神经干细胞对颅脑海水浸泡伤的神经修复作用研究研究学习ppt课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,神经干细胞对颅脑海水浸泡伤,的神经修复作用研究,神经干细胞对颅脑海水浸泡伤,神经干细胞对颅脑海水浸泡伤的神经修复作用研究研究学习ppt课件,颅脑海水浸泡伤,海战,海难,海上意外,功能损害,神经干细胞,治疗,颅脑海水浸泡伤海战海难海上意外功能损害神经干细胞,主要研究内容,神经干细胞培养,及诱导分化,海水浸泡脑损伤模型,及炎症反应,立体定向神经,干细胞移植,GABA,NSCs,NSCs,injury,主要研究内容神经干细胞培养海水浸泡脑损伤模型立体定向神经GA,神经干细胞培养及诱导分化,利用流产胚胎胎脑，加入,bFGF,EGF,等生长因子，培养出神经干细胞，并经过增殖，传代获取相应神经干细胞球。经,nestin,鉴定证实。,神经干细胞培养及诱导分化利用流产胚胎胎脑，加入bFGF,E,GABA,能神经元的诱导分化,利用,Anti-Hes1,寡核苷酸链抑制,Hes1,基因的表达，藉此提高,GABA,神经元的诱导分化率。,对照组,为含,胎牛血清的普通诱导分化液,，,实验组,除加入,“,抑制Hes1基因,”,的寡核苷酸链,外，其余成分同对照组相同。待诱导分化结束后分别对实验组及对照组进行GABA能神经元免疫荧光染色鉴定。,H,es1,蛋白通过抑制proneural基因（原神经基因）的表达以维持神经干细胞状态,通过相应的 RNAi 抑制 Hes1 的表达可以解除对pron,eural,的抑制作用，促进神经元分化,Anti-Hes1,胎牛血清,GABA能神经元的诱导分化利用Anti-Hes1寡核苷酸链抑,诱导分化结果,实验组,诱导分化后第,6,天，约半数以上细胞开始分化并出现汇聚现象，重新消化接种，第,14,天镜下可见,90%-95%,细胞已贴壁完成分化。如图所示为经,Hes1,基因抑制因子及胎牛血清的共同诱导下成功诱导分化出,GABA,能神经元细胞，该诱导方法操作简便，诱导分化率达,64.0%,。免疫荧光染色鉴定，,GABA,细胞形态清晰。,对照组,诱导分化率为,16.6%,6D(20*10),14D(20*10),对照组,(10,*,40),实验组,(10,*,40),诱导分化结果实验组诱导分化后第 6 天，约半数以上细胞开始分,海水浸泡颅脑损伤的炎性反应,大鼠模型的建立,大鼠麻醉后固定于立体定位仪上，参照大鼠脑立体定向图谱于前囟后,2.0mm,，正中线旁开,3.5mm,为中心，,5mm,为直径，牙科钻磨除颅骨，暴露硬脑膜。以,40g,砝码、,20cm,高度,自由下落打击硬脑膜。,海水浸泡组,损伤后局部,海水浸泡,45,分钟,，清除伤口周围血肿并缝合切口。,单纯损伤组,仅开骨窗。,损伤评估：,mNSS8,分，属重度颅脑损伤。,自由落体致伤,海水浸泡,海水浸泡颅脑损伤的炎性反应大鼠模型的建立自由落体致伤,致伤后,24,小时，单纯损伤组轻偏瘫，海水浸泡组偏瘫明显,致伤后24小时，单纯损伤组轻偏瘫，海水浸泡组偏瘫明显,炎症反应,神经炎症反应的主要参与者包括炎症介质和炎症细胞。脑内最主要的炎症细胞即,小胶质细胞,，脑损伤后血脑屏障被破坏，血液中的免疫物质进入脑组织形成炎症反应并激活小胶质细胞，触发中枢免疫反应。因此小胶质细胞是神经炎症反应的关键。作为吞噬细胞的小胶质细胞对植入的干细胞可能会有损伤作用，而诸多研究中关于细胞移植时间也从损伤后,2,小时至,7,天不等，因此干细胞移植治疗的最佳时间是一个非常值得探究的问题。,在血脑屏障未遭破坏的情况下，外周巨噬细胞几乎不能透过血脑屏障进入中枢神经系统，小胶质细胞则行驶免疫保护，监视作用。但当脑损伤后血脑屏障被破坏，外周大量,巨噬细胞,进入大脑，吞噬退行性神经细胞。,在此次研究中我们对创伤性脑损伤海水浸泡后不同时段脑出血，水肿（,HE,染色）及,小胶质细胞,以及,巨噬细胞,（,DAB,染色）聚集活化的情况进行观察，探究创伤性脑损伤海水浸泡后神经炎症的病理改变，并希望藉此对干细胞移植治疗最佳时间的研究给予一定的帮助,。,炎症反应神经炎症反应的主要参与者包括炎症介质和炎症细胞。