生物分离技术综合实验

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,生物分离技术综合实验,植物色素提取、分离及定量与初步鉴定,实验一、植物色素的制备,一、实验目的,:,了解有机溶剂提取目的物质（植物色素）的过程与注意事项。并了解目的物质提取过程中的主要影响因子及其相互关系。,二 实验原理：,用有机溶剂法从原料中提取黄酮类成分,利用黄酮类物质在热乙醇中溶解度较高,将其提取出。,实验一、植物色素的制备,三、仪器,高速干粉粉碎机、恒温水浴锅、烧杯试管若干、中低速离心机、过滤装置,（漏斗和滤纸），,250ml,磨口椎形瓶,6,个,/,每组；,10ml,容量瓶,4,个,/,组。,四、试剂,配,40%,（,80ml/,组）、,70%,（,450 ml/,组）的乙醇，,10,硝酸铝溶液,50ml/,组，,5,亚硝酸钠,50 ml/,组,质量分数,4.3,氢氧化钠,200 ml/,组。,实验一、植物色素的制备,五、操作,1,、不同,浸提剂浓度,对黄酮提取率的影响,1.1,取干粉原料,15,克，分成,6,组（,2.5,克每组），用,8,倍体积（指料液比,v/m,为,8,：,1,）即,20ml,的,40%,、,70%,，,95%,的乙醇浸提（温度,70,，时间,1.5h,），浸提时每隔,15 min,用手,轻摇,2min,。浸提所得粗液进行离心（,4500r/min20min,），得浸提上清液。,1.2,精密吸取上清液,1.0 mL,，分别置于,10 mL,容量瓶中，加质量分数,5,亚硝酸钠,0.4 mL,，放置,6 min,后，加质量分数,10,硝酸铝,0.4 mL,，放置,6 min,，再加质量分数,4.3,氢氧化钠,4 mL,，加蒸馏水至刻度，摇匀，放置,15 min,，在,510nm,波长下测得其吸光度值，得出最优的浸提剂浓度。,（按三个水平，每个水平做两组操作，即每个单因素条件得六个数据。）,实验一、植物色素的制备,2,、不同,浸提时间,对黄酮提取率的影响,2.1,取干粉原料,15,克，分成,6,组（,2.5,克每组），用按,8,：,1,（指料液比,v/m,）的,70%,乙醇浸提（温度,70,），浸提时间分别为,90min,、,120min,，,150min,，浸提时每隔,15,分钟用手,轻摇,2min,。浸提所得粗液进行离心（,4500r/min20min,），得浸提上清液。,2.2,精密吸取上清液,1.0 mL,，分别置于,10 mL,容量瓶中，加质量分数,5,亚硝酸钠,0.4 mL,，放置,6 min,后，加质量分数,10,硝酸铝,0.4 mL,，放置,6 min,，再加质量分数,4.3,氢氧化钠,4 mL,，加蒸馏水至刻度，摇匀，放置,15 min,，在,510nm,波长下测得其吸光度值，得出最优的浸提时间。,（按三个水平，每个水平做两组操作每个水平做两组操作，即每个单因素条件做六个数据。）,实验一、植物色素的制备,3,、不同,料液比,对黄酮提取率的影响,3.1,取干粉原料,15,克，分成,6,组（,2.5,克每组），用按,6,：,1,，,8,：,1,，,10,：,1,（指料液比,v/m,，即,ml/,克）的,70%,乙醇浸提（温度,70,，时间,1.5h,），浸提时每隔,15,分钟用手轻摇,2min,。浸提所得粗液进行离心（,4500r/min20min,），得浸提上清液。,3.2,精密吸取上清液,1.0 mL,，分别置于,10 mL,容量瓶中，加质量分数,5,亚硝酸钠,0.4 mL,，放置,6 min,后，加质量分数,10,硝酸铝,0.4 mL,，放置,6 min,，再加质量分数,4.3,氢氧化钠,4 mL,，加蒸馏水至刻度，摇匀，放置,15 min,，在,510nm,波长下测得其吸光度值，按,V*A,值的大小比较得出最优的料液比。,选做部分：,若出现从,6,：,18,：,110,：,1,的（,V*A,）持续平稳增加，则可以继续加大料液比（可以为,12,：,1,，,14,：,1,）,直到找到拐点位置的最佳料液比。