结核分枝杆菌传统药敏试验方法课件

,*,*,传统的药敏实验,S J Kim,The Union,结核分枝杆菌传统药敏试验方法课件,药敏试验的目的,耐药监测,-,评估治疗方案,-,选择有效的标准方案,病例管理,-,诊断耐药结核病,(,耐多药,/,广泛耐药结核病）,-,为个体病例,(,耐多药,/,广泛耐药结核病）选择有效的方案,药敏试验的目的耐药监测,问题,可靠性,:,技术重复性,/,临床反应预,测,周转时间,操作可行性及可持续性,成本,问题,基于标本的药敏检测系统,直接法,直接涂片法（涂片阳性）,优点,:,结果快,;,更好的反映耐药情况,缺点,:,大多数药敏试验不理想,;,接种量不容易标化,/,可行性较差,-,间接法,对结核分枝杆菌进行培养后进行药敏试验,优点,:,更好的控制接种量,缺点,:,结果延迟,基于标本的药敏检测系统,以传统的生长检测为基础的,药敏试验方法,以传统生长检测为基础的方法,WHO,（,1963,）的标准方法,绝对浓度法,-Meissner,-,标化接种量,;,药物浓度梯度,抗性比率法,-Mitchison,-,克服培养基中药物浓度变化的缺点,比例法,-Canetti/Grosset,-,临界浓度比例,更好的控制接种量,G Canetti/J Grosset,France;S Froman,USA;P Hauduroy,Switzerland;M Langerova/L Sula,Czechoslovakia;HT Mahler(WHO);G Meissner,Germany;DA Mitchison,England,以传统的生长检测为基础的药敏试验方法,以快速培养生长检测为基础的,药敏试验方法,快培生长系统,观察显微镜下的微小菌落,:,-,玻片培养；显微镜观察的药敏试验（,MODS,）,代谢情况检测,:,-CO,2,产生量,(,放射,BACTEC 460;,色素变化,MB/Bact 3D),-O,2,消耗,(,荧光产生,MGIT960),-TREK,系统,(ESP,培养系列,II),-,微盘：,阿莫拉蓝试验,(,指示管,)/TEMA,-ATP,产生,生物荧光试验,噬菌体检测,:,FASTPlaque;Bonx box(LRP),以快速培养生长检测为基础的药敏试验方法,以检测基因突变为基础的,快速药敏试验系统,扩增目标区的,DNA,测序,聚合酶链反应,-,单链构象多态性分析技术,;,-,探针杂交：反向探针线性杂交方法；,Hain,分枝杆菌药物抗性,plus,分子灯塔,/,信标：,GeneXpert,系统是一个将样品准备、定量扩增和荧光检集于一身并自动进行核酸检测分析的系统,;LAMP(Eiken),核酸环介导等温扩增技术,高效液相色谱应用与扩增的,DNA,的突变检测,以检测基因突变为基础的快速药敏试验系统,药敏试验,的结果可靠性,治疗结果的预测值,-,药敏试验的耐药标准,试验可靠性,-,试验精确度,&,可重复性,药敏试验的结果可靠性,药敏试验的校正,获得最相关的临床耐药标准,可能的敏感株的敏感,级别,在治疗反应变化方面测定敏感性水平,从未接受过治疗的患者,(PS),与至少接受,5/6,个月治疗的患者,(PR),的标本菌株的敏感性进行比较,PS=100,菌株,;PR=50,菌株,Cantti G,et al.Bull WHO 1969;41:21-43.,药敏试验的校正获得最相关的临床耐药标准Cantti G,可能敏感菌株,/,（可能无耐药性菌株）在不同药物浓度下的抑菌分布,Minimal inhibitory concentrations(MIC),最小抑菌浓度,Frequency of strains,Clinically,susceptible,strains(PS),Break,point,1 SD,3 SD,可能敏感菌株/（可能无耐药性菌株）在不同药物浓度下的抑菌分,不同药物浓度下可能敏感菌株和可能耐药菌株最低抑菌浓度的分布,Frequency of strains,Minimal inhibitory concentrations(MIC),Break,point,*Technical,variation,(inoculum/,media/drug,concent.),Clinically,susceptible,strains(PS),Clinically,resistant,strains(PR),不同药物浓度下可能敏感菌株和可能耐药菌株最低抑菌浓度的分布,不同药物浓度下可能敏感菌株和可能耐药菌株最低抑菌浓度的分布,Frequency of strains,Minimal inhibitory concentrations(MIC),PS,PR,2 mcg/ml,Break,point,13.1 as“R”,75.8,11.1 as“S”,不同药物浓度下可能敏感菌株和可能耐药菌株最低抑菌浓度的分布,可能敏感,/,可能耐药菌株对利福平的最小抑菌浓度的累积分布,（此试验采用,L-J,培养基用绝对浓度法）,85.8,可能敏感/可能耐药菌株对利福平的最小抑菌浓度的累积分布（此,不同药物浓度下可能敏感菌株和可能耐药菌株最低抑菌浓度的分布,Frequency of strains,Minimal inhibitory concentrations(MIC),Break,point,*Inoculum,variation,Clinically,susceptible,strains(PS),Clinically,resistant,strains(PR),不同药物浓度下可能敏感菌株和可能耐药菌株最低抑菌浓度的分布,可能敏感和可能耐药的结核分枝杆菌临床分离株对氧氟沙星敏感性分析,采用,L-J,培养基,Do not quote this data!,(n=81)(n=111),可能敏感和可能耐药的结核分枝杆菌临床分离株对氧氟沙星敏感性,校正的乙胺丁醇的临界浓度,(,此试验采用改良罗氏培养基的绝对浓度法,),42%,50%,校正的乙胺丁醇的临界浓度(此试验采用改良罗氏培养基的绝,可能敏感和可能耐药的结核分枝杆菌临床分离株对卡那霉素敏感性分析,In