霍奇金淋巴瘤实验设计 ppt课件

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,#,研究背景,霍奇金淋巴瘤（,Hodgkins lymphoma,，,HL,，,Hodgkins disease,，）是,恶性淋巴瘤,的一个独特类型。,研究背景,其特点为：临床上病变往往从一个或一组淋巴结开始，逐渐由邻近的淋巴结向远处扩散。原发于结外淋巴组织的少见。,研究背景,瘤组织成分多样，但,HL,特异性的病理改变为,大量反应性增生的背景淋巴细胞中可见少于,1%Reed-Sternberg,细胞（,R-S,细胞）。,这种特殊的瘤巨细胞来源于,B,淋巴细胞,(,镜影细胞,),研究背景,p53,和,bcl-2,基因突变,EB,病毒感染,但证据均不足，,HL,的发病机制,尚未明确,肿瘤细胞,研究背景,有研究发现,NF-B (RelA/P50),的组成性激活是霍奇金淋巴瘤细胞的特点。,1,IB,作为重要的,NF-B,通路,抑制因子，在多种瘤细胞中表达量均减少。,研究背景,将对,IB,激酶 （,IB kinase, IKK,）无反应的,IB,突变体导入,HRS,细胞中可阻断,NF-B,的活化，导致细胞凋亡，说明,IB,在,HL,发病机制中有重要作用。,2,研究背景,Emmerich,等人的研究表明,HRS,细胞中,IB mRNA,高表达，但在蛋白水平检测的阳性强度弱，可能与,HL,中泛素化降解活性增强有关，也可能由,IB,蛋白结构改变导致。,3,研究目的,本实验意在：,了解,IB,基因在,HL,中突变的情况；,分析经典型,HL HRS,中,IB,突变的特点、可能造成的蛋白结构异常；,以及这些异常的病理意义，即其与,HL,发病的相关性。,实验材料与试剂,霍奇金淋巴瘤组织样本,CD30,单抗,（,Dako,公司，克隆号,Ber,H2,，效价,1,：,20,）,Leica ASLMD,激光显微,系统,PCR,引物,（,北京赛百胜公司,）,PCR,仪（包括反应体系）,DNA,测序仪,实验流程,CD30,免疫组化,激光显微切割和,DNA,提取,IB,基因扩增,PCR,产物检测,待测基因外含子,测序,CD30,免疫组化,采用,EnVision,两步法,。,将冰冻组织切成,6,m,厚连续切片，贴于,Leica PEN,膜空白切片上，用含,0,05,NP40,的丙酮,(v,v),固定,10 min,，室温下自然干燥；,CD30,免疫组化,6,H2O2-,甲醇，,37,10 min,，消除内源性过氧化物酶；,加,1,：,20,稀释的一抗；,加相应的二抗，,DAB,显色，苏木精复染，盐酸乙醇分化，充分水洗。,激光显微切割和,DNA,提取,用,Leica ASLMD,系统逐个切割组织切片上的,CD30,阳性细胞,（,切割参数：激光强度,37,，波长,377,，速度,5,，光束直径,8,）,。,将目的细胞从切片上分离，在光压强作用下被收集到离心管盖内，每例标本,3,6,组，每组约,25,70,个细胞。,切割周围的正常淋巴细胞每例,2,管，,每管约,50,个细胞。,扩增目的基因，上游引物：,5,-CACACTGTGCCCATCTACG-3,，下游引物：,5,一,GGTc1-ITI,GCGGATGTCCAC,一,3,。,（缓冲体系：,10X,反应缓冲液,2,5,l,，,MgCL,2,(25 mmol,L)1,5,l,，,dNTP(10 mmoL,L)1,0,l,，上游引物,(10,moL,L)0,5,l,，下游引物,(10,mol,L)0,5,l,，,Taq,酶,(5 U, ,L)0,3,l,，,模板,2,0,l,，总体积,25,l,。反应条件：,94,预变性,5 min,，,94,变性,1 min,，,55,退火,1 min,，,72oC,延伸,1 min,，共,40,个循环，,72,延伸,7min,，至,4,结束。,以双蒸水代替,DNA,模板作为阴性对照。）,IB,基因扩增,对,HRS,细胞、背景中反应性增生细胞的,IB,6,个外显子进行半巢式,PCR,扩增。,用已知,IB,外显子,PCR,扩增阳性的标本为模板作阳性对照，用双蒸水作为阴性对照。,这种特殊的瘤巨细胞来源于B淋巴细胞 (镜影细胞),IB基因没有参与霍奇金淋巴瘤的发生和恶化,对HRS细胞、背景中反应性增生细胞的IB 6个外显子进行半巢式PCR扩增。,J Clin Invest, 1997, 100 (12): 2961-9.,将目的细胞从切片上分离，在光压强作用下被收集到离心管盖内，每例标本36组，每组约2570个细胞。