优《血红蛋白的提取和分离》

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,本课题学习目标,体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。,1,、主要概念：,凝胶色谱法,电泳法,缓冲溶液,它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。,主要原理：,凝胶色谱法分离蛋白质的原理,电泳法分离样品的原理,缓冲溶液的组成和作用机理,3,、课题重点：,凝胶色谱法的原理和方法,4,、,课题难点：,样品的处理,色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。,1.,分离生物大分子的基本思路：,选用一定的,物理或化学,的方法分离具有不同物理或化学性质的,生物大分子,。,2.,蛋白质分离和提取的原理：,根据蛋白质,各种特性,的差异，如,分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力,等等，可以用来分离,不同种类的蛋白质。,一、血红蛋白的提取和分离,3,、提取分离方法,凝胶色谱法,凝胶电泳法,（一）凝胶色谱法（,分配色谱法,）,2.,凝胶：,大多数凝胶是由,多糖类化合物,（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体,，,内部有许多贯穿的,通道。,根据被分离物质的,蛋白质相对分子质量的大小，,利用具有,网状结构,的凝胶，来进行分离。,1.,概念：,3.,凝胶色谱法的原理,当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，,相对分子量较小的蛋白质,容易,进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢,;,相对分子量,较大,的蛋白质,无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。,依据的特性是：,蛋白质分子量的大小。,4.,凝胶色谱法,分离蛋白质,的原理和,具体过程,凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示,（二）缓冲溶液,1.,概念,:,在一定的范围内，凡是能够抵制,外加少量强,酸或强碱,的影响使原来溶液,PH,值基本保持,不变的混,合溶液。,能够抵制外界的酸和碱对溶液,PH,值的影响，,维持,PH,基本不变。,2.,作用,:,思考：说出人体血液中缓冲对。,NaH,2,PO,4,/Na,2,HPO,4,H,2,CO,3,/NaHCO,3,通常由,1,2,种缓冲剂,溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的,使用比例,就可以制得在,不同,PH,范围内使用的缓冲液。,4.,提问：在本课题中使用的缓冲液是,:_,利用缓冲液,模拟细胞内的,PH,环境,，保证,血红蛋白的正常结构和功能,，便于观察,(,红色,),和科,学研究,(,活性,),磷酸缓冲液,3.,缓冲溶液的配制,:,其目的是,:,（三）电泳：,1.,概念：,带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。,2.,原理：,许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在,一定的,PH,下，这些基团会带上正 电或负电。,在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷,相反,的电极移动。,分离样品中各种分子,带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，,从而实现样品中各种分子的分离。,影响蛋白质分子运动速度的因素,决定,运动方向,形成,库仑力,形成,阻力,决定,运动速率,电荷性质,电荷量,分子形状,分子大小,3.,类型,:,琼脂糖,凝胶电泳、,聚丙稀酰胺,凝胶电泳。,在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动,琼脂糖凝胶电泳示意图,聚丙烯酰胺凝胶电泳,1,、测定蛋白质分子量,:,常用,十二烷基硫酸钠（,SDS,）,聚丙烯酰胺,凝胶电泳。,聚丙烯酰胺凝胶是由,单体丙烯酰胺,和,交联剂,N,N-,亚甲基双丙烯酰胺,在,引发剂,和,催化剂,的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。,N,N-,亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）,丙烯酰胺和交联剂,N,N-,亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应,蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的,迁移率,取决,于它所带,净电荷的多少,以及,分子的大小,等因素。,2.,原理：,SDS,能使,蛋白质发生完全变性。解聚成单条肽链,，因此测定的结果只是,单条肽链的分子量,。,SDS,能与各种蛋白质形成,蛋白质,SDS,复合物,，,SDS,所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子,原有的电荷量,。因而,掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，,使,电泳迁移率完全取决于分子的大小,。,3.SDS,作用机理,:,用,SDS,测定蛋白质分子量的方法,使用,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳,测定蛋白质的分子量时，可选用一组,已知分子量的标准蛋白,同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的,电泳区带位置,，可以测定,未知蛋白质,的分子量。,市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。,二、实验操作,样品处理,粗分离,纯化,纯度鉴定,1.,样品处理：,（一）蛋白质提取和分离步骤,（二）操作过程,可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。,血液,血浆,水 分,固体物质：,血浆蛋白、,无机盐、磷脂、葡萄糖等,血细胞,白细胞,血小板,红细胞,（最多）,血红蛋白,（,90,）,两个,肽链,两个,一肽链,四个亚铁血红素基团,2.,提问：,血液有哪些成分？,1.,提问：,用鸡的红细胞提取,DNA,，用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？,鸡的红细胞具有细胞核，含有,DNA,，便于进行,DNA,的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。,血红蛋白,两个,肽链,两个,一肽链,四个亚铁,血,红素基团,每个肽链环绕一个,亚铁血红素基团，,此基团可携带,一分子,O,2,或一分子,CO,2,，,血红蛋白因含有,血红素,而,呈,红色,。,血红蛋白的特点：,(1),红细胞的洗涤,:,去除杂质蛋白，利于后续血红蛋白的分离纯化,.,1,、采集血样,2,、低速短时间离心,（速度越高和时间越长，会使白细,胞等一同沉淀，达不到分离的效果）,3,、吸取血浆：,上层透明的黄色血浆。