试验十外源基因在大肠杆菌中的诱导表达及检测课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）,1,一.实验目的,1.学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理,2.掌握垂直板电泳的操作方法,一.实验目的 1.学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原,2,二.实验原理,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳:是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）,1967年，Shapiro等人首先发现，如果在,聚丙烯酰胺凝胶电泳,(聚丙烯酰胺凝胶中主要取决于三种因素：蛋白大小，形状和电荷)系统中加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于蛋白质的分子量大小？,二.实验原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳:是在聚丙烯酰胺凝胶,3,SDS的作用,SDS是一种阴离子去垢剂，SO,3,2-,带负电荷。因此蛋白质在含有强还原剂的SDS溶液中与SDS分子结合时，可形成SDS-蛋白质复合物。这种复合物由于结合大量带负电荷的SDS，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了。从而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用,因此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主要取决于,蛋白质,分子大小,SDS的作用SDS是一种阴离子去垢剂，SO32-带负电荷。因,4,当蛋白质的分子量在15,000200,000之间时，样品的迁移率与其分子量的对数呈线性关系。,符合如下方程式：Lg MW =b,m,R,+K,其中，MW 为蛋白质的分子量，m,R,为相对迁移率，b为斜率，K为截距。当条件一定时，b与K均为常数,因此通过,已知分子量的蛋白与未知蛋白的比较，就可以得出未知蛋白的分子量,当蛋白质的分子量在15,000200,000之间时，样品,5,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)按照缓冲液的pH值和凝胶孔径的差异及有无浓缩效应分为连续系统和不连续系统两大类,连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应,不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)按照缓冲液,6,Gel,5%,10%,15%,29,45,66,97,200,29,45,66,97,200,29,45,66,97,200,Gel5%10%15%2945669720029456697,7,将通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维素/PVDF膜上，然后与能特异性识别待检蛋白的抗体进行反应，洗涤去除没有结合的特异性抗体后，加入标记的、能识别特异性抗体的种属特异性抗体，反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体，加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光等，观察有无特异性蛋白条带的出现，也可通过条带的密度大小来进行特异性蛋白的半定量,将通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维素/P,8,试验十外源基因在大肠杆菌中的诱导表达及检测课件,9,试验十外源基因在大肠杆菌中的诱导表达及检测课件,10,操作过程,1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干,准备2个干净的小烧杯2.把玻璃板在灌胶支架上固定好(放好密封条和隔离板),*固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板,操作过程 1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干,准备2个干净的小,11,分离胶(,10%10ml,),浓缩胶,(5%10ml),ddH,2,O,4.05ml,6.8ml,30%Acr,3.3ml,1.7ml,Buffer,1.5mol/L pH=8.8,Tris-HCl 2.5ml,0.5mol/L pH=6.8,Tris-HCl 1.25ml,10%SDS,100l,100l,10%Ap,50l,100l,TEMED,10l,10l,配 胶,分离胶(10%10ml)浓缩胶(5%10ml)dd,12,3.按比例配好分离胶,用移液管快速加入（或直接用小烧杯倒入）,大约5厘米左右,之后加少许蒸馏水（或异丙醇,除泡,）,静置至胶凝,*凝胶配制过程要迅速,催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶。注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡,3.按比例配好分离胶,用移液管快速加入（或直接用小烧杯倒,13,*水封的目的：保持分离胶上沿平直，排气泡*胶凝好的标志：胶与水层之间形成清晰的界面 4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入梳子,静置到胶凝 *梳子需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平,5.拔出样梳后,拆掉密封条，在内槽中加入缓冲液,*用吸瓶将加样孔内和玻璃板下面放密封条位置的气泡全部排出,*水封的目的：保持分离胶上沿平直，排气泡*胶凝,14,6.上样：,（1）marker 5l,（2）细胞样品10 l+2上样buffer 10l 共20l,100沸水浴，3-5min？（蛋白变性）,7.微量注射器（加样器）上样,上样量 15l *微量注射器不可过低,以防刺破胶体；也不可过高,样品下沉时易发生扩散，溢出加样孔,6.上样：,15,8.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在10mA（120V），当进入分离胶后改为20mA（180V），溴酚蓝距凝胶边缘约数cm时，停止电泳,9.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入考马斯亮蓝染色染色液，染色1小时左右 10.