肿瘤治疗——RNA干扰课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,肿瘤治疗RNA干扰,093338,刘忠柳,潜之柱九废插汐魁敦锌蓑毒蓟帛披尼制乃腔有迸卉油柯咒呕贷卞稗燕拥叶肿瘤治疗RNA干扰肿瘤治疗RNA干扰,肿瘤治疗RNA干扰093338潜之柱九废插汐魁敦锌蓑毒蓟,1,outline,什么是RNA干扰,RNA干扰的机制,RNA干扰和肿瘤治疗,实例：乳腺癌,琢掀萨眶探唤且里遭讽赖掐娟柳脸褥磨梢她危嫁祈叔迪哈尾饱虚嘘鳖奶裂肿瘤治疗RNA干扰肿瘤治疗RNA干扰,outline什么是RNA干扰琢掀萨眶探唤且里遭讽赖掐娟柳脸,2,什么是RNA干扰（RNAi）,RNAi 是指小分子双链RNA（dsRNA)抑制同源序列基因的表达,目前，已知具有功能作用的小分子干扰RNA 主要包括小干扰RNA（,s i R N A,）、微小R N A（,m i R N A,）和Piwiinteracting RNA（,piRNA,）3 类,讼嫌吁调瞻瞄社捷渗趟辽贤跪眺著尿甫当遮壤疡柜皮单僚分锡掣叹唬抖症肿瘤治疗RNA干扰肿瘤治疗RNA干扰,什么是RNA干扰（RNAi）RNAi,3,主要特征：,1.特异性：,RISC与目的基因mRNA地结合严格遵循,碱基互补原则,2.高效性,RNAi过程中将以,siRNA为引物,，,mRNA为模板,不断地合成dsRNA，组装RISC,反应效果得以放大,3.siRNA浓度依赖性,高浓度地siRNA不但增强反应效力，还能抵抗RNA依赖性腺苷酶对反应地抑制。,4.dsRNA长度限制,长度200-500bp地dsRNA能与Dicer酶较好的结合,5.靶基因位点的选择,作用的位点一般位于外显子内,对内含子和启动子无效,邵曝劝耍济茸拂源袜轮往吹最萝甲钝拥给掠粱税号啃搽括恍纹恒牧孺抬替肿瘤治疗RNA干扰肿瘤治疗RNA干扰,主要特征：邵曝劝耍济茸拂源袜轮往吹最萝甲钝拥给掠粱税号啃搽括,4,RNAi机制,庚它厅统钩易虽烟羞狗晦蚁招垃蔗擒列放些成僵赫拟办漠栅淹略闯俺期赫肿瘤治疗RNA干扰肿瘤治疗RNA干扰,RNAi机制庚它厅统钩易虽烟羞狗晦蚁招垃蔗擒列放些成僵赫拟办,5,siRNA引起的基因沉默,细胞内的dsRNA被RNase!家族中双链特异的,Dicer 核糖核酸酶,以ATP 依赖的方式切割成siRNA。Dicer 酶含有一个解螺旋酶结构域、一个PAZ 结构域、一个dsRNA 结合结构域和2 个RNaseIU 结构域。其中,PAZ 结构域是Argonaute 基因家族的保守结构域,与RNA 结合有关。解螺旋酶结构域可能催化dsRNA 解螺旋,有利于Dicer 酶切割。被Dicer 酶切割成的siRNA 具有相似的结构特征:长为21 23 核苷酸(Nucleotide,nt)的双链RNA,5单磷酸和3羟基末端,互补双链的3端均有2 3 nt 的单链突出。siRNA 中的一条链与蛋白复合物结合后形成RISC,同时解链,正义链离开,然后反义链在ATP 的作用下,通过碱基互补配对原则与同源的靶mRNA 结合,在核酸内切酶的作用下,将靶mRNA 切断,从而阻断其翻译成蛋白质RISC 是一种核酸和蛋白质的复合物(包括蛋白质和siRNA),已经在果蝇和人类细胞中得到纯化,而且都含有Argonaute 蛋白家族的成员 8,这种蛋白被认为是RISC 复合物的核心成分。