色谱分析法第七章 液相色谱分离方法

,*,色谱分析法,单击此处编辑母版文本样,退出,页,出版社 社文分社,1,第七章液相色谱别离方法,2,7.1固定相的作用,在液相色谱中通常都强调流动相的作用，如流动相的极性、选择性和优化等，这是因为在液相色谱中流动相参与柱色谱过程的分配作用，而且组分的最正确别离在很大程度上取决于流动相的选择和优化，并因此而忽略了柱子在液相色谱别离过程中的作用。其实液相色谱的开展主要是柱子和固定相的开展，色谱别离技术的开拓和商业竞争的焦点往往集中于固定相和柱子。固定相和柱子是两个相关而又不尽相同的两个问题，柱子包括固定相，但柱子还有柱型、柱尺寸、柱材料以及像离子色谱中的柱配置等问题。,天然化合物多种多样，它们可以按分子大小、极性、离解度和空间结构等方法分类，而这些化合物又通常可被某一溶剂溶解，甚至在溶液中解离。而其中固定相在不同类化合物的别离中起着相当重要的作用，它决定了物质的别离过程，也决定了流动相的根本性质。,3,7.2吸附色谱,吸附色谱Adsorption Chromatography，文献中也称之为液固色谱Liquid Solid Chromatography或正相色谱Normal Phase Chromatography。吸附一词可能更准确地反映这类别离过程的本质，并与液相色谱的其他技术相区别。,7.2.1别离原理,7.2.2固定相,吸附色谱中目前最常用的固定相是硅胶，其次是氧化铝，为了某些样品的别离，也使用苯乙烯二乙烯苯等聚合物作为吸附剂。硅胶外表的SiOH是最主要的吸附点，氧化铝中Al3+是显著的吸附中心。选择吸附剂的原那么是样品的性质和吸附剂本身具有的品质。这些品质包括颗粒形状、颗粒直径、外表积、孔径以及吸附剂外表的酸碱性等。附表7.1中列出了局部吸附剂的商品名称、特点和生产厂家，以硅胶为主。,4,7.2.3流动相,在吸附色谱中，固定相是极性吸附剂，因此流动相多以非极性溶剂为主。可作为流动相的溶剂很多，根据式7.5可以把它们按照0的大小排列成表(见表6.7)，这种排列称为洗脱系列。这个表所列的数据是在氧化铝柱上测定的，使用硅胶柱时顺序不变，0SiO2 的数值相当于0Al2O3的0.8倍左右。,这些溶剂大致可分为3类：一类是非极性的，如正己烷等烃类；一类是中等极性的，主要是卤代烷、酯类；一类是极性的，醇和乙腈；等等。水虽然是极性很强的溶剂，但水分子会永久地吸附在吸附剂的外表，导致活性降低而失去别离作用。,5,图7.1 二元混合物的溶剂强度SiO2O2),6,7.2.4溶质的保存,功能团的极性越大，吸附作用越强，水的氢键作用甚至导致永久性吸附。,图7.2 吸附色谱硅胶柱流动相对溶质保存的影响,7,在功能团相同的情况下，分子的体积由于和数目的不同而不同。,同分异构体，主要指几何异构体，由于空间结构的差异，在吸附剂外表上的吸附强度相差很大。,7.3分配色谱,分配色谱Partition Chromatography以溶质在流动和固定两相中的分配为根底。在现代液相色谱中分配色谱大致分为两类：一类类似气液色谱，把固定液涂布于惰性担体上，为液液分配色谱。但在液相色谱中流动相是液体，由于固定液在流动相中的溶解而不能稳定地保持在担体上而给操作带来麻烦；另一类使用键合固定相，即把有机化合物的一局部通过化学反响键合在担体的外表上，而克服了固定液的流失现象，因此，使用这类固定相的色谱过程也称为键合相色谱Bonded Phase Chromatography。,8,7.3.1别离原理,在分配色谱中流动相和固定相是互不相溶的两种液体，溶质既溶解于固定相，也溶于流动相中，并根据在两相中的溶解度不同而分布于两相中，类似液液萃取过程。,7.3.2固定相,载体,图7.3 硅胶外表化学,9,键合反响,固定相的性质,7.3.3流动相,图7.4反相HPLC主要溶剂与水混合时溶剂强度的比较，,ACN乙腈，MeOH甲醇，THF四氢呋喃,10,2)正相色谱,反相色谱,图7.5 反相HPLC中流动相pH值对组分别离的影响,11,图7.6离子强度对PTH乙内酰苯硫脲,组氨酸H和精氨酸R衍生物保存的影响,12,7.3.4溶质的保存,以键合固定相为根底的分配色谱，特别是反相色谱，由于流动相选择的随意性，可分析的样品范围非常广。,7.4离子对色谱,离子对色谱IonPair Chromatography源于液液萃取过程，是经典的离子型化合物的别离方法。,7.4.1别离原理,7.4.2离子对试剂,7.4.3固定相,在反相离子对色谱中主要使用键合相。键合固定相对别离的影响主要是外表覆盖程度和键合相的种类。比较差的固定相难以得到重复性的结果，也难以对别离作出预测。常使用的固定相是C18或C8键合相，短链的稳定性比较差。