,6 H2O2-甲醇，37 10 min，消除内源性过氧化物酶；,Oncogene, 1999, 18(16):2567-77.,Overexpression of I kappa B alpha without inhibition of NF-kappaB activity and mutations in the I kappaB alpha gene in Reed-Sternberg cells J.,取5 l PCR产物，用2琼脂糖凝胶电泳分析，稳流120 mA，20 min。,如果在800-1600之间，那么就要同时进行正反向测序才能测出你的片段（因为一个方向上的测序结果最好也只能保证800bp以内是可信的）,切割周围的正常淋巴细胞每例2管，,PCR仪（包括反应体系）,用Leica ASLMD系统逐个切割组织切片上的CD30阳性细胞（切割参数：激光强度37，波长377，速度5，光束直径8）。,反应条件：预变性95 ，5min，继而95变性50 s，65退火30 s，72延伸90 S，共35个循环，最后72延伸10 min。,有研究发现NF-B (RelA/P50)的组成性激活是霍奇金淋巴瘤细胞的特点。,加相应的二抗，DAB显色，苏木精复染，盐酸乙醇分化，充分水洗。,反应条件：94预变性5 min，94变性1 min，55退火1 min，72oC延伸1 min，共40个循环，72延伸7min，至4结束。,每管DNA样品都要扩增2次，使用上海博亚公司ABI377DNA测序仪对PCR阳性产物进行直接测序。,在这种技术中，首先用一对外引物进行第1轮PCR，然后再使用第1对引物扩增的DNA序列内部的一对引物再次扩增，所以称为巢式PCR。,激光显微切割和DNA 提取,PCR,扩增反应体系,扩增,IB,第一和第二外显子反应体系：,10 X PCR,缓冲液,5,0,1,，,MgC1,：,(25mmoi,L)5,0,Ixl,，,dNTPs(10 mmol, ,L)2,0,l,，,DMSO2,0,l,，,Taq DNA,聚合酶,(5 U,pJ)1,0,l,，,DNA,模板,(0,5 g,IL1)2,0,l,，扩增第一外显子时加引物,1,Ixl,；扩增第二外显子时加引物,0,3,l,，补所需,ddH2O,使反应体系达到,50,I,。反应条件：预变性,95, ，,5min,，继而,95,变性,50 s,，,65,退火,30 s,，,72,延伸,90 S,，共,35,个循环，最后,72,延伸,10 min,。第二轮，反应体系,50,l,，扩增第一和第二外显子时加引物,1,25,l,。扩增第一外显子时另加,2,l DMSO(,扩增第二外显子时不加,DMSO),。反应条件同第一轮。,扩增,IB,第三到第六外显子反应体系,：,第一轮，,l0,PCR,缓冲液,5,0,Ixl,，,MgCL,2,(25 mmol,L)4,0 l,，,dNTPs(10 mmol,L)2,0 l,，,Taq DNA,聚合酶,(5 U, ,L)1,0,l,，,DNA,模板,(0,5,g,L)2,0,l,，引物,1,l,。反应条件同扩增一、二外显子者，但退火温度为,63,。第二轮，反应体系同第一轮，但扩增引物为,1,25,L,。反应条件为预变性,95, ，,5 min,，继而,95,变性,50 S,，,65,退火,30 S,，,72 oC,延伸,90 S,，共,35,个循环，最后,72,延伸,10 min,。）,PCR,产物检测,取,5,l PCR,产物，用,2,琼脂糖凝胶电泳分析，稳流,120 mA,，,20 min,。,紫外灯下观察。,IB,的,6,个外显子阳性扩增产物大小分别为,exon1(476bp),、,exon2(433bp),、,exon3(399bp),、,exon4(184bp),、,exon5(381bp),和,exon6(441bp),。,预期结果,电泳,电泳条带不在同一水平线上,基因明显突变。,预期结果,电泳,电泳条带在同一水平线上。,没有突变,点突变或分子量很小的碱基序列突变,待测基因外含子,测序,每管,DNA,样品都要扩增,2,次，使用上海博亚公司,ABI377DNA,测序仪对,PCR,阳性产物进行直接测序。,预期结果,测序,碱基序列出现改变,图,A-,箭头处为,T-A,突变（,TGA,为终止密码）,图,B-,反向测序证实,（蓝色,-C,红色,-T,，绿色,-A,，黑色,-G,）,预期结果,碱基序列没有突变,C,、,D,分别为没有突变的正、反向测序,预期结果,肿瘤细胞,I,B,基因突变率高，而反应性增生的淋巴细胞,I,B,基因没有突变。,肿瘤细胞和反应性增生的淋巴细胞的,I,B,基因都没有突变。