Env,和靶细胞膜表面的受体相互作用。,可以将病毒外膜糖蛋白进行各种不同的修饰，以改变其,专一,性。,分类：,单嗜性（,ecotropic,）病毒：仅能感染小鼠细胞,双嗜性（,amphotropic,）病毒：能感染小鼠和其,他动物细胞,兼嗜性（,dualtropic,）病毒：能感染多种不同种,属的动物细胞。,21,2024/12/3,逆转录病毒载体介导的基因治疗的流程,将治疗基因克隆到逆转录病毒载体中,筛选转化细胞,转化细胞培养,从上清中获得重组病毒颗粒和纯化,感染靶细胞。,22,2024/12/3,二、,腺病毒载体,DNA,病毒。根据其凝血特性分为,A-F 6,个亚类，其中,C,亚类的,2,型和,5,型腺病毒（,Ad 2,和,Ad 5,）在人体内基本上不致病，故可作为基因治疗用载体。,优点,基因转移效率较高,治疗基因瞬时水平表达高,23,2024/12/3,三、主要病毒载体的特点比较,逆转录病毒,(RV),慢病毒,(HIV,、,FIV,等,),腺病毒,(Ad),腺相关病毒,(AAV),单纯疱疹病毒,(HSV),基因组大小,(kb),8,11,9.2,9.7,35,4.6,152,核酸类型,RNA,RNA,DNA,DNA,DNA,外源基因容量,约,10kb,约,10kb,7,8kb,约,4kb,可达,30kb,重组病毒滴度,较高,较高,非常高,高,相对低,靶细胞状态,分裂期细胞，表面须有特殊受体,分裂期细胞及非分裂期细胞,分裂期细胞及非分裂期细胞,分裂期细胞及非分裂期细胞,分裂期细胞及非分裂期细胞，嗜神经性,基因整合,随机整合,随机整合,不整合,定点整合,不整合,外源基因表达情况,瞬时表达,/,稳定表达,瞬时表达,/,稳定表达,瞬时表达,稳定表达,瞬时表达,24,2024/12/3,四、存在的主要缺点,宿主谱窄,基因导入效率低,外源基因表达不够长期稳定,表达缺乏有效调控,感染的靶向问题,毒性问题,25,2024/12/3,第三节 基因治疗的临床应用,一、恶性肿瘤,二、心脑血管性疾病,三、遗传性疾病,四、艾滋病,26,2024/12/3,一、恶性肿瘤,1,.,恶性肿瘤发病的分子机制,原癌基因和抑癌基因的相互作用失衡,肿瘤细胞逃逸了免疫监视,细胞信号转导异常,27,2024/12/3,2,.,治疗,策略,1,),抑制和杀伤肿瘤细胞,自杀疗法,抑制癌基因的表达,恢复抑癌基因的功能,抗肿瘤血管生成,28,2024/12/3,2,),肿瘤细胞的基因修饰,导入细胞因子基因,导入,MHC,基因和共刺激分子基因,29,2024/12/3,3,),调节和增强机体的免疫功能,细胞因子基因导入免疫细胞,基因修饰的树突状细胞,分泌免疫毒素的,T,淋巴细胞,肿瘤,DNA,疫苗,30,2024/12/3,二、心脑血管性疾病,1,.,单基因遗传病,类型,家族性高胆固醇血症,遗传性扩张型心肌病,肥厚型心肌病,长,Q-T,综合征,遗传性心肌营养不良,31,2024/12/3,特点,发病率低,基因治疗的靶基因明确,效果较好,32,2024/12/3,2,.,多基因心血管病,类型,高血压,动脉粥样硬化,心肌肥厚,心功能不全,发病率高,发病的分子机制尚不清楚,基因治疗效果差,特点,33,2024/12/3,三、遗传性疾病,腺苷脱氨酶（,ADA,）缺陷病,病 因,ADA,缺陷重症联合免疫缺陷症,（,SCID,）,治疗靶细胞,骨髓干细胞,治疗载体,逆转录病毒,人类历史上第一种应用基因治疗的疾病,34,2024/12/3,-,地中海贫血,病 因,-,珠蛋白表达失衡，溶血型贫血。,治疗靶细胞,造血干细胞。,载 体,阳离子脂质体，逆转录病毒，,腺相关病毒。,35,2024/12/3,四、艾滋病（,AIDS,）,治疗策略,反义核酸与核酶（,rev,gag,nef,）,病毒,mRNA,二级结构类似物（,TAR,、,RRE,竞争性,结合调节蛋白,Tat,、,Rev,）,细胞内抗体（,gp120,抗体）,HIV,突变蛋白,清除,HIV,感染细胞（免疫毒素、,IFN-,、自杀,基因）。,36,2024/12/3,第四节 基因治疗的现状,一、基因治疗临床试验研究现状,二、安全性,三、,基因治疗的前景,37,2024/12/3,一、基因治疗临床试验研究现状,基因治疗的范围,从单基因遗传病,多种临床疾病,所用基因类型,单基因,多基因（,14.2%,）,38,2024/12/3,所用的靶细胞,多为自体细胞,少为经过修饰的异体细胞,基因导入系统,病毒载体系统：,逆转录病毒居首位，腺病毒次之,非病毒载体系统：,脂质体居首位,39,2024/12/3,基因导入途径,瘤内注射（,34.8%,）,皮下注射,肌肉注射,静脉注射,其他,治疗病种分布,癌症居首位，感染性疾病次之,40,2024/12/3,二、基因治疗的安全性,反转录病毒载体：,有致瘤、致畸的可能性，受到,限制,腺病毒载体：,具有更好的安全性，,受到重视,41,2024/12/3,基因治疗临床试验阶段,期临床,（,51.6%,）,期临床,（,14.5%,）,期临床,（,7.2%,）,基因治疗开展最好的国家,美国（占全部基因治疗病人的,60.4%,）,42,2024/12/3,三、基因治疗的前景,展望,从实验室,临床，逐步走向成熟,是一个极有希望和发展前景的领域,存在的问题,缺乏高效特异的基因导入系统,缺乏调控基因表达的方式,43,2024/12/3,基因治疗一览图,