一部分微生物利用

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,一部分微生物利用,一部分微生物利用,第1页,试验目标,1.,进行大肠杆菌,扩增,，利用,液体培养基,进行,细菌培养操作,2.,进行大肠杆菌,分离,，用,固体平面培养基,进行细菌,划线培养,3.,说明大肠杆菌培养,条件,和试验,原理,一部分微生物利用,第2页,一,.,基础知识,（一）,微生物,（二）,微生物培养基,（三）,无菌技术,二,.,微生物试验所需操作技术,三,.,大肠杆菌培养和分离试验,四,.,课题小结,一部分微生物利用,第3页,1.1,微生物,结构,都相当,简单,，个体多数十分,微小,，通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有甚至没有细胞结构。且体内普通不含有叶绿素，不能进行光合作用,五类,病 毒,细 菌,放线菌,真 菌,原生动物,病毒界,原核生物界,真菌界,原生生物界,1.1.1,微生物特点,1.1.2,微生物种类,1.1.3,细菌形态、结构和菌落,一部分微生物利用,第4页,1.1.3,细菌形态结构和菌落,图,1-1,常见三种细菌经典形态,A.,球菌,B.,杆菌,C.,弧菌,单细胞不分枝,原核,微生物，细菌细胞微小而透明，通常见,适当染料染色,后显微镜观察,1.1.3.1,细菌形态,1.1.3.2,细菌结构,基础结构：,细胞壁、细胞膜、细胞质，细胞质中有液泡、储存性颗粒、核质等,从属结构：,鞭毛、纤毛、荚膜、,芽孢,（抗逆,休眠体）,等,1.1.3.3,菌落,革兰氏染色：,阳性或阴性，细胞壁成份不一样,一部分微生物利用,第5页,1.1.3.3,菌落,单个或少数细菌,在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见，含有,一定形态结构子细胞群体,，叫做菌落,细菌菌落,特征因种而异,菌落是,判定菌种,主要依据,大肠杆菌,大肠菌群,一部分微生物利用,第6页,1.2,微生物培养基,培养基（培养液）是微生物,生存环境,和,营养物质,1.2.1,培养基分类（按物理形态分）,（,1,）液体培养基（液）,（,2,）半固体培养基,（,3,）固体培养基,添加,琼脂,量决定,1.2.2,培养基所含成份,（,1,）水,（,2,）无机盐,（,3,）碳源,（,4,）氮源,（,5,）生长因子,含碳,无机物或,有机物,，后者通常可作,能源,含氮,无机盐或,有机物,，用于合成氨基酸等,生长,必需,，而,本身不能合成,化合物,不一样微生物所需无机盐、碳源、氮源和生长因子,种类,不一样,培养基需要,调整,pH,、,渗透压,、控制,含氧量,等条件,细菌：,用蛋,白胨,和,酵母提取物,配制,霉菌：,用,无机物,或添加,蔗糖,豆芽汁,配制,细菌：,中性,偏碱,（,7.58.5,）,霉菌：,中性,偏酸,（,5.06.0,）,通常见,NaCl,调整,一部分微生物利用,第7页,1.3,无菌技术,1.3.1,取得纯净微生物培养物关键,预防外来杂菌入侵,1.3.2,无菌技术 四个方面,（,1,）对试验操作,空间,、操作者,衣着,和,手,进行清洁和,消毒,（,2,）将培养,器皿,、接种,用具,和,培养基,等器具进行,灭菌,（,3,）为防止周围微生物污染，试验,操作,应在,酒精灯火焰附近,旁进行,（,4,）,防止,已灭菌处理材料用具与周围物品相,接触,1.3.3,消毒,与,灭菌,一部分微生物利用,第8页,1.3.3.1,消毒,使用较为,温和,物理或化学方法仅杀死,物体表面,或,内部一个别,对人体有害微生物,普通不能杀死芽孢和孢子,常见消毒方法,常见于牛奶消毒,煮沸消毒法,巴氏消毒法,紫外线消毒,化学药剂消毒法,酒精、氯气、石碳酸、煤酚皂溶液等,一部分微生物利用,第9页,在,充分燃烧层,灼烧,1.3.3.2,灭菌,使用,强烈,理化原因,杀死物体内外全部微生物,，包含芽孢和孢子,常见灭菌方法和适用范围,灼烧灭菌,干热灭菌,高压蒸汽灭菌,微生物,接种工具,（接种环、接种针）或其它,金属用具,能,耐高温,需要,保持干燥,物品（玻璃器皿）,160,170,；,1,2h,100kPa 121 1530min,最常见,方式，通常见于,培养基,灭菌及,各种器具,灭菌,一部分微生物利用,第10页,2.,微生物试验所需操作技术,2.1,器具灭菌,2.2,培养液（基）配置、灭菌，放斜面和倒平板技术,2.3,细菌接种和纯化技术,棉花塞口,牛皮纸（或报纸）包口或包扎,6080,烘干,121,（,1Kg/cm,2,）灭菌,15min,不能用脱脂棉：,易吸水后造成污染,2.3.1,平板划线法,2.3.2,稀释涂布平板法,简便，,常见,效果好,一部分微生物利用,第11页,2.2,培养液配置、灭菌，放斜面和倒平板技术,2.2.1,配置,LB,（,Luria-Bertani,，溶菌肉汤）培养基,配方,蛋白胨：,0.5g,酵母提取物：,0.25g,NaCl,：,0.5g,水：,50mL,琼脂：,1g,（固体）,pH,：,7.4,7.6,配制过程,计算,、,称量,混合加热,溶化,NaOHHCl,调pH,（,76,）,分装,三角漏斗分,三角瓶,试管,棉塞或封口膜,加塞,包扎,通气,；,阻止,微生物进入,牛皮纸,灭菌,高压蒸汽,1Kg/cm2,，,121,，,15min,放斜面,倒平板,未凝固时,固体培养基,一部分微生物利用,第12页,分装、放斜面、倒平板,分装,培养基不能沾上,塞子,、,管,口和,管壁,易造成污染,固体分装,试管,，培养液不超出管高,1/5,便于放斜面,液体分装三角瓶，普通培养基高度为瓶高,1/4,左右,本试验中，将,50mL,液体,LB,培养基和,50mL,固体,LB,培养基分别装入,2,个,250mL,三角瓶中，加封口膜（或棉塞）,放斜面,固体培养基置于试管中灭菌后，斜靠在平放铅笔上，冷却,倒平板,培养接种用菌种,超净台和双手消毒,点燃酒精灯创造无菌环境,倒平板操作,一部分微生物利用,第13页,倒平板操作,倒平板操作中问题讨论,一部分微生物利用,第14页,倒平板操作中问题讨论,（,1,）培养基灭菌后，需要冷却到,50,左右时，才能用来倒平板。