,肿瘤细胞和反应性增生的淋巴细胞的,I,B,的突变率都增加,IB,基因参与霍奇金淋巴瘤的发生和恶化有关,IB,基因没有参与霍奇金淋巴瘤的发生和恶化,估计不会发生这种情况，如若发生则需要进一步研究,参考文献,1 Bargou R.C,et al,. Constitutive nuclear factor-kappaB-RelA activation is required for proliferation and survival of Hodgkins disease tumor cells J.,J Clin Invest, 1997, 100 (12): 2961-9.,2 Dejardin E,et al,. Regulation of NF-kappaB activity by IkappaB-related proteins in adenocarcinoma cells J.,Oncogene, 1999, 18(16):2567-77.,3 Emmerich F,et al,. Overexpression of I kappa B alpha without inhibition of NF-kappaB activity and mutations in the I kappaB alpha gene in Reed-Sternberg cells J.,Blood, 1999, 94(9): 3129-34.,Thank you,！,J Clin Invest, 1997, 100 (12): 2961-9.,肿瘤细胞和反应性增生的淋巴细胞的IB的突变率都增加,Regulation of NF-kappaB activity by IkappaB-related proteins in adenocarcinoma cells J.,IB基因没有参与霍奇金淋巴瘤的发生和恶化,采用EnVision两步法。,激光显微切割和DNA 提取,每管DNA样品都要扩增2次，使用上海博亚公司ABI377DNA测序仪对PCR阳性产物进行直接测序。,电泳条带在同一水平线上。,EnVision两步法,IB基因没有参与霍奇金淋巴瘤的发生和恶化,IB基因没有参与霍奇金淋巴瘤的发生和恶化,C、D分别为没有突变的正、反向测序,Regulation of NF-kappaB activity by IkappaB-related proteins in adenocarcinoma cells J.,1 Bargou R.,Overexpression of I kappa B alpha without inhibition of NF-kappaB activity and mutations in the I kappaB alpha gene in Reed-Sternberg cells J.,第二轮，反应体系50 l，扩增第一和第二外显子时加引物125 l。,电泳条带在同一水平线上。,激光显微切割和DNA 提取,这种特殊的瘤巨细胞来源于B淋巴细胞 (镜影细胞),点突变或分子量很小的碱基序列突变,巢式,PCR,巢式聚合酶链反应,(nested polymearse chain reaction, nPCR),也称套式,PCR,。,在这种技术中，首先用一对外引物进行第,1,轮,PCR,，然后再使用第,1,对引物扩增的,DNA,序列内部的一对引物再次扩增，所以称为巢式,PCR,。为了经济节约，可在第,2,轮扩增时采用,半巢式，,设计单条引物，另一条引物与第,1,轮扩增共用，。,反向测序,一个是,正向引物（上游引物），,用它来测序就是正向测序,(,从上游往下测序,),，也就是,5,到,3,另外一个就是,反向引物（下游引物,），用它来测序就是反向测序（从下游往上测序），也就是,3,到,5,如果片段在,800,以内，那么随便进行一个方向就能测出你全部的序列了,如果在,800-1600,之间，那么就要同时进行正反向测序才能测出你的片段（因为一个方向上的测序结果最好也只能保证,800bp,以内是可信的）,EnVision,两步法,DAKO EnVision,显色系统是将二抗和酶通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个多聚体（即,EnVision,）直接放大信号,40-50,倍，把传统的二抗、三抗分别孵育合为一次孵育。特点：敏感、省时、方便、背景低（避免了内源性生物素干扰）。,CD30,免疫组化,采用,EnVision,两步法,。,将冰冻组织切成,6,m,厚连续切片，贴于,Leica PEN,膜空白切片上，用含,0,05,NP40,的丙酮,(v,v),固定,10 min,，室温下自然干燥；,CD30,免疫组化,6,H2O2-,甲醇，,37,10 min,，消除内源性过氧化物酶；,加,1,：,20,稀释的一抗；,加相应的二抗，,DAB,显色，苏木精复染，盐酸乙醇分化，充分水洗。,预期结果,电泳,电泳条带在同一水平线上。