实验十模式植物拟南芥TDNA插入突变体的鉴定课件

,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Company Logo,#,Click to edit Master title style,LOGO,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Click to edit Master title style,模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定,西南大学,模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定西南大学,目录,拟南芥的栽培,拟南芥,T-DNA,插入突变体,的,PCR,鉴定,实验设计思路和原理,目录拟南芥的栽培拟南芥T-DNA插入突变体实验设计思路和原理,2,实验设计的思路和原理,经典遗传学,是从生物的性状、表型到遗传物质来研究生命的发生与发展规律。一般是随机突变基因，从表型变化入手去研究和确定基因的遗传规律、结构特征、在染色体上的位置，并克隆基因的序列。,反向遗传学,则是在获得生物体基因组全部序列的基础上，通过对靶基因进行特定的加工和修饰，如定点突变、插入、,缺失、置换等，再研究这些修饰对生物体的表型、性状可能有何种影响，从而了解基因和其编码蛋白质在生物体内的功能。,实验设计的思路和原理经典遗传学 是从生物的性状、表型到遗传,3,拟南芥（,Arabidopsis thaliana,）又称为阿拉伯芥，是一种十字花科植物，广泛用于遗传、发育和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式植物。该植物具有以下特点：,植株形态个体小，高度只有30cm左右，1个茶杯可种植好几棵；,生长周期快，每代时间短，从播种到收获种子一般只需,8,周左右；,种子多，每株可产生数千粒种子；,形态特征简单，生命力强，用普通培,养基就可作人工培养；,基因组小，只有5对染色体。,拟南芥是严格的闭花自花受粉植物，,基因高度纯合。易获通过理化处理,获得各种功能的突变体。,模式植物拟南芥,拟南芥（Arabidopsis thaliana）又称,4,生长周期,形态结构,模式植物拟南芥,生长周期形态结构模式植物拟南芥,5,突变体的获得,插入突变（,insertional mutagenesis），,即将外源DNA随机插,入到拟南芥基因组中而获得其突变体。植物中最常见的插入突变方法是,T-DNA,插入突变。,农杆菌转化法：,Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，质粒上有一段特殊的DNA区段，当农,杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移，插入植物染色体DNA,中，Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。,T-DNA插入到植物染色体上的位置是随机的。如果T-DNA插入某个功,能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。利用,农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。,突变体的获得插入突变（insertional mutagen,6,模式植物拟南芥,2000,年，拟南芥全部基因组测序已经完成，是人类首次完成了一种高等植物的基因组全序列测定。每个单倍染色体组（n=5）的总长只有7000万个碱基对（只有小麦染色体组长的1/80），预测共有29,454个基因。这样科学家就可以准确定位插入DNA的位置。,现在，特异性敲除基因的拟南芥种子库已经创建，向全世界的科研人员开放。研究一个特定基因的研究人员可以迅速、便利地在种子文库中搜索该基因被关闭的拟南芥品系，然后向拟南芥生物资源中心订购。,模式植物拟南芥 2000年，拟南芥全部基因组测序已,7,T-DNA,方向,PCR,鉴定,T-DNA,插入突变体的原理,T-DNA,的长度在,10kb,左右，一般,PCR,反应不能跨,T-DNA,扩出条带。,WT,：两个等位基因上都能被,LP+RP,扩出，而,BP+RP,不能扩出条带。,HM(,纯合子,),：两个等位基因上都有,T-DNA,插入，能被,BP+RP,扩出，而不能,LP+RP,扩出条带。,HZ(,杂合子,),：两个等位基因中的一个有,T-DNA,插入，能被,BP+RP,和,LP+RP,扩出条带。,T-DNA方向PCR鉴定T-DNA插入突变体的原理T-DNA,8,实验目的,1,熟练掌握植物基因组,DNA,快速提取的方法；,2,掌握利用,PCR,方法鉴定拟南芥,T-DNA,插入突变体的方法。