,实验一、植物色素的制备,六、实验注意事项,1,、将本实验中所有的乙醇提取的浸提液集中起来（一定要记下这些浸提液所对应的原料质量,M,），量取其,总体积,V,，将提取液分出,50ml,，将这,50ml,和其余色素液分置于两个烧杯中，然后将两个烧杯在,4,左右的低温下并用保鲜膜封闭保存,（按现在的温度，放在台子上避光保存即可），,以供后面纯化实验使用。,2,、在色素提取过程中，每隔一段时间要进行轻摇，摇晃时幅度要小，以免使提取原料粘在壁上，造成原料损失。,3,、在做不同料液比对色素提取影响实验时，比较结果优劣要用,V*A,即：体积*吸光度值。,实验一、植物色素的制备,六、实验注意事项,4,、离心前一定要认真平衡好，两管质量平衡误差应在,0.1,克以内。同时，在离心过程中，一定要有专人看护以免发生事故。,5,、实验当中的提取液一定要全部从磨口锥形瓶和离心管中倒出，在将离心好的色素倒出时，一定要小心，不要将底部的沉降物倒出来。,6,、色素提取过程中一定要在锥形瓶上加上塞子，若乙醇蒸发较快时,（如：,80%,以上的高浓度乙醇提取时），,可以考虑在磨口锥形瓶上加一蛇形管，但低浓度乙醇提取时没有必要加蛇形管。,实验一、植物色素的制备,7,、上样液的制备,（该步骤亦可以在实验二中完成）,将实验一中所得的,所有浸提液,用烧杯放在,100,水浴中,浓缩到,20ml,，将所得浓缩液置于,50ml,（或更大的）分液漏斗中，按等量体积加入石油醚后塞上塞子并充分摇匀，弃石油醚层，得下层黄酮液，放在,90,水浴中浓缩，浓缩至,10ml,（具体操作时，可先用大烧杯进行浓缩，待溶液约,50ml,左右时，改用,50ml,小烧杯进行浓缩，这样便于进行定量），,备用。,实验一、植物色素的制备,8,、测量吸光度时，一定要设空白对照（即把除,1ml,样液以外的其余,9ml,亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、蒸馏水,+1ml,乙醇,）,9,、由于各提取液浓度较大，在测量吸光度前，一定要将待测液取出,1mL,，稀释到,10mL,后，再按前面,A,值测定方法进行测定。,实验一、植物色素的制备,附录,1,、实验前面准备（同学们不需要做）：,（,1,）、原料的制备,用高速干粉粉碎机将银杏叶粉碎，过,40,目以上，,40-60,目，,60-70,目，,70-80,目，,80-90,目，,90-100,目，,100,目以上，筛后备用。,（,2,）、标准曲线的绘制：,精密称取芦丁对照品,200 mg,，用体积分数,(,下同,)70,乙醇溶解，定容至,100 mL,容量瓶中摇匀。精密移取,10 mL,芦丁乙醇液于,25 mL,容量瓶中，用蒸馏水定容，得到,0.8 mg,mL,标准溶液。精密吸取标准溶液,0.0,、,0.2,、,0.4,、,0.6,、,0.8,、,1.0 mL,，分别置于,10 mL,容量瓶中，加质量分数,5,亚硝酸钠,0.4 mL,，放置,6 min,后，加质量分数,10,硝酸铝,0.4 mL,，放置,6 min,，再加质量分数,4.3,氢氧化钠,4 mL,，加蒸馏水至刻度，摇匀，放置,15 min,，进行测量，在,510nm,处有最大吸收波长。以测定结果得芦丁浓度与吸光度的标准曲线：,Y=0.1035Ad-0.0016(Y,：芦丁浓度，,mg,ml,；,A,：吸光值,),，,R=0.9999,。,实验二、植物色素的分离纯化,一、目的,学习掌握柱层析法分离纯化目的物质（植物色素）的方法和操作。,二、原理,柱层析是比较理想的分离黄酮类色素的方法,其原理是通过基质分子与黄酮类化合物分子上的,酚羟基形成氢键缔合物而产生作用,其作用力强弱取决于黄酮类化合物分子上羟基的数目与位置,以及,洗脱剂与黄酮类化合物和基质之间形成氢键缔合能力的大小,。常用不同比例的水和醇混合溶剂作为洗脱剂，能成功分离各种类型的黄酮。