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰,*,剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分,11.实验结果分析,8.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流,16,按下式计算相对迁移率：,每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量，这样的标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性,五.分析计算,=,蛋,白,样,品,距,加,样,端,迁,移,距,离,c,m,溴,酚,蓝,区,带,中,心,距,加,样,端,距,离,c,m,相,对,迁,移,率,按下式计算相对迁移率：五.分析计算=蛋白样品距加样端迁移距,17,注意的问题,蛋白质电泳,常用的SDS-PAGE：单一亚基组成的蛋白质,非变性PAGE：多个不同亚基组成的蛋白质,聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套,注意的问题 蛋白质电泳聚丙烯酰胺具,18,？,在不连续体系SDS-PAGE中,当分离胶加完后,需在其上加一层水,为什么?,电极缓冲液中甘氨酸的作用?,在不连续体系SDS-PAGE中,分离胶与浓缩胶中均含有TEMED和AP,试述其作用?,样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟?,？在不连续体系SDS-PAGE中,当分离胶加完后,需在其上加,19,浓缩胶的作用,浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选Tris/HCL缓冲液，电级液选Tris/甘氨酸。电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层,浓缩胶的作用 浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径,20,常见问题及解决办法,1,.纹理和拖尾现象：由于样品溶解不好引起的，克服的方法可以在加样前离心，增加一些增溶辅助试剂如尿素,2,.蛋白带过宽，与邻近泳道的蛋白带相连是由于加样量太多，可以减少上样量,3,.电泳时间比正常要长。可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误，即缓冲系统地PH和被分离物质的等电点差别太小，或缓冲系统的离子强度太高,常见问题及解决办法1.纹理和拖尾现象：由于样品溶解不好引起的,21,4,.指示剂成微笑符号（指示剂前沿呈现向上的曲线形），说明凝胶的不均匀冷却，中间部分冷却不好，导致分子有不同的迁移率所致,5,.指示剂成微笑符号（指示剂前沿呈现向下的曲线形），由于电泳槽的装置不合适，尤其是凝胶和玻璃板组成的“三明治”底部有气泡或靠近隔片得凝胶聚和不完全,6,.凝胶时间不对。通常胶在30min-1H内凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS剂量不够或者失效。APS应该现配现用，TEMED不稳定，易被氧化成黄色。如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量过多，此时胶太硬易裂,4.指示剂成微笑符号（指示剂前沿呈现向上的曲线形），说明凝胶,22,试剂配制,(1)30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr30g，甲叉双丙烯酰胺（Bis）0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中。4，1-2月（2）10%SDS（十二烷基磺酸钠）（3）1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液：称取Tris18.2g，加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.8，最后用蒸馏水定容至100ml（4）1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液：称取Tris12.1g，加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8，最后用蒸馏水定容至100ml（5）0.05mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液：称取Tris0.6g，加 入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.0，最后用蒸馏水定容至100ml,试剂配制 (1)30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr30,23,（7）10%过硫酸铵(AP)（8）TEMED（四甲基乙二胺）（9）样品溶解液：,SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+溴酚蓝（2mg）+甘油（2g）+0.05mol/L pH8.0Tris-HCl（2ml），最后定容至10ml。（10）固定液：50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。（11）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液250ml，过滤后备用,（12）脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至1000ml,（13）电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05mol/LTris-0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml,（7）10%过硫酸铵(AP)（8）TEMED（四甲基乙,24,影响因素,1.溶液中SDS单体的浓度，当单体浓度大于1mmol/L时大多数蛋白质与SDS结合的重量比为1:1.4，如果单休浓度降到0.5 mmol/L以下时，两者的结合比仅为1:0.4这样就不能消除蛋白质原有的电荷差别，为保证蛋白质与SDS的充分结合，它们的重量比应该为1:4或1:3,2.样品缓冲液的离子强度。SDS电泳的样品缓冲液离子强度较低，通常是10100mmol/L,3.二硫键是否完全被还原,影响因素 1.溶液中SDS单体的浓度，当单体浓度大于1mm,25,