,没有突变,点突变或分子量很小的碱基序列突变,参考文献,1 Bargou R.C,et al,. Constitutive nuclear factor-kappaB-RelA activation is required for proliferation and survival of Hodgkins disease tumor cells J.,J Clin Invest, 1997, 100 (12): 2961-9.,2 Dejardin E,et al,. Regulation of NF-kappaB activity by IkappaB-related proteins in adenocarcinoma cells J.,Oncogene, 1999, 18(16):2567-77.,3 Emmerich F,et al,. Overexpression of I kappa B alpha without inhibition of NF-kappaB activity and mutations in the I kappaB alpha gene in Reed-Sternberg cells J.,Blood, 1999, 94(9): 3129-34.,Thank you,！,Oncogene, 1999, 18(16):2567-77.,PCR仪（包括反应体系）,1 Bargou R.,扩增第一外显子时另加2 l DMSO(扩增第二外显子时不加DMSO)。,点突变或分子量很小的碱基序列突变,3 Emmerich F, et al.,扩增IB第一和第二外显子反应体系：,第二轮，反应体系50 l，扩增第一和第二外显子时加引物125 l。,切割周围的正常淋巴细胞每例2管，,PCR仪（包括反应体系）,（缓冲体系：10X反应缓冲液25 l，MgCL2(25 mmolL)15 l，dNTP(10 mmoLL)10 l，上游引物(10 moL L)05 l，下游引物(10 molL)05 l，Taq酶(5 U L)03 l，,对HRS细胞、背景中反应性增生细胞的IB 6个外显子进行半巢式PCR扩增。,（缓冲体系：10X反应缓冲液25 l，MgCL2(25 mmolL)15 l，dNTP(10 mmoLL)10 l，上游引物(10 moL L)05 l，下游引物(10 molL)05 l，Taq酶(5 U L)03 l，,IB的6个外显子阳性扩增产物大小分别为exon1(476bp)、 exon2(433bp)、 exon3(399bp)、 exon4(184bp)、 exon5(381bp)和 exon6(441bp)。,取5 l PCR产物，用2琼脂糖凝胶电泳分析，稳流120 mA，20 min。,取5 l PCR产物，用2琼脂糖凝胶电泳分析，稳流120 mA，20 min。,反应条件为预变性95 ，5 min，继而95变性50 S，65退火30 S，72 oC延伸90 S，共35个循环，最后72延伸10 min。,反应条件：预变性95 ，5min，继而95变性50 s，65退火30 s，72延伸90 S，共35个循环，最后72延伸10 min。,C、D分别为没有突变的正、反向测序,C、D分别为没有突变的正、反向测序,点突变或分子量很小的碱基序列突变,分析经典型HL HRS中IB突变的特点、可能造成的蛋白结构异常；,对HRS细胞、背景中反应性增生细胞的IB 6个外显子进行半巢式PCR扩增。,如果在800-1600之间，那么就要同时进行正反向测序才能测出你的片段（因为一个方向上的测序结果最好也只能保证800bp以内是可信的）,DAKO EnVision显色系统是将二抗和酶通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个多聚体（即EnVision）直接放大信号40-50倍，把传统的二抗、三抗分别孵育合为一次孵育。,PCR仪（包括反应体系）,取5 l PCR产物，用2琼脂糖凝胶电泳分析，稳流120 mA，20 min。,Overexpression of I kappa B alpha without inhibition of NF-kappaB activity and mutations in the I kappaB alpha gene in Reed-Sternberg cells J.,一个是正向引物（上游引物），用它来测序就是正向测序(从上游往下测序)，也就是5到3,点突变或分子量很小的碱基序列突变,第一轮，l0PCR缓冲液50 Ixl，MgCL2(25 mmolL)40 l，dNTPs(10 mmolL)20 l，Taq DNA聚合酶(5 U L)10 l，DNA模板(05 g L)20 l，引物1 l。,有研究发现NF-B (RelA/P50)的组成性激活是霍奇金淋巴瘤细胞的特点。,采用EnVision两步法。