另一种情况是,与mRNA 结合后,在依赖于RNA 的聚合酶作用下以mRNA 为模板、siRNA 为引物指导合成dsRNA,然后Dicer 酶再切割,导致mRNA 的降解,雀挡潘慑齐映拷指馁汝斡宵曹痕掺义雁栈祁沪某楼乒殿归塌滋熄炉吊发梳肿瘤治疗RNA干扰肿瘤治疗RNA干扰,siRNA引起的基因沉默雀挡潘慑齐映拷指馁汝斡宵曹痕掺义雁栈,6,miRNA 诱导的基因沉默,miRNA 主要是通过,抑制翻译,过程来实现基因的沉默。,大多数miRNA 与底物mRNA 不完全配对结合,成熟的双链miRNA 会很快被整合miRISC 中。成熟miRNA 结合到与其序列互补的mRNA 位点,通过2 种依赖于序列互补机制负性调控靶基因的表达。通过,抑制翻译,还是,降解,而发挥作用是由miRNA 和它的目的mRNA 之间的,错配程度,决定的,由于miRNA 可以对不完全互补的mRNA 配对来抑制蛋白质的翻译过程,因而每个miRNA 可以有多个靶基因,而几个miRNA可以调节同一个基因。,员锯踞酸街恢叉漓檬考拂土则星四椅抨灯铀略尝扇付颁慰梨让谩粒衔一柞肿瘤治疗RNA干扰肿瘤治疗RNA干扰,miRNA 诱导的基因沉默员锯踞酸街恢叉漓檬考拂土则星四,7,RNA干扰和肿瘤治疗,最初RNAi在肿瘤学的应用主要是针对突变的肿瘤基因、增生、转位和病毒基因，阐明其功能以及和其它基因之间的相互联系。应用RNAi技术探索各种基因的功能及相互作用为筛选新的药物靶基因提供了便利。RNAi 已用来加强现存药物如伊马替尼（imatinib）和雷帕霉素的作用。,现在RNAi还主要运用于研究方面。未来的方向主要是把RNAi从研究中广泛地运用到临床的恶性肿瘤治疗上。,屉被取裕嘴覆痪滇耀拭汁野棘烛数穗班糖峰崇琅伍都态营社邵子镇滋饱峻肿瘤治疗RNA干扰肿瘤治疗RNA干扰,RNA干扰和肿瘤治疗 最初RNAi在肿瘤学的应,8,RNAi 所面临的问题,RNAi用于临床肿瘤治疗要解决两个问题，首先如何把有效的干扰 RNA 带到肿瘤细胞内，对特异性靶基因产生特异性的抑制作用；其次，如何避免RNAi 带来的副作用。,渡钝擎矛蚌种惊啊里子进镀水驴乌搪遍清旦暖妊弯嗜革尹泊碴史洪账函酒肿瘤治疗RNA干扰肿瘤治疗RNA干扰,RNAi 所面临的问题渡钝擎矛蚌种惊啊里子进镀水驴乌搪遍清,9,载体问题,血流中的 siRNA 或 DNA 很难通过细胞膜屏障和逃避内体溶酶体的降解作用。为了提高 siRNA 的运载效率，学者们发展了很多,病毒和非病毒运载体系,，大大提高了运载 siRNA 的效率。如基于逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒的运载系统在体内外均实现了RNAi 介导的基因沉默；阳离子脂质体或聚乙醇胺均用作 siRNA 运载体。,壳聚糖,是一种阳离子多糖，已广泛用于药物的运载，特别是DNA 介导的基因治疗药物的运载。,纲刨幕涌碱诸匪凸蛰码畔桓绰侣定铀读魔淤阶虫痈杨岔编嫩酥毅技卯幸贩肿瘤治疗RNA干扰肿瘤治疗RNA干扰,载体问题纲刨幕涌碱诸匪凸蛰码畔桓绰侣定铀读魔淤阶虫痈杨岔编嫩,10,脱靶效应,如果考虑将 siRNA 作为治疗药物，须考虑它的序列特异性和评估它的脱靶效应的危险性。siRNA产生脱靶效应主要基于以下3个方面：,（1）由于 siRNA 均含有 dsRNA 序列，因此它可能会诱发机体的天然免疫应答，如干扰素应答。,（2）转染或表达的 siRNA 可能会产生一些非特异性效应。,（3）尽管设计的 siRNA 与目的基因互补，但也可能和非靶基因 mRNA 互补。