,实验二、植物色素的分离纯化,三、器材与试剂,1,、实验仪器,层析柱、试管、烧杯、量筒、烘箱。,2,、实验试剂,石油醚、,40%,乙醇,200ml/,组、,70%,乙醇,300ml/,组、,95%,乙醇,200ml/,组、基质。,3,、实验材料,银杏叶提取液,实验二、植物色素的分离纯化,四、操作,1,、上样液的制备,（该步骤亦可以在实验一中完成）,将实验一中所得的所有浸提液,用烧杯放在,100,水浴中,浓缩到,20ml,，将所得浓缩液置于,50ml,（或更大的）分液漏斗中，按等量体积加入石油醚后塞上塞子并充分摇匀，弃石油醚层，得下层黄酮液，放在,90,水浴中浓缩，浓缩至,10ml,（具体操作时，可先用大烧杯进行浓缩，待溶液约,50ml,左右时，改用,50ml,小烧杯进行浓缩，这样便于进行定量），,备用。,2,、基质的的预处理：,称取所需的大孔吸附树脂,(,湿重,),，以,95,乙醇浸泡,24 h,，充分溶胀后用乙醇湿法装柱，,实验二、植物色素的分离纯化,3,装柱：,将酒精浸泡好的基质约4,0ml,（指混匀状态下取样），通过漏斗缓慢倒入柱中,（柱中已经装好,10ml95%,乙醇），,边加边用木夹子轻敲柱子，同时用竹签轻轻压实。流速应控制在,20,滴,/min,，待装至,20cm,柱高，再加与柱壁完全吻合的滤纸片，接着加入,1.0 cm,高海沙（或石英砂,）。（注意，在整个装柱过程中，树脂应浸泡在溶液中，否则会出现断痕，气泡等。,若柱子无砂芯，要在装柱前加一小团（大拇指指甲大小的）棉花封住柱子，以防基质漏出。,）,4,、平衡：,用,95%,乙醇洗柱，不时检查流出的乙醇液，待流出的乙醇液与去离子水以,1,：,3,的体积比混合，振摇不显白色浑浊时结束洗柱（已洗好，不必做），,用纯化水将柱中树脂洗至无醇味后备用,。（注意，所有醇洗液需回收到大的烧杯里，水洗液不必回收）,5,、上样与吸附：,取浓缩液,10ml,上柱，吸附,20min,（流速,20,滴,/min,），等样品液完全流入基质中后，用,3,倍柱体积（约,150ml,）去离子水洗脱。,实验二、植物色素的分离纯化,6,、洗脱（解吸附）：,6.1,依次用,40%200ml,（,流速约,30,滴,/min,）、,70%300ml,（流速约,20,滴,/min,）、,95%200ml,（流速约,40,滴,/min,）乙醇分别进行洗脱，将试管放在试管架上按序接收洗脱液，每管收集,8ml,左右洗脱液,6.2,从第一管起，每接收,3,管，则精密吸取第,1,、,4,、,7,、,10,等管中的洗脱液,1.0 mL,，置于,10 mL,容量瓶中，加质量分数,5,亚硝酸钠,0.4 mL,，放置,6 min,后，加质量分数,10,硝酸铝,0.4 mL,，放置,6 min,，再加质量分数,4.3,氢氧化钠,4 mL,，加蒸馏水至刻度，摇匀，放置,15 min,，在,510nm,波长下测得其吸光度值；,实验二、植物色素的分离纯化,6,、洗脱（解吸附）：,6.3,确定黄酮所在的主要流分后，将吸光度值在,0.1,以上（含,0.1,）的所有管中的洗脱液集中起来，测出其,总体积,V,纯化,（接着，可直接测定纯化液的,A,值）,，,预留,50ml,纯化液，,用保鲜膜封闭后放在,4,中低温保存，并,将其余的纯化液,置于,90,水浴中浓缩至,10ml,，用保鲜膜封闭后放在,4,中低温避光保存，备用。,实验二、植物色素的分离纯化,五、实验注意事项,1,、装柱前在柱子底部加一小棉花球。,2,、装柱时，边加树脂边用木质棒（或橡胶棒）轻敲柱子，使基质缓缓下沉。,3,、装柱要求连续、均匀、无纹格、无气泡，表面平整，整个层析过程中液面一定不得低于树脂表面。,4,、要注意及时开启和关闭旋纽，即在上一种液体刚好没入基质时，才开始加入下一种液体，,且一定要用玻棒引流,。,实验二、植物色素的分离纯化,五、实验注意事项,5,、要注意控制流速，不宜过快。,6,、在加入好样品后（在洗壁前）就要接收洗脱液。,7,、柱子预处理时的流出液用三角瓶或烧杯接收，而上样