脑内,海水浸泡组,/,空白对照组,浸泡组,/,空白组,24h,浸泡组,48h,浸泡组,72h,浸泡组,96h,灌注取脑,组织切片,HE,染色,DAB,染色,海水浸泡组/浸泡组/浸泡组浸泡组浸泡组灌注取脑HE染色DAB,大鼠损伤出脑组织,HE,染色结果,ABCDE,分别为空白对照及干预后,24h,、,48h,、,72h,及,96h,损伤处脑组织病理改变（,HE:10*4,）,abcde,则分别为相应条件下高倍镜下损伤处脑组织病理改变,（,HE:10*40),大鼠损伤出脑组织HE 染色结果ABCDE 分别为空白对照及干,小胶质细胞,DAB,染色结果（,CD11b/c,）,ABCDE,分别为空白对照及干预后,24h,、,48h,、,72h,及,96h,损伤脑组织,CD11b/c(OX42),表达的荧光显色（,DAB,：,0*10,）,abcde,则分别是相应条件高倍镜下（,DAB:10*40,）表现,小胶质细胞DAB 染色结果（CD11b/c）ABCDE 分别,小胶质细胞,在损伤早期即以开始活化，且进行吞噬活动。而小胶质细胞所行使的吞噬作用对新移植至脑内的细胞尤为关键，所以避开小胶质细胞聚集活化的高峰期，对细胞移植治疗的效果影响极大。,实验针对小胶质细胞数目随时间的变化进行观察，发现海水浸泡脑损伤后,48,小时细胞大量聚集于损伤脑组织内，有多处细胞呈多层分布，并可见明显的吞噬行为。,72-96,小时细胞数目逐渐减少，密度降低，细胞吞噬行为明显减少。说明小胶质细胞在,72,小时内数量已达高峰，,96,小时后已大量减少。,CD11b/c+,细胞在各组的实际分布密度直方图,四个组两两比较均有明显差别：,P0.01,小胶质细胞在损伤早期即以开始活化，且进行吞噬活动。而小胶质细,巨噬细胞,DAB,染色结果（,CD68,）,abcde分别为空白对照组，干预后,24h,、,48h,、,72h,及,96h,损伤处脑组织CD68高倍镜下的表现（DAB:10*40）,巨噬细胞DAB 染色结果（CD68）abcde分别为空白对照,结论,大鼠脑损伤后,48-72,小时,神经炎症反应最为强烈，损伤处血细胞增多，水肿不断加重，,小胶质细胞,不断聚集、活化，外周,巨噬细胞,透过血脑屏障进入受损区域。高倍荧光显微镜下可见此时间段小胶质细胞数量达高峰，并有明显的吞噬行为。,72-96,小时脑出血及水肿情况逐渐稳定，小胶质细胞及,巨噬细胞,数量减少。,海水浸泡脑损伤后,96,小时,，脑出血及脑水肿等炎症表现已不再继续加剧，小胶质细胞数量也明显减少，适于进行干细胞移植治疗。,结论,立体定向神经干细胞移植,实验分组：,1.,空白对照组：去骨瓣，不进行损伤,2.,实验对照组：单纯损伤组,3.,单纯干细胞移植治疗组,4.,干细胞联合,GABA,能神经元细胞移植治疗组,GABA,NSCs,NSCs,injury,立体定向神经干细胞移植实验分组：GABANSCsNSCsin,细胞治疗的行为学研究,-5,-3,0,3,7,14,21,30,建立损伤模型,行为学观察,-7,行为学：,mNSS,评分，偏瘫实验，水迷宫,行为学观察,行为学观察,+,组织切片,进行立体定向细胞治疗,行为学观察,+,组织切片,行为学观察,+,组织切片,行为学观察,+,组织切片,行为学观察,+,组织切片,细胞治疗的行为学研究-5-3037142130建立损伤模型行,神经功能学评分（,mNSS,）,6,分：轻度损伤,6-12,分：中度损伤,12-18,分：重度损伤,神经功能学评分（mNSS）6分：轻度损伤,偏瘫实验,目的：观察大鼠两侧前肢贴壁次数,时间：,5,分钟,方法：将大鼠置于透明盒内，任其自由活动。,大鼠会在透明盒内进行探索性活动，并,用相机记录。,偏瘫实验目的：观察大鼠两侧前肢贴壁次数,水迷宫实验,目的：,1.,观察大鼠寻找平台的时间,2.,到达平台所经过的路程比,3.,平台所在象限的潜伏期,时间：,60s,方法：参照,Morris,水迷宫获得性训练,及实验方法。,损伤前,损伤后,水迷宫实验目的：1.观察大鼠寻找平台的时间损伤前损伤后,实验结果,mNSS,偏瘫实验,Morris,水迷宫,进行细胞移植后，各治疗组与对照组比较有显著差异，且,14d,时皮层组与皮层加海马组亦出现显著差异。,进行细胞移植后，各治疗组与对照组比较有显著差异，且,21d,时皮层组与皮层加海马组亦出现显著差异。,进行细胞移植后，各治疗组与对照组比较有显著差异，但两个治疗组观察期内未出现显著差异。,行为学研究,实验结果mNSS偏瘫实验Morris水迷宫进行细胞移植后，各,10,部分免疫组化染色,立体定向细胞移植,5,天后抗人核抗体免疫组化染色,Anti-human Nuclear,10*20,Anti-human Nuclear,10*20,Anti-human Nuclear,10*40,10部分免疫组化染色立体定向细胞移植5天后抗人核抗体免疫组化,小结,细胞培养,损伤模型,细胞移植,效果观察,神经干细胞培养,GABA,诱导分化,炎症反应,水迷宫,mNSS,偏瘫实验,组织切片,小结细胞培养损伤模型细胞移植效果观察神经干细胞培养GABA诱,THANKS,THANKS,