,招署者苛剪遂趣阑晦纪坪巫渺巫床握妻伎洞幽话检姚春哟冶糕蔬桐经造宫肿瘤治疗RNA干扰肿瘤治疗RNA干扰,脱靶效应招署者苛剪遂趣阑晦纪坪巫渺巫床握妻伎洞幽话检姚春哟冶,11,RNAi的致命缺陷,美国研究人员发现,接受特定 RNA(核糖核酸)干扰技术治疗的实验鼠,可能会死于肝功能衰竭或并发症。RNA干扰是近几年发展起来的一项医学技术,它能够定向关闭生物体内的某一基因,使其不发挥作用。研究人员们由此认为,采用 RNA干扰技术直接从源头上让致病基因“沉默”,可以更有效地治疗包括艾滋病在内的许多绝症。但美国斯坦福大学的研究人员将 49 种不同的大剂量短发夹状 RNA注入实验鼠肝细胞后发现,有 36种短发夹状 RNA损害了实验鼠的肝脏,其中 23 种短发夹状 RNA导致实验鼠在两个月内死亡。进一步研究表明,这些致命的短发夹状 RNA,有抑制细胞利用原有的调控因子-微 RNA的能力,。,免麻稽且征兄珐惧枕缩护扣楷痔柑护拿享哮闷诀帽枚锯岸滇搅褪拣堪艾纪肿瘤治疗RNA干扰肿瘤治疗RNA干扰,RNAi的致命缺陷免麻稽且征兄珐惧枕缩护扣楷痔柑护拿享哮闷诀,12,实例：乳腺癌,cx cr4基因,在器官形成,脉管的生成,自体免疫,在具有高度浸润性人乳腺癌 MDA-MB-231细胞中,cxcr4基因的表达活性非常高。RNA i抑制 cxcr4基因的表达后,这些有高度浸润性的人乳腺癌 MDA-MB-231细胞的浸润性明显地下降。Be rga m asch i等通过 RNA i介导产生了p53依赖的细胞凋亡,从而为表达野生型 p53的肿瘤如乳腺癌等的治疗提供了新的可能。,在多种肿瘤组织中,E2F1,高表达促进肿瘤发展和转移。在乳腺癌中,E2F1表达升高与乳腺癌的浸润性有关,E2F1是乳腺癌的预测标记。M il ner和 Xia等采用 RNA i技术构建重组的表达E2F1 siRNA的逆转录病毒载体,将重组载体和空载体转染入人乳腺癌 MCF-7细胞中,结果显示重组的逆转录病毒载体转染组与对照组相比,E2F1 mRNA表达显著降低,采用逆转录病毒做载体介导的 RNA i能特异、显著地抑制目的基因的表达。,目前肿瘤化疗失败的原因之一是,肿瘤细胞对化疗药物的多药耐药(MDR),。MDR 是指由一种药物诱发,导致细胞对该药耐药的同时,对其他结构和作用机制无关的化疗药物亦产生交叉耐药的一种现象。其中,肿瘤细胞,m dr1基因,编码的一种分子量为 170 kD 的细胞膜 P-糖蛋白(per m eab ili ty-g lycoprote i n,P-gp)过度表达是导致肿瘤细胞产生 MDR的重要原因。Wu等针对 mdr1基因设计出与之同源的 siRNA,连接到 Psilence3-1-H 1H ygro载体上,转染入人乳腺癌细胞系 MCF-7/ADR 中,经检测 MCF-7/ADR细胞经特异性 si RNA 作用后,P-gp的表达率由 99.8%下降 到 12.3%,细 胞 对 阿 霉 素 的 IC50 由 17.88 下 降 到0.51 um o l/L,证明了由 s i RNA 引发的 RNA i可特异性的降低mRNA水平,引发 m dr1基因沉默,从而逆转 MDR 表型,提高乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性。,淡郭桐穿矽非蛀倘宋迢截掘宗迁焰挛詹舒寻抨宠亢墓涕窥辽尘显厦吱磨梗肿瘤治疗RNA干扰肿瘤治疗RNA干扰,实例：乳腺癌 cx cr4基因在器官形成,13,