你用什么方法来预计培养基温度？,（,2,）为何需要使锥形瓶瓶口经过火焰？,（,3,）平板冷凝后，为何要将平板倒置？,（,4,）在倒平板过程中，假如不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为何？,能够用手触摸盛有培养基锥形瓶，感觉锥形瓶温度下降到刚才不烫手时，就能够进行倒平板了,经过灼烧灭菌，预防瓶口微生物污染培养基,平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后培养基表面湿度也比较大，将平板倒置，既能够使培养基表面水分更加好地挥发，又能够预防皿盖上水珠落入培养基，造成污染,空气中微生物可能在皿盖与皿底之间培养基上滋生，所以最好不要用这个平板培养微生物,一部分微生物利用,第15页,2.3.1,平板划线法,平板划线法操作中问题讨论,一部分微生物利用,第16页,平板划线法操作问题讨论,1,平板划线详细方法,连续划线法,交叉划线法,2,1,3,平板划线详细方法,（,1,）为何在操作第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，依然需要灼烧接种环吗？为何？,每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束接种环上残留菌种，使下一次划线菌种直接起源于上次划线末端，使每次划线时菌种数目逐步降低，方便得到菌落。,结束后要灼烧接种环以及时杀死残留菌种，防止污染环境和感染操作者,单菌落,1,2,3,4,6070,一部分微生物利用,第17页,平板划线法操作问题讨论,2,（,2,）在灼烧接种环之后，为何要等其冷却后再进行划线？,（,3,）在作第二次以及其后划线操作时，为何总是从上一次划线末端开始划线？,以免接种环温度太高，杀死菌种,线条末端细菌数目较少，这么操作能使细菌数目伴随划线次数增加而逐步降低，最终得到由单个细菌繁殖而来菌落,（,4,）为何平板划线时不能划破培养基表面？,一是划破后会造成划线不均匀，难以到达分离单菌落目标,二是存留在划破处单个细胞无法形成规矩菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状菌落,一部分微生物利用,第18页,2.3.2,稀释涂布平板法,操作方法,梯度稀释,涂布分离,问题：,涂布平板全部操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释无菌操作要求，想一想，第,2,步应怎样进行无菌操作？,一部分微生物利用,第19页,3.,大肠杆菌培养和分离试验,3.1,设备及用具,灭菌锅或高压锅、,250ml,三角瓶、封口膜和橡皮圈、直径,90mm,培养皿、接种环和玻璃三角刮刀、恒温培养箱、摇床、酒精灯和超净台、一次性塑料手套、装有酒精棉球广口瓶、镊子、有棉塞试管（,15mm120mm,）,5,支,3.2,试验材料,（,1,）,50mlLB,液体培养基：蛋白胨,0.5g,、酵母提取物,0.25g,、,NaCl 0.5g,、加水,50ml,（,2,）大肠杆菌菌种斜面,（,3,）空白斜面,3.3,试验过程,3.4,课题结果评价,革兰氏阴性,，,兼性厌氧,菌,一部分微生物利用,第20页,3.3,试验过程,1.,配制,LB,培养基,2.,灭菌,LB,液体,培养基,LB,固体,培养基,各,50mL,，三角瓶,3.,倒平板,固体,冷却成平板培养基,4,个培养皿,液体,4.,接种扩充培养,1.,培养基,冷却,2.,接种环烧灼,3.,接种环在菌种斜面培养基上,冷却,4.,挑取菌种,接种,到液体培养基中,5.37,摇床,震荡培养,12h,培养大肠杆菌菌种,5.,平板划线分离,37,培养,24,h,4,保留,6.,单菌落接种,6.,菌种培养、保留,1.,挑取,单菌落,菌种,2.,斜面,连续划线,酒精灯旁操作,细菌培养分离视频,一部分微生物利用,第21页,3.4,课题结果评价,培养基制作是否合格,接种操作是否符合无菌要求,是否进行了及时细致观察与统计,假如未接种培养基在恒温箱中保温,1,2 d,后无菌落生长，说明培养基制备是成功，不然需要重新制备,如培养基上生长菌落颜色、形状、大小基础一致，并符合大肠杆菌菌落特点，则说明接种操作是符合要求；假如培养基上出现了其它菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未到达要求，需要分析原因，再次练习,培养,12 h,与,24 h,后大肠杆菌菌落大小会有显著不一样，及时观察统计同学会发觉这一点，并能观察到其它一些细微改变。这一步要求主要是培养学生良好科学态度与习惯,一部分微生物利用,第22页,