,4,、盐水洗涤：,下层暗红色的红细胞,+,五倍体积的,0.9,的,NaCl,溶液洗涤，搅拌,10min,5,、低速,短时间,离心：,6,、重复,3,、,4,、,5,步骤三次,上清液中已没有黄色：红细胞洗涤干净。,目的,:,操作：,洗涤次数过少,无法除去血浆蛋白。,(2),血红蛋白的释放：,加蒸馏水到,原血液体积,，,加,40,体积的甲苯,（溶解细胞膜）,置于,磁力搅拌器,搅拌,10min,（加速细胞破裂）,红细胞破裂，释放出血红蛋白,(3),分离血红蛋白溶液：,过程,：,将搅拌好混合液转移到离心管内，以,2000r/min,的速度,离心,10 min,。,试管中溶液层次：,第,1,层（最上层）：,甲苯层,（无色透明）；,第,2,层（中上层）：,脂溶性物质沉淀层,（白色薄层固体）；,第,3,层（中下层）：,血红蛋白的水溶液层,（红色透明液体）；,第,4,层（最下层）：,杂质沉淀层,（暗红色）。,分离,：,滤纸过滤：除去脂溶性沉淀层，,分液漏斗中静置：分出下层的,红色透明液体,。,甲苯层,（,无色透明）,白色薄层固体,红色透明液体,杂质沉淀层,（,暗红色,）,试管中溶液层次,(4),透 析：,过程：,取,1ml,的血红蛋白溶液,装入透析袋中，将透析袋放入盛有,300ml,的,20mmol/l,的磷酸缓冲液,中（,pH,为,7.0,），透析,12h,目的：,除去样品中分子量较小的杂质和离子。,或用于更换样品的缓冲液。,20mmol/L,磷酸缓冲液,1mL,透析过程动画演示,2.,凝胶色谱操作,:,（,1,）凝胶色谱柱的制作：,取长,40,厘米，内径,1.6,厘米的玻璃管，,两端磨平。,底塞的制作：,打孔,挖出凹穴,安装移液管头部,覆盖尼龙网，再用,100,目尼龙纱包好，插到玻璃管的,一,端,。,注意事项：玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。,顶塞的制作：,打孔,安装玻璃管,。,组装：,将上述三者按相应位置组装成一个整体,。,安装其他附属结构。,（,2,）凝胶色谱柱的装填,凝胶的选择：,A,、材料：,交联葡聚糖凝胶（,G-75,）。,B,、代表意义,：“,G”,表示凝胶的交联程度，膨胀程度,及分离范围,。,75,表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨,胀时吸水,7.5,克。,凝胶的前处理：,配置凝胶悬浮液：,计算并称取一定量的凝胶浸泡于,蒸馏水或洗脱液,中,充分溶胀后，配成,凝胶悬浮液。,凝胶色谱柱的装填方法：,A,、固定：,将色谱柱装置固定在支架上。,B,、装填：,将,凝胶悬浮液一次性,缓慢倒入色谱柱,内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀,注意：,1,、装填时尽量紧密：,降低凝胶颗粒之间的空隙。,2,、装填凝胶柱时不得有气泡存在：,因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果,。,洗涤平衡：,连接缓冲液洗脱瓶，在,50cm,高的操作压下，用,300ml,的,20mmol/L,的,磷酸缓冲液（,pH,为,7.0,）,充分洗涤平衡,12h,。,注意：,1,、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响分离效果,2,、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象,。,（,2,）凝胶色谱柱的装填,50cm,高,（,3,）样品加入与洗脱,调节缓冲液面：,打开下端出口，使,缓冲液下降到与凝胶面,平齐，关闭出口,滴加透析样品,：,吸管吸,1ml,样品加到色谱柱的,顶端,，,注意：,1,、不要触及并破坏凝胶面。,2,、贴壁加样,3,、吸管管口贴着管壁环绕移动加样,样品渗入凝胶床：,打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，,样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口,洗脱：,加入,pH=7.0,的,20mmol/l,的磷酸缓冲液到适当高度，,连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。,收集：,待,红色的蛋白质接近色谱柱底端,时，用试管收集流出,液，每,5ml,收集一试管，连续收集,。,（如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）,（,3,）样品加入与洗脱,注意：,正确的加样操作是：,1,、不要触及并破坏凝胶面。,2,、贴壁加样。,3,、使吸管管口沿管壁环绕移动。,思考下面的问题：,让血红蛋白处在稳定的,pH,范围内，维持结构和功能正常。,1,、在血红蛋白纯化的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？,2,、与其他蛋白质相比，血红蛋白有什么特点？这一特点对你进行血红蛋白的分离有什么启示？,血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察,颜色,来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程,非常直观，大大简化了实验操作。,血红蛋白提取和分离的程序包括：,样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定,。,样品的处理：,通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、,离心等操作收集到,血红蛋白溶液,，,样品的粗分离,:,透析,去除分子量较小的杂质,样品的纯化：,凝胶色谱法,除去,相对分子质量较大,的,杂质蛋白,纯度鉴定,:,聚丙烯酰胺凝胶电泳,进行纯度鉴定。,3,、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？,（三）,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做）,2.,试剂的配制：,鉴定血红蛋白纯度。,1.,目的：,3,.,方法步骤：（略）,观察处理的血液样品离心后,是否分层，如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。,此外，离心速度过高和时间过长，会使,白细胞和淋巴细胞一同沉淀,，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。,三、实验结果分析与评价,1,、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？,2,、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？,1,、,由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以,在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。,2,、加入大分子的有色物质，,例如蓝色葡聚糖,2000,或红色葡聚糖,，,观察色带移动的情况。如果,色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好,。,3,、,色谱柱出现,纹路或是气泡,，,轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。,红色区带：均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；,说明凝胶色谱柱装填得很成