,EnVision两步法,EnVision两步法,CD30单抗（Dako公司，克隆号BerH2，效价1：20）,反应条件：预变性95 ，5min，继而95变性50 s，65退火30 s，72延伸90 S，共35个循环，最后72延伸10 min。,第二轮，反应体系同第一轮，但扩增引物为125 L。,PCR仪（包括反应体系）,反应条件：预变性95 ，5min，继而95变性50 s，65退火30 s，72延伸90 S，共35个循环，最后72延伸10 min。,加1：20稀释的一抗；,采用EnVision两步法。,切割周围的正常淋巴细胞每例2管，,用Leica ASLMD系统逐个切割组织切片上的CD30阳性细胞（切割参数：激光强度37，波长377，速度5，光束直径8）。,Regulation of NF-kappaB activity by IkappaB-related proteins in adenocarcinoma cells J.,如果在800-1600之间，那么就要同时进行正反向测序才能测出你的片段（因为一个方向上的测序结果最好也只能保证800bp以内是可信的）,肿瘤细胞IB基因突变率高，而反应性增生的淋巴细胞IB基因没有突变。,3 Emmerich F, et al.,（缓冲体系：10X反应缓冲液25 l，MgCL2(25 mmolL)15 l，dNTP(10 mmoLL)10 l，上游引物(10 moL L)05 l，下游引物(10 molL)05 l，Taq酶(5 U L)03 l，,第二轮，反应体系50 l，扩增第一和第二外显子时加引物125 l。,EnVision两步法,采用EnVision两步法。,Regulation of NF-kappaB activity by IkappaB-related proteins in adenocarcinoma cells J.,Leica ASLMD激光显微系统,将冰冻组织切成6m厚连续切片，贴于Leica PEN膜空白切片上，用含005 NP40的丙酮(vv)固定10 min，室温下自然干燥；,Emmerich等人的研究表明HRS细胞中IB mRNA高表达，但在蛋白水平检测的阳性强度弱，可能与HL中泛素化降解活性增强有关，也可能由IB蛋白结构改变导致。,（蓝色-C,红色-T，绿色-A，黑色-G）,这种特殊的瘤巨细胞来源于B淋巴细胞 (镜影细胞),巢式聚合酶链反应(nested polymearse chain reaction, nPCR)也称套式PCR。,反应条件：94预变性5 min，94变性1 min，55退火1 min，72oC延伸1 min，共40个循环，72延伸7min，至4结束。,反应条件：94预变性5 min，94变性1 min，55退火1 min，72oC延伸1 min，共40个循环，72延伸7min，至4结束。,肿瘤细胞和反应性增生的淋巴细胞的IB的突变率都增加,每管DNA样品都要扩增2次，使用上海博亚公司ABI377DNA测序仪对PCR阳性产物进行直接测序。,切割周围的正常淋巴细胞每例2管，,点突变或分子量很小的碱基序列突变,电泳条带不在同一水平线上基因明显突变。,Constitutive nuclear factor-kappaB-RelA activation is required for proliferation and survival of Hodgkins disease tumor cells J.,用Leica ASLMD系统逐个切割组织切片上的CD30阳性细胞（切割参数：激光强度37，波长377，速度5，光束直径8）。,IB基因没有参与霍奇金淋巴瘤的发生和恶化,有研究发现NF-B (RelA/P50)的组成性激活是霍奇金淋巴瘤细胞的特点。,IB基因没有参与霍奇金淋巴瘤的发生和恶化,Leica ASLMD激光显微系统,Constitutive nuclear factor-kappaB-RelA activation is required for proliferation and survival of Hodgkins disease tumor cells J.,第二轮，反应体系50 l，扩增第一和第二外显子时加引物125 l。,肿瘤细胞IB基因突变率高，而反应性增生的淋巴细胞IB基因没有突变。,肿瘤细胞和反应性增生的淋巴细胞的IB的突变率都增加,EnVision两步法,点突变或分子量很小的碱基序列突变,1 Bargou R.,第二轮，反应体系同第一轮，但扩增引物为125 L。,EnVision,两步法,DAKO EnVision,显色系统是将二抗和酶通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个多聚体（即,EnVision,）直接放大信号,40-50,倍，把传统的二抗、三抗分别孵育合为一次孵育。特点：敏感、省时、方便、背景低（避免了内源性生物素干扰）。,