,13,7.4.4流动相,(1)介质,(2)对离子的浓度,(3)有机改性剂,图7.7 固定相中配对离子浓度mol/g)对K(对数值的影响,14,7.4.5应用,离子对色谱主要用于离子型或可离子化的化合物，这些化合物多数与生命科学有关系，如天然化合物、合成药物、生物体液等。这些化合物如果不经过处理采用常规正、反相色谱方法是难以分析的。因此，在这些领域的研究中，离子对色谱具有广泛的用途。,7.5离子交换与离子色谱,离子交换现象作为一种色谱技术始于20世纪50年代氨基酸的分析，并成为现代液相色谱技术开展的开端。虽然其他色谱技术也可以别离离子型化合物，但相比之下离子交换色谱Ion Exchange Chromatography和以离子交换为根底的离子色谱Ion Chromatography在离子型化合物的分析中，特别是环境、食品及金属化合物等样品的分析中仍具有广泛的用途。,7.5.1离子交换原理,7.5.2固定相,15,聚合物交换剂,化学性质,物理结构,图7.8 离子交换剂的类型,16,硅胶键合相,7.5.3流动相,图7.9 硅胶键合离子交换剂的化学结构,17,图7.9 硅胶键合离子交换剂的化学结构,18,7.5.4离子色谱,图7.11双柱离子色谱工作,原理示意图,19,图7.12 离子色谱抑制膜工作原理,20,7.5.5离子色谱流动相,离子色谱流动相虽然总的趋势是降低离子强度，但双柱和单柱仍有不同。除离子别离的共同目的外，双柱要考虑离子抑制形式，单柱只考虑与检测方法的匹配。,双柱,阴离子,阳离子,单柱,21,阴离子,阳离子,假峰,7.6体积排阻色谱,溶质分子在多孔填料外表上受到的排斥作用称为排阻exclusion。产生排阻现象的原因很多，如带电粒子的电荷，溶质分子的大小和空间结构，等等。根据这种现象，将溶质别离的色谱过程称为排阻色谱。,7.6.1别离原理,固体填料外表有不同尺寸的孔，它们按一定规律分布，并在制造过程中加以控制。试样中溶质的体积，即分子量，也不同，对于齐聚物，分子大小的分布也有一定规律。现在用一个孔来说明溶质的别离过程。,22,图7.14 体积阻组色谱的校正曲线,23,7.6.2固定相,图7.15 孔径与别离范围之间的关系,7.6.3流动相,7.7.1根本原理,7.7.2配体,配体应具有以下性质：与反配体物生成可逆复合物；生成的复合物具有选择性，并在一定条件下要有足够的稳定性；具有可固定在载体上的功能团，且反响具有专一性，防止非特异吸附及其他反响。,24,特异性配体,非特异性或组特异性配体,7.7.3载体,(1)有机或生物聚合物，如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等软性载体。,(2)合成聚合物，如高交联度苯乙烯二乙烯基苯共聚物、聚丙烯酰胺、N丙烯酰基吗啉与N,N亚甲基一二酰胺共聚、羟基甲基丙烯酸、乙酯与二甲基丙烯酸乙烯酯共聚以及三丙烯酰基聚合物等。,(3)无机物，如多孔玻璃、硅胶和氧化铝等。,7.7.4载体活化,载体活化很重要。在溴化氰活化法Axen.R.1967引入之前，活化一直是影响亲和色谱开展的障碍之一。配体固定在载体上称为固定化。配体要固定在载体上它们之间必须有相互作用的极性基团，才能形成稳定的固定相。,25,7.7.5固定化,图7.16 间隔臂对配体效率的影响,7.7.6洗脱,吸附,洗脱,7.8手性色谱,饱和碳原子可以结合四个原子或基团形成以碳原子为中心的四面体结构。当与碳联结的四个原子或基团完全不同时，可能出现两个分子不能重叠的现象。,26,7.8.1别离原理,1固定相液体或固体是手性的，流动相是非手性的。,2固定相是非手性的，流动相是手性的，即在流动相中添加手性试剂。,图7.17 三点作用模型,27,7.8.2固定相,7.8.2固定相,图7.18 纤维素和支链淀粉的化学结构,28,2)环糊精Cyclo dextrins，CD,图7.19 环糊精的化学结构和它在水相中的假想构型,29,蛋白质键合相,合成聚合物,选择基键合相,配体交换固定相,7.8.3流动相,纤维素及其衍生物,环糊精,蛋白质键合相,合成聚合物,键合相,7.8.4手性流动相,普通硅胶键合相具有很好的色谱性能，但它不能直接用于旋光异构体的别离。如果把选择基添加到流动相中，那么可以使用这些键合相，并且有较宽的选择性。,30,7.9高效液相色谱的应用,高效液相色谱的出现与开展，使色谱的应用领域骤然扩大。就其分析的样品而言几乎无所不包，如：烃与芳烃，含氧、氮、卤素、硫、磷等各类有机化合物，有机金属与准金属化合物，无机阴、阳离子化合物，生物与生物大分子，高聚物，旋光异构体，等等。尤其在氨基酸、核酸、生物碱、肽、蛋白质、糖、类酯化合物、甾类、萜类、维生素等样品的分析方面是其他色谱或分析技术难以取代的。因此，高效液相色谱在石油、化工、环保、商检、食品、植物、生物、生物化学、临床医学、药物等领域的研究与生产过程有极重要的应用。,