,实验目的1熟练掌握植物基因组DNA快速提取的方法；,9,野生型（,Col,）、,ibm1,突变体（,SALK_023533,）拟南芥植株,IBM1(AT3G07610),是拟南芥中组蛋白修饰酶的编码基因，能影响植物的诸多的发育和生殖过程。,实验材料,ibm1,突变体：,开花延迟,叶片卷曲,果荚短小,花粉粒败育,野生型（Col）、ibm1突变体（SALK_023533）拟,10,ibm1,是一个隐性突变：只有纯和的突变体植株才有与野生型的性状差异；杂合的植株表型与野生型一致。,如何确定,F2,代中基因型的分离比是,1,：,2,：,1,？,传统遗传方法：,F2,代做测交或者自交；,现代分子遗传方法：,PCR,鉴定。,ibm1是一个隐性突变：只有纯和的突变体植株才有与野生型的性,11,试剂：,1.CATB,法提取,DNA,：液氮、,2,CTAB,抽提缓冲溶液、氯仿：异戊醇,=24,：,1,、无水乙醇、,70%,乙醇、,TE,2.PCR,：,ddH2O,、,Buffer,、,MgCl,2,、,dNTP,、引物（,LP,、,RP,、,BP,）、,DNA,模版、,Taq DNA,聚合酶,3.,电泳：琼脂糖、,Maker,、,Buffer,、,EB,、,TAE,仪器：,离心机，水浴锅，移液器，,PCR,仪，电泳槽，紫外成像仪,实验器具和试剂,试剂：实验器具和试剂,12,实验步骤,-,拟南芥的栽培,一,.,在播种前将种子进行消毒，然后置于,4,冰箱中，使种子在湿润条件下春化,2,至,3,天。,二,.,将春化好的种子播种于有麦氏培养基（,MS,培养基）的培养皿中，置于培养室内培养。,三,.,待幼苗长出后，再选择茁壮的幼苗移栽到土壤中，置于培养室内培养。,实验步骤-拟南芥的栽培一.在播种前将种子进行消毒，然后置于4,13,实验十模式植物拟南芥TDNA插入突变体的鉴定课件,14,实验步骤,-,拟南芥T-DNA插入突变体PCR鉴定法,一,.,提取植物,DNA,；,二,.PCR,反应；,三,.,琼脂糖凝胶电泳；,实验步骤-拟南芥T-DNA插入突变体PCR鉴定法一.提取植物,15,一.提取植物DNA的步骤,(,略,),一.提取植物DNA的步骤(略),16,二.PCR鉴定,试剂,单管,I,（,l,）,混合,I,单管,II,（,l,）,混合,II,ddH,2,O,16,160,16,160,10Tap buffer(Mg,2+,free),2.5,25,2.5,25,模板,DNA,（,30-50ng/ul,）,2,-,2,-,引物,LP,（,10um,）,1,10,NO,引物,RP,（,10um,）,1,10,1,10,引物,BP,（,10um,）,NO,1,10,dNTP(,各,2.5mM),2,20,2,20,Tap,酶（,5U/ul,）,0.5,5,0.5,5,反应体系总体积,25,25,1.,制作反应体系,（先混合在分装最后单独加模板）,二.PCR鉴定试剂单管I（l）混合I单管II（l）混合I,17,2.,反应程序,过程,温度,/,时间,预变性,94,5min,变性,94,30s,退火,56,30s,延伸,72,80s,延伸后处理,72,10min,35,循环,注意：,1.,每管分装多少,ul,2.,标记清楚,3.,反应前混合、离心,4.,盖温，防蒸发,2.反应程序过程温度/时间预变性945min变性94 3,18,从,F1,代杂合植株自交产生的后代分离群体，提取了群体中每个单株的基因组,DNA,，现在需通过,PCR,方法鉴定每一单株的基因型。,LP:JDM17-1NR2,RP:JDM17-1F2,BP:LBb1.3,理论的条带长度：,LP+RP:1200bp,RP+BP:900bp,PCR,安排：,每小组按,10,倍准备混合体系；,每个同学需做一颗植株的鉴定（两管,PCR,）。,从F1代杂合植株自交产生的后代分离群体，提取了群体中每个单株,19,三.琼脂糖凝胶电泳,1.,用,TAE,电泳缓冲液配置,1,琼脂糖凝胶；溶胶后加入,Goldview,染料；,2.25uL PCR,产物，加,5uL,上样缓冲液,(6x),混匀；点样,8-10ul,于,1%,琼脂糖胶上电泳,稳压,150,（,5,/cm,）；,3.,电泳结束，在紫外成像仪下观察、拍照，然后分析条带。,4.,确定每一株拟南芥的基因型，统计全班的结果计算群体中的分离比例。,三.琼脂糖凝胶电泳1.用TAE电泳缓冲液配置1琼脂糖凝胶；,20,实验报告,1.,电泳图,+,分析，确定每个单株的基因型；,2.,全班基因型统计，计算比例，卡方检验。,基因型,野生型,纯合子,杂合子,株数,比例,基因型,植株编号,+/+,+/,ibm1,ibm1,/,ibm1,实验报告1.电泳图+分析，确定每个单株的基因型；基因型野生型,21,Thank You!,Thank You!,