L-J Medium,In 7H10 Medium,67%,67%,可能敏感和可能耐药的结核分枝杆菌临床分离株对卡那霉素敏感性,抗结核药物的最低抑菌浓度比平均峰值,EMB,ETH,OFX,CFX,INH,RMP,KM,CPM,PAS,SM,抗结核药物的最低抑菌浓度比平均峰值EMBETHOFXCFXI,推荐的临界浓度,药物,LJ*,7H10,7H11,Bactec 460,MGIT 960,异烟肼,0.2,0.2,0.2,0.1,0.1,利福平,40.0,1.0,1.0,2.0,1.0,乙胺丁醇,2.0,5.0,7.5,2.5,5.0,链霉素,4.0,2.0,2.0,2.0,1.0,吡嗪酰胺,NR,NR,NR,100.0,100.0,卡那霉素,30.0,5.0,6.0,4.0,阿米卡星,40.0,1.0,1.0,卷曲霉素,40.0,10.0,10.0,1.25,2.5,环丙沙星,2.0,2.0,2.0,2.0,1.0,氧氟沙星,2.0,2.0,2.0,2.0,2.0,莫西沙星,0.5,0.25,加替沙星,1.0,乙硫异酰胺,5.0,10.0,2.5,5.0,丙硫异烟胺,40.0,1.25,2.5,PAS,1.0,2.0,8.0,2.0,环丝酰胺,40.0,NR,NR,NR,NR,氨苯硫脲,NR,NR,NR,NR,NR,利奈唑酮,1.0,1.0,*Proportion,WHO,推荐药敏试验的临界浓度,2007,推荐的临界浓度药物LJ*7H107H11Bactec 460,抗结核药物药敏试验,程序复杂：必须在有质量保证的实验室才能实施,2.,试验操作危险大：操作只能在拥有好的设施及设备的实验室,(BSL-3),进行，而且所有的实验室工作人员都要熟练的掌握每个程序,抗结核药物药敏试验,影响药敏试验结果的物理化学环境因素,培养基中活动性,/,精确的药物浓度,药粉,.,试剂,效价：剂量,/,溶解,/,稀释,/,存储,purity x active fraction x H,2,O,EMB:99%purity;C,10,H,24,N,2,O,2,.2HCl(277.2-72.9=204.3);no water;0.99 x 0.74 x 1.0=0.7326;,1000 mg733 mg,-,培养物的制备：,(1),灭菌过程中热失活,(2),蛋白结合；,(3),拮抗剂,/,离子,(4),pH,值,接种量,:,-,接种量,/,离散度,/,可代表性,-,组织物的可行性试验,影响药敏试验结果的物理化学环境因素,浓缩过程中利福平的稳定性,浓缩过程中利福平的稳定性,抗结核药物的储存,在密封的硅胶容器内储存,(,最好在真空下储存,),结核分枝杆菌传统药敏试验方法课件,药敏试验接种物的制备,Inoculate 0.1 ml,volume of inoculum,onto each medium,药敏试验接种物的制备Inoculate 0.1 ml,比例法,(by,Middlebrook&Cohn,),Dilute,稀释,1,mg,/,ml,bacterialsuspension to 10,-3,&10,-5,mg,/,ml,by serial 10 fold dilution.,Plant,接种,0.1,ml,onto each slope of drug-free or containing medium,制备培养基,Observe,观察,the growth after 4 weeks incubation(if the growth is poor,again after 6 weeks).,观察,4,周生长情况（如果培养基质量较差应观察,6,周）,Report,报告,the proportion of colonies grown at the critical concentration of the drug.,在药物的临界浓度报告结果,Drug free Isoniazid Ethambutol,Inoculum media,0.2,mcg/ml,2.0,mcg/ml,10,-3,+3,10,-5,26 9 0,%resistant,34.6,0.1,Interpretation,Resistant,Susceptible,比例法(by Middlebrook&Cohn)Di,药敏试验结果,-1,1.,If use nichrome wire(0.7 mm wire/3 mm of internal diameter),inoculate oneloopful of bacterial suspension of 10,-2,/or if use pipette,inoculate 0.1 ml of 10,-3,/of bacterial suspension,2.,If use nichrome wire,inoculate one loopful of 10,-4,/bacterial suspension or if use pipette,inoculate 0.1 ml of 10,-5,/.,Drug,None,INH,RIF,SM,EMB,PNB,Concentrations,(,/,),0,0.2,40.0,4.0,2.0,500.0,Tube No,C1,H1,R1,S1,E1,PB,Inoculum(10,-4,),1,3+,2+,1,18,7,0,Tube No,C2,H2,R2,S2,E2,Inoculum(10,-6,),2,28,2,0,0,0,Interpretation,R(7.1)(2/28x100),S(0.03),(1/2800 x,100),S(0.6),(18/2800 x100),S(0.3),(7/2800 x,100),